干细胞和干细胞治疗.ppt

干细胞和干细胞,治疗,.ppt,干细胞,stemcell,未分化细胞,自我更新,(self-renew),无限增殖,体外长期培养,多向分化潜能,(multipotential),2,3,干细胞的类型：,胚胎干细胞,embryonicstemcells,胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，,有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外,三个胚层的各类细胞。,成体干细胞,adultstemcells,成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括,成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为,组织干细胞,。如神经干细胞、,造血干细胞,、,骨髓间,质干细胞、上皮干细胞,、肝干细胞、胰腺干细胞等。,4,胚胎干细胞,embryonicstemcells,（,ES,细胞）,5,胚胎早期发生：囊胚形成,（囊胚内细胞团）,6,排卵、早期胚胎发生,(,囊胚形成,),7,胚胎干细胞的分离和建系,将囊胚内细胞团的细胞通过体外培养产生,未分化的细胞克隆，建立胚胎干细胞系,1981,年,Evans,和,Martin,首次成功分离和建立,小鼠胚胎干细胞系,1998,年,Thomson,等首次成功分离和建立人胚,胎干细胞系,胚胎干细胞可在体外,诱导分化形成各种成体细胞,8,胚胎干细胞体外诱导分化,外源诱导因子诱导,ES,细胞分化,诱导因子：维甲酸,(RA),、骨形成蛋白,BMPs),、成纤维,细胞生长因子,(FGFs),等,转基因诱导,ES,细胞分化,用转基因技术使某种促分化基因在,ES,细胞中表达、调,节其分化,与其他细胞共培养诱导,ES,细胞分化,创造细胞分化的微环境,9,胚胎干细胞体外诱导分化,10,成体干细胞,adultstemcells,又称,组织干细胞,tissuestemcells,11,成体干细胞的概念,成体干细胞又称组织干细胞，传统的观念认为,它们是存在于成体组织的未分化细胞，现在认,为也包括未成年动物的组织干细胞，它们具有,不断增殖和自我更新能力、又具有多向分化潜,能。,如造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、,脂肪干细胞、上皮干细胞、胰腺干细胞、肝干,细胞等,12,成体干细胞的功能,自然条件下成体干细胞倾向于分化成所,在组织的细胞，参与组织更新和损伤修,复；,外界条件诱导下成体干细胞可横向分化,成其他组织的细胞，参与这些组织的损,伤修复。,13,造血干细胞的分化,14,表皮干细胞的分化,15,干细胞应用前景,细胞治疗,组织工程,药物筛选,发育研究,基因功能研究,16,细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接,移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾,病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是,干细胞临床应用的重要研究方向。,胚胎干细胞和成体干细胞都能用于细胞治疗，但目,前只有少数成体干细胞在细胞治疗上己开始取得临床,疗效，大多数的干细胞治疗还在实验阶段。,细胞治疗,celltherapy,17,血液病的细胞治疗,如白血病的细胞治疗,造血干细胞移植：,自体移植（脐带血造血干细胞）,无排斥反应,同系移植（同卵孪生之间骨髓,造血干细胞）,一般无排斥反应,同种移植（人与人之间骨髓造血干细胞）,有排斥反应（供、受者组织相容性抗原不同）,需组织配型、选择供者（骨髓库）；,抑制受者的免疫应答、诱导免疫耐受。,18,神经系统疾病的细胞治疗,如帕金森氏病细胞治疗,胚胎干细胞细胞移植,神经干细胞细胞移植,1,、干细胞直接移植,2,、诱导分化成相应神经细胞（多巴胺能神经元）后进,行细胞移植,19,心肌疾病的细胞治疗,如心肌梗塞的细胞治疗,胚胎干细胞,诱导分化成心肌细胞,细胞移植,成体干细胞,（骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、心肌干细胞等）,诱导分化成心肌细胞,细胞移植,20,干细胞治疗中的难点,异体移植的免疫排斥反应,解决途径：自身体细胞核移植（治疗性克隆）,干细胞基因改造,采用自身干细胞,成瘤性的危险,胚胎干细胞植入动物体内会形成畸胎瘤，如何防止干细胞移植后,可能因分化不彻底形成肿瘤，是必须解决的问题。