（海洋生物学专业论文）大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究.pdf

大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 a c t h a c a r c g n r h i i c o m t d a d o m 17 a ，2 0 d h p e 2 e u s a e r f o m f s h g a b a g r 匝 g n r h g s i g t h i g t h i i g w 肿g 3 肛h s d 1 1 k t l h i 职h m e a n 士s e m s h n s b 中英文缩略词表 促肾上腺皮质激素( a d r e n o c o r t i c o t r o p h i ch o r m o n e ) 前联合 雄激素受体( a n d r o g e nr e c e p t o r ) 鸡促性腺激素释放激素一i i ( c h i c k e ng n r h i i ) 儿茶酚氧甲基转移酶 多巴胺( d o p a m i n e ) 地欧酮( d o m p e r i d o n e ) 1 7 a ，2 c l 俨双羟孕酮( 1 7 a ，2 0 p - d i h y d r o x y - 4 - p r e g n e n 一3 - o n e ) 17 # - 雌二醇( 17 p - e s t r a d i 0 1 ) 酶联免疫吸附测定( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 雌激素受体( e s t r o g e nr e c e p t o r ) 卵母细胞最后成熟( f i n a lo o c y t em a t u r a t i o n ) 促滤泡激素( f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ) y 一氨基丁酸 促性腺激素释放激素的抑制因素 促性腺激素释放激素( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e ) 性腺成熟系数( g o n a d o s o m a t i ci n d e x ) 促性腺激素i ( g o n a d o t r o p i n - i ) 促性腺激素一i i ( g o n a d o t r o p i n - i i ) 性腺重( g o n a d a lw e i g h t ) 下丘脑一垂体一性腺轴( h y p o t h a l a m u s p i t u i t a r y - g o n a d a la x i s ) 3 伊羟类固醇脱氢酶 1 1 一酮基睾酮( 11 - k e t o t e s t o s t e r o n e ) 促黄体激素( l u t e i n i z i n gh o r m o n e ) 促黄体素释放激素( l u t e i n i z i n gh o r n i o n e - r e l e a s i n gh o r m o n e ) 平均值士标准误( m e a n 士s t a n d a r de r r o r ) 黑色素细胞刺激素( m e l a n o c y t es t i m u l a t i n gh o r m o n e ) 非特异性结合率( n o n - s p e c i f i cb i n d i n g ) 7 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 n l t n p o n p p o t e c 1 7 a - o h p p i p r l p r p p d i 心d s b g n r h s ( 孙r h s p s s s a b c s e x 般 t s h t 外侧结节核 视前核 视前围脑室核 中脑盖 1 7 a - 羟基孕酮( 1 珏o 皿) 垂体中间部( p a r si n t e r m e d i a ) 催乳激素( p r o l a c t i n ) 孕激素受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r ) 垂体中外侧部( p r o x i m a lp a n sd i s t a l i s ) 垂体前外侧部( r o s t r a lp a n sd i s t a l i s ) 鲷鱼促性腺激素释放激素( s e ab r e a mc m r i - d 鲑鱼促性腺激素释放激素( s a l m o ng n r h ) s p s s 统计软件 卵白素一生物素一过氧化物酶复合物( s t r e p t a v i d i n - b i o t i nc o m p l e x ) 性激素受体( s e xh o r m o n er e c e p t o r ) 促甲状腺激素( t h y r o i d - s t i m u l a t i n gh o r m o n e ) 睾酮( t e s t o s t e r o n e ) 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：王乏r 啊年6 具妨 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 2 不保密v ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名： 王盲t 日期：名椤年多月r 日 导师签名：刁睦舯期：7 勿叼年 6 月r 日 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 摘要 本文以野生大弹涂鱼为研究对象，运用多种组织学染色方法、免疫细胞化学 方法和酶联免疫分析技术，对大弹涂鱼脑垂体组织结构、脑垂体促性腺激素水平 的季节变化以及生殖季节潮汐对大弹涂鱼产卵行为和血浆性类固醇激素含量的 影响进行深入研究和分析，所得结果与结论如下i l 大弹涂鱼脑垂体的组织学和免疫细胞化学研究 大弹涂鱼脑垂体为扁平型，由神经垂体和腺垂体组成。腺垂体又分为r p d 、 p p d 和p i 三个部分。实验采用a f 、h a 、h e 和m a l l o r y 染色法，结合免疫组织 化学方法，对大弹涂鱼脑垂体的7 种内分泌细胞进行鉴定和定位。r p d 主要为 p r l 、l h 和a c t h 细胞：p p d 主要有g h 、f s h 和t s h 细胞；p i 主要有m s h 细胞和a c t h 细胞。 2 脑垂体f s h 和l i t 水平的季节变化 年生殖周期中，大弹涂鱼雌鱼脑垂体f s h 和l h 细胞季节变化如下：成熟产 卵期间，f s h 和l h 免疫阳性反应均很强，f s h 细胞和l h 细胞数量都增多。产后 退化期，f s h 细胞数量显著减少，仅在p p d 腹缘检测到个别f s h 细胞，且呈弱免 疫阳性反应：l h 细胞数量也有所减少，但仍检测到较多的l h 细胞，且呈较强的 免疫阳性反应。卵巢发育早期( 即卵母细胞小生长发育期) ，f s h 细胞数量及阳 性反应强度较退化期均有明显增加；而l h 细胞数量则继续减少，阳性反应强度 也进一步降低。卵巢发育后期( 即卵母细胞大生长期，卵黄积累阶段) ，f s h 细 胞数量进一步增加，阳性反应强烈；相反，l h 细胞则未被检测到。 3 生殖季节潮汐对大弹涂鱼g s 和血浆性类周醇激素含量的潮汐变化 生殖季节，大弹涂鱼g s i 与r i p e 变化表现出明显的半月周期性。雌鱼血 清e 2 、1 7 o i - i p 和t 水平以及雄鱼血清t 和1 1 k t 水平的变化也表现出明显 的半月周期性。在2 个半月周期内( 2 0 0 6 年5 月3 1 日至6 月3 0 日) ，雌鱼血清 e 2 、1 7 a - o h p 和t 水平的二个峰值分别出现在上弦月过后3 天( 即第一个小潮 后3 天和下弦月( 即第二个小潮后) 。雄鱼血清1 1 k t 和t 水平的二个峰值出现 的时间与雌鱼相同。我们的研究发现，当雌、雄鱼性腺处于相同的发育期，且雌 9 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 鱼g s i 之间差异不显著( g s i 为5 9 7 6 8 6 ) ，雄鱼g s i 之间差异也不显著( g s i 为0 2 5 5 0 2 8 8 ) 时，雌、雄鱼血清性类固醇水平仍表现出明显的半月周期性。 这表明，大弹涂鱼血清性类固醇激素水平的变化主要受外界环境因子，特别是潮 汐变化的影响。 关键词：大弹涂鱼；促性腺激素；性类固醇激素 1 0 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h es t r u c t u r eo fp i t u i t a r y , s e a s o n a ll e v e l so fg o n a d o t r o p i n sa n dp l a s m a s t e r o i dh o r m o n e sa sw e l la st h ee f f e c to fl u n a rp e r i o d i c i t yo nr e p r o d u c t i o ni nt h ef e r a l m u d s k i p p e rw e r es t u d i e du s i n gt h e m e t h o d so fh i s t o l o g i c a l s t a i n i n gt e c h n i q u e s ， i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e h o d sa n de l i s a t h em a i nr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sa r ea s f o l l o w s ： 1 h i s t o l o g i c a la n di