,解决途径：完善定向诱导分化方法,改进筛选纯化技术,21,治疗性克隆,（体细胞核移植）,22,我们实验室的一项工作,胰腺干细胞的,细胞分化,与,I,型糖尿病的干细胞治疗,23,I,型糖尿病的治疗,外源胰岛素治疗,胰腺或胰岛移植,干细胞治疗：,胚胎干细胞,诱导分化成,细胞,细胞移植,基因导入使其表达胰岛素,细胞移植,胰腺干细胞,诱导分化成,细胞,细胞移植,24,胰腺干细胞的标志,1990,年，,Lendahl,等人发现神经干细胞中存在一种新的中,间丝蛋白,巢蛋白（,nestin,），现在,nestin,已是公认的神经,干细胞标志之一。,2000,年，,Hunziker,和,Stein,发现胰腺导管和胰岛中也存,在,nestin,阳性细胞。,2001,年，,Zulewski,等人从胰腺中分离到,nestin,阳性细胞，,将其命名为,NIPs,（,nestin-positiveislet-derivedprogenitor,cells,），并发现具有多向分化潜能,(multipotential),，在体,外可自发形成类胰岛细胞团（,islet-likecellclusters,ICCs,）,.,因此，人们相信,nestin,可能也是胰腺干细胞的标志。但,是，,NIPs,是否确实是胰腺干细胞，能否用于细胞治疗必须进,一步证实。,2001,年起，我们为此做了一点实验。,25,我们的实验,:,人胎胰腺,nestin,阳性细胞的分离、体外培养和,生物学特性检测（目的是确认,NIPs,是胰腺干细,胞）；,体外诱导分化,NIPs,形成能产生胰岛素的细胞；,类胰岛细胞团,(,ICCs,),异种体内移植,糖尿病的,干细胞治疗实验研究。,26,第一个实验：,人胎胰腺,nestin,阳性细胞,(NIPs),的分离、,体外培养和生物学特性检测,27,人胎胰腺的,nestin,阳性细胞的分布,免疫组化技术显示,nestin,阳性细胞,nestin,阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团,28,分离胎胰导管和细胞团,在,EHAA,培养液（含,2%FBS,）中进行原代培养,在,EHAA,培养液中的,胎胰导管和细胞团,培养,48,小时后细胞贴壁,并开始铺开,贴壁细胞鉴别：是否存在,NIPs,免疫荧光染色检测,CK19,、,胰岛素、,nestin,阳性细胞,CK19,呈,CK19,阳性的胰腺,上皮细胞（细胞较大,),insulin,呈胰岛素阳性的,nestin,nestin,阳性细胞,(NIPs),（梭形）,细胞（细胞较小）,NIPs,的筛选培养和体外扩增,贴壁细胞在无糖低血清条件培养液中筛选培养,NIPs,4,周后大部分细胞死亡、仅存少量梭形细胞,(NIPs),DMEM/F12,培养液中加,生长因子,bFGF,促进梭形,细胞,(NIPs),体外扩增。,亚克隆纯化、传代培养,图为由单个梭形细胞,(NIPs),的扫描电镜照片,梭形细胞,(NIPs),可在体外,长期传代培养,31,NIPs,的干细胞表型确定,免疫组化在蛋白质水平检测,nestin,表达,半定量,RT-PCR,在,mRNA,水平检测,nestin,和干细胞标志基因,ABCG2,表达,nestin,semiquantitativeRT-PCR,筛选培养的梭形,细胞,(NIPs),集落,免疫组化显示筛选培养,的细胞均呈,nestin,阳性,反应,半定量,RT-PCR,显示筛选,培养的细胞表达,nestin,和,ABCG2,NIPs,能自发形成类胰岛细胞团,(ICCs).,NIPs,在,DMEM,培养液,(,含,11.1mM,葡萄糖、,10?S,和,20ng/mlbFGF),中培养,nestin,NIPs,达到,80%,铺满时可,自发形成小的,ICCs,免疫组化显示这种,ICCs,主要由,nestin,阳性细胞,组成,RT-PCRanalysis,RT-PCR,显示这种,ICCs,高水平表达,ABCG2,和,nestin,NIPs,具有多向分化潜能,培养液中撤去,bFGF,使,NIPs,分化,glucagon,RT-PCRanalysis,培养,2,周后形成的,ICCs,大而致密,免疫组化显示此时,ICCs,表达,glucagon,RT-PCR,显示此时,ICCs,有多种谱系基因的表达，,具有向胰腺多种类型细,胞分化的能力,这一实验结果表明：,NIPs,表达干细胞标志,ABCG2,，,能长期培养，有多向分化潜能，在细胞形态、生长,行为和分化潜能上具有干细胞特征，因此可以认为,是胰腺干细胞,.,ABCG2,是,ABC,运输蛋白（,ATPbindingcassette,transporter,）家族成员，其功能是将细胞内的促分化因子,泵出细胞以维持干细胞的未分化状态，现在认为它是干细胞,状态决定因子。已有报道,ES,细胞、造血干细胞、骨髓间质,干细胞、神经干细胞、肌干细胞等均表达,ABCG2,。