m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d i e s o i le n d o c r i n ec e l l si nt h e p i t u i t a r yo ft h em u d s k i p p e r t h ep i t u i t a r yo ft h em u d s k i p p e ri sf i a ti ns h a p e ，c o n s i s t e do fn e u r o h y p o p h y s i sa n d a d n o h y p o p h y s i s t h ea d e n o h y p o p h y s i sc a nb ed i v i d e di n t ot h et h r e ep a r t sr p d ，p p d a n dp i u s i n ga f ，h a ，h e ，m a l l o r ys t a i n i n gt e c h n i q u e sa n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e h o d s ，t h e7t y p e so fe n d o c r i n ec e l l si nt h ep i t u i t a r yw e r eo b s e r v e da n di d e n t i f i e di n d e t a i l s p r l ，a c t ha n dl hc e l l sa r em a i n l yf o n di nr p d ；g h ，f s ha n dt s h c e l l si n p p d ；a n dm s ha i l da c t h ，i i lp i ，r e s p e c t i v e l y 2 s e a s o n a lc h a n g e so ff s ha n dl hi nt h ep i t u i t a r yo ft h em u d s k i p p e r s e a s o n a lv a r i a t i o n so fi m m u n o r e a c t i v ef s ha n dl hc e l l so ft h ef e m a l em u d s k i p p e r p i t u i t a r yd u r i n ga na n n u a lr e p r o d u c t i v ec y c l ea r ea sf o l l o w s ：b o t ht h ef s ha n d t h el h c e l l sw e r ea b u n d a n ta n ds t r o n g l yp o s i t i v ed u r i n gt h es p a w n i n gp e r i o d ( m i d d l ej u n e ) a f t e rs p a w n i n g ( 1 a t es e p t e m b e r ) ，t h ef s hc e l l sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y o n l yas m a l l n u m b e ro ff s hc e l l sw e r eo b s e r v e da tt h ee d g eo fp p da n ds h o w e dw e a k l yp o s i t i v e t h en u m b e ro ft h el hc e l l sa l s od e c r e a s e da l t h o u g haf e wn u m b e ro ft h ec e l l sw e r e s t i l lp r e s e n ta n ds h o w e dp o s i t i v e t h en u m b e ro ft h ef s hc e l l si n c r e a s e da g a i na tt h e e a r l ys t a g eo fg o n a d a ld e v e l o p m e n t ( 1 a t ed e c e m b e r ) ，w h e r e a st h en u m b e ro ft h el h c e l l sd e c r e a s e dc o n t i n u o u s l y t h ef s hc e l l sb e c a m ea b u n d a n ta tt h el a t es t a g eo f o v a r i a nd e v e l o p m e n t ( m i d d l em a r c h ) i nc o n t r a s t ，f e wl hc e l l sw e r ef o u n da tt h i s s t a g e 3 v a r i a t i o n so fg s ia n dp l a s m as t e r o i dh o r m o n e sw i t hs e m i l u n a rp e r i o d i c i t yi n t h em u d s k i p p e r l l 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 c h a n g e si ns p a w n i n gr e a d i n e s s ( r i p e ) a n dg s io fm u d s k i p p e rw e r er e l a t e dt o s e m i l u n a rp e r i o d i c i t y v a r i a t i o n so fp l a s m as t e r o i dh o r m o n e s ，e 2 ，17 0 t - o h pa n dti n f e m a l e sa n dta n d ll k ti nm a l e s ，w i t hs e m i l u n a rp e r i o d i c i t yw e r ei n v e s t i g a t e di nb p e c t i n i r o s t r i sd u r i n gt h es p a w n i n gs e a s o n f e m a l e sw i t ho o c y t e sa tv i t e l l o g e n i cs t a g e ( g s i5 9 7 - 6 8 6 ) a n dm a t u r em a l e sw i t hg s io f0 2 5 5 0 2 8 8 w e r ec o l l e c t e da t i n t e r v a l so f3 - 4d a y sw i t h i nt h et w oc o m p l e t es e m i l u n a rc y c l e sf r o mm a y31t oj u n e 3 0 ，2 0 0 6 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tv a r i a t i o no fp l a s m as t e r o i dh o r m o n e ss y n c h r o n i z e d o b v i o u s l yw i t hs e m i l u n a rp e r i o d i c i t yi nb o t hf e m a l e sa n dm a l e s e a c hs t e r o i d h o r m o n el e v e l se x h i b i t e dt w oc y c l e sw i t hap e a ke a c h i nf e m a l e s ，t h ef i r s tp e a k so f p l a s m ae 2 ，17 a - o h pa n dtl e v e l sw e r eo b s e r v e d3d a y sa f t e rt h ef i r s tl u n a rq u a r t e r , a n dt h es e c o n do n e s ，4d a y sa f t e rt h el a s tl u n a rq u a r t e r , r e s p e c t i v e l y i nm a l e s ，t h ef i r s t p e a k so fp l a s m at a n d1i - k tl e v e l so c c u r r e d3d a y sa l t e rt h ef i r s tl u n a rq u a r t e r , a n d t h es e c o n do n e s ，a tt h el a s tl u n a rq u a r t e r , r e s p e c t i v e l y i tw a sf o u n di nt h ep r e s e n t s t u d yt h a tc h a n g e so fp l a s m as t e r o i dh o r m o n e sa l s os y n c h r o n i z ew i t hs e m i l u n a r p e r i o d i c i t y , a l t h o u g ht h ef i s ha r ea tt h es a m es t a g e so fg o n a d a ld e v e l o p m e n t t h i s f i n d i n gs u g g e s t st h a tv a r i a t i o no fp l a s m as t e r o i dh o r m o n e si sb a s i c a l l yr e g u l a t e db y b i o l o g i c a lr h y t h m s ( z e i t g e