,35,第二个实验：,体外诱导分化,NIPs,形成产生胰岛素的,细胞；,36,诱导,NIPs,形成,细胞,NIPs,在含高浓度葡萄糖,(16.5mM),和多种诱导因子,(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide),的,DMEM,培养液中培养,insulin,免疫组化显示,ICCs,中有,胰岛素阳性的,细胞,RT-PCRanalysis,培养,10,天后形成很多,大而致密的,ICCs,此时,ICCs,表达,细,胞的标志，但仍少,量表达,NIPs,和其他,细胞的标志,ICCs,的细胞内胰岛素含量,磁性分离酶联免疫方法测定,ICCs,的细胞内胰岛素含量,细胞诱导分化后的,ICCs(ICC3),细胞内胰岛素含量明显高于多向,分化的,ICCs(ICC2),，但仍低于胎胰胰岛,(islet),的胰岛素含量,38,葡萄糖或促分泌素对,ICCs,分泌胰岛素的作用,磁性分离酶联免疫方法测定,ICCs,分泌胰岛素量,T:tolbutamide,C:carbachol,G:GLP-1,insulinsecretioninresponsetoglucose,在不同浓度葡萄糖刺激下,ICCs,中,细胞胰岛素分泌量,与萄葡糖浓度呈正相关,insulinsecretioninresponsetosecretagogues,各种分泌刺激因子刺激,ICCs,释,放胰岛素。,T-,甲苯磺丁脲,C-,碳酰胆碱,G-,胰高血糖素样肽,这一实验结果表明：,NIPs,具有多向分,化潜能，在一定条件下能定向分化为功,能性,细胞,.,40,第三个实验：,类胰岛细胞团,(ICCs),异种体内移植,糖尿病的干细胞治疗实验研究。,（将定向诱导人,NIPs,形成含,细胞的,ICCs,移植到严,重联合免疫缺失小鼠体内）,41,糖尿病小鼠模型制作,(,腹腔注射链脲佐菌素,STZ),肾膜下移植,ICCs,治疗糖尿病,NOD-Scid,小鼠,30,血糖水平,(mmol/l),20,10,腹腔内注射,streptozotocin,高血糖,肾膜下移植含,类,细胞的,ICCs,注射,STZ,前,注射,STZ,后,移植,ICCS,后,注射后,3,天小鼠出现,移植,4,天后小鼠,稳定的高血糖症,血糖明显下降,42,糖尿病小鼠肾膜下移植,ICCs,后形态观察,免疫组化方法检测含胰岛素细胞,左肾移植部位,移植后,40,天，移植部位血管增生,insulin,免疫组化显示移植部位的胰岛,素阳性细胞,糖尿病小鼠肾膜下移植,ICCs,后血糖水平测量,移植,ICCs,后血糖明显下降,(P0.05),STZ,处理,3,天后所有,NOD-Scid,小鼠出现高血糖，移植,4,天后小,鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至,40,天，未移植的小鼠,保持高血糖。,正常,NOD-Scid,小鼠肾膜下移植,ICCs,移植部位的组织切片,H.E,染色,移植,40,天后，移植物在移植部位发生异常增殖并侵入肾实质，形成导,管、细胞团、血管等结构。,正常,NOD-Scid,小鼠肾膜下移植,ICCs,移植部位透射电镜观察,肾膜下区域,侵入肾实质区域,renaltubule,*,*,可见导管和细胞团,肾小管附近可见导管和血管,这一实验结果表明：,移植的,ICCs,可在糖尿病小,鼠体内特殊环境下进一步分化生成更多类,细胞，,合成和分泌适量胰岛素，能显著降低血糖水平。,但在正常小鼠中能多向分化、异常增殖。,47,讨,论,1,糖尿病小鼠体内微环境对,ICCs,的定向诱导分化作用，,可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。,在体内诱导较体外彻底，,细胞比例高于体外，能显著降低糖,尿病小鼠血糖水平，说明糖尿病小鼠体内特殊环境有利于,ICCs,向,细胞分化。,（,1,）糖尿病小鼠的血清可作为胰腺干细胞体外培养的诱导因,子，其中高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽,1(GLP-1),起主要作用。,（,2,）移植部位血管增生，为生长和分化提供营养並有利于胰,岛素及时进入血液循环。,48,讨,论,2,干细胞治疗的安全性问题不容忽视。,（,1,）干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。,ICCs,在正常小鼠体,内的异常增殖，反映,ICCs,中存在较多未分化细胞，如何控制诱导,分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗,研究碰到的棘手问题。,（,2,）干细胞移植会不会致癌仍是有待解决的问题。肿瘤干细,胞,(cancerstemcell),理论认为干细胞与癌细胞在增殖调节机,制方面有着相同的信号途径和调控因子，癌症可能起源于异常活,化的干细胞。,ABCG2,是一种干细胞标志分子，同时又是多种癌,细胞的抗药基因，可能是联系干细胞和癌细胞的分子基础之一。,49,讨,论,3