b e r s ) a n dt i d a lm o v e m e n ti st h em a j o re n v i r o n m e n t a lf a c t o r i ns t i m u l a t i n gs t e r o i dh o r m o n a lp r o d u c t i o ni nb p e c t i n i r o s t r i s k e yw o r d s ：b o l e o p h t h a l m u sp e c t i n i r o s t r i s ；g o n a d o t r o p i n ；p l a s m as t e r o i dh o r m o n e s 1 2 人掸涂鱼生殖节律的内分泌研究 _ 上一- j o 刖吾 鱼类生殖活动受外部环境因素和神经内分泌的双重调节【l 】。在自然状态下， 鱼类能够适应环境的周期性变化，调整它们的生理机能。许多生殖活动的内在节 律性就是对环境周期性变化的反应。环境因子的变化是鱼类周期性生殖活动的启 动因子【2 】。鱼类的感觉器官把这些环境因子变化的信息传送到中枢神经系统，使 下丘脑分泌促性腺激素释放激素( g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n gh o r m o n e ，g n i m ) ，促进脑 垂体促性腺激素( g o n a d o t r o p i ch o r m o n e ，g t h ) 的分泌，g t h 刺激性腺产生性类固醇 激素，从而促使性腺发育成熟、排出精子和卵子。这种下丘脑一脑垂体性腺的 调控轴就是生殖内分泌生理的基本内容。 大弹涂鱼( b o l e o p h t h a l m u sp e c t i n i r o s t r i s ，l i n n a e u s ) 隶属于鲈形目 ( p e r c i f o r m e s ) ，缎虎鱼亚目( g o b i o i d e i ) ，弹涂鱼科( p e r r i o p h t h a l m i d a e ) ，大弹 涂鱼属( b o l e o p h t h a l m u s ) ，为暖水性广温广盐的两栖鱼类，生活于海洋潮间带滩 涂，营穴居生活，主要分布于中国、日本和朝鲜。我国主要产地为江苏、浙江、 福建、广东、广西和台湾沿海滩涂。大弹涂鱼体形虽小，但肉味鲜美细嫩，营养 丰富，含有常见的1 6 种氨基酸，其中8 种为人体必需氨基酸【3 】，具有滋补强身 的功效，深受浙江、福建、广东、广西、台湾、海南、江苏等省沿海群众的喜爱 【4 】。我国台湾省于2 0 世纪6 0 年代开始养殖大弹涂鱼，7 卜8 0 年代养殖面积发展 到数千亩；我国大陆东南沿海于2 0 世纪8 0 年代初开始发展大弹涂鱼养殖，9 0 年代后养殖面积迅速扩大。迄今为止，福建省大弹涂鱼养殖面积已发展到1 3 0 0 0 公顷。但是，与广大渔农迫切需要养殖大弹涂鱼相矛盾的是种苗的严重缺乏。迄 今为止，我省养殖的大弹涂鱼种苗绝大多数来自天然海区滩涂，大部分是广东和 浙江沿海的野生苗，少数从我省沿海捕获。由于自然海区滩涂面积不断减少和连 续多年的采捕，自然海区野生苗数量逐年减少，种苗价格逐年上涨，供求矛盾突 出，养殖成本增加，严重阻碍了大弹涂鱼养殖的发展。台湾省廖一久【5 】曾于1 9 7 2 开展大弹涂鱼人工繁殖和育苗工作，但由于该种鱼类的特殊生态习性，人工育苗 的难度很大，至1 9 8 0 年仅培育出2 尾鱼苗。国外仅有日本于1 9 8 8 - - 1 9 9 2 培育出 5 万尾大弹涂鱼种苗用于增殖放流。我们自1 9 8 5 年获国家基金“大弹涂鱼资源 增殖基础研究资助以来，一直进行大弹涂鱼繁殖生物学研究，先后进行了性腺 发育、早期发育、摄食习性、生理生态以及年龄生长和生殖力等方面的工作，于 人弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 1 9 8 6 - - 1 9 9 0 在水泥池中进行种苗培育初步试验，获得鱼苗2 万尾；1 9 9 8 - - 2 0 0 0 年又进行种苗培育中间试验，用人工授精方法共培育出鱼苗1 0 多万尾。但是， 目前大弹涂鱼的受精卵主要是通过人工授精获取，自然产卵技术尚未突破，因此 难以获得大批量的鱼苗以满足养殖要求【6 1 。要实现种苗的批量生产，必须能够诱 导大弹涂鱼成熟和自然交配产卵，而要达到这一目的，开展大弹涂鱼生殖生理学 研究很有必要。 大弹涂鱼为一次性产卵鱼类，生殖季节为每年的5 q 月，其中5 7 月为生 殖高峰期。生殖季节内海区大弹涂鱼亲鱼产卵与潮汐有关，每个潮汐周期( 1 5 天) 产一批次卵，一个月产两批次卵，一般在小潮后大潮前开始产卵，每次产卵 持续6 天左右。 为了阐明大弹涂鱼的生殖内分泌调控机制，本文以野生大弹涂鱼为对象，侧 重研究了脑垂体组织学、脑垂体促性腺激素分泌细胞的免疫组织化学定位、脑垂 体促性腺激素水平的季节变化，以及生殖季节潮汐对大弹涂鱼产卵行为和血浆性 类固醇激素含量的影响。该项研究成果不仅在理论上丰富了硬骨鱼类内分泌生理 学内容，在实践上也为大弹涂鱼人工繁殖技术的建立和苗种培育提供科学依据。 1 4 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 第一章文献综述 鱼类生殖活动受外部环境因素和神经内分泌的双重调节1 1 1 。在自然状态下， 鱼类能够适应环境的周期性变化，调整它们的生理机能。许多生殖活动的内在节 律性就是对环境周期性变化的反应。环境因子的变化是鱼类周期性生殖活动的启 动因子【2 】，而这些周期性生殖活动则是通过神经内分泌作用完成的【7 1 。鱼类的感 觉器官把这些环境因子变化的信息传送到中枢神经系统，使下丘脑分泌促性腺激 素释放激素( g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n gh o r m o n e ，g n r h ) ，促进脑垂体促性腺激素 ( g o n a d o t r o p ich o r m o n e ，g t h ) 的分泌，g t h 刺激性腺产生性类固醇激素，从而 促使性腺发育成熟、排出精子和卵子。这种下丘脑一垂体性腺的调控轴就是繁 殖内分泌生理的基本内容。 1 神经内分泌因子对鱼类繁殖的调控 1 1 促性腺激素释放激素( g n r h ) 的研究进展 g n r h 是由脊椎动物下丘脑分泌的十肽神经激素 引，以神经分泌方式从神经末 梢释出，到达垂体发挥促进g t h 释放的作用。自1 9 7 1 年，美国科学家s c h a l l y 领导的研究小组从猪的下丘脑分离纯化得到哺乳动物g n r h ( m a m m a l i a ng n r h ， m g n r h ) ，并鉴定分析出其结构以来，到目前为止，己经从原索和脊椎动物等物种 神经组织中发现了2 4 种不同类型的g n r h 存在以及一种功能地位尚不清楚的 t u n i c a t e - xg n r h 9 。2 3 1 。它们组成了一个神经肽家族。研究表明，在下丘脑以外 的许多器官中也存在g n r h ，例如神经系统、内分泌、生殖、消化和免疫组织中， 而且不同器官中的g n r h 具有不同的功能【2 5 1 。 第一种被鉴定的鱼类g n r h 是鲑鱼g n r h ( s g n r h ) f 2 0 】，迄今为止硬骨鱼类中 共鉴定出8 种g n r h 分子结构变异型，它们分别是哺乳类g n r h ( 1 1 1 g n r h ) 、鲑鱼g n r h ( s g n r h ) 、鸡g n r h ( c g n r h i i ) 、鲷鱼g n r h ( s b g n r h ) 、鲶鱼g n r h ( c f g n r h ) 、 鲱鱼g n r h ( h g g n r h ) 、青鲻g n r h ( p jg n r h ) 和鲱形白鲑g n r h ( w f g n r h ) 。大多 数的硬骨鱼同时含有两种或两种以上的g n r h ，其中c g n r h i i 普遍存在于脑和垂 体中，第二种为s g n r h 或m g n r t t 或e f g n r h 。p o w e ll 等1 9 9 4 年首次在金头鲷脑和 垂体中发现了第三种g n r h ( s b g n r h ) 【2 6 】，之后又在多种硬骨鱼类脑和垂体中证 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 实有第三种g n r h 存在，但在种间存在很大差劓”l 。 在鱼类脑中发现的所有的g n r h 分子结构变异型，在功能上都具有促进垂体 g t h 分泌和释放的作用【26 。，但并不是所有类型的g n r h 都能在垂体中检测到，仅 有一部分g n r h 到达垂体，而且垂体中g n r h 种类和含量在种间也存在很大差异。 这些研究表明，不同种类的硬骨鱼类，脑和垂体g n r h 种类、分布和含量有 较大差异，它们调节生殖活动的方式是多种多样的。但是对于这些g n r h 分子结 构变异型与g t h 的合成和释放以及与性腺发育的关系如何尚不十分清楚。 1 2 促性腺激素( g t h ) 的研究进展 调节鱼类性腺发育的激素主要是垂体促性腺激素细胞产生的促性腺激素 ( g t h ) 。有关g t h 的种类、功能及分泌调节的研究较多，特别是近十多年来，随 着分子生物学的发展和新的生化技术的应用，这方面研究进展很快。 1 2 1g t h 有一种或两种类型 直到2 0 世纪7 0 年代，化学分离、提纯和生物测定的研究都支持硬骨鱼类脑 垂体只产生一种g t h 的观点。进入2 0 世纪8 0 年代后，随着生物化学和分子生 物学的发展和应用，对鱼类是否存在两种类型g t h 的研究有了显著的进展，已从 大麻哈鱼、银大麻哈鱼、鲤鱼、红鲷、底鲻、东方狐鲣、金枪鱼、鲟鱼等硬骨鱼 脑垂体中先后分离出两种g t h ，并分别命名为g t hi 和g t h i i ，两种g t h 的生化 结构、免疫学和生物学等特征有明显不同。g t hi 具有促进卵黄蛋白原渗入卵母 细胞的作用，被称之为促卵黄生成激素，g t hi i 则能刺激性类固醇激素生成、配 子发生与成熟排卵等，因此被称为促性腺成熟激素【1 4 4 j 。下面以大麻哈鱼为例f 2 8 ， 2 9 】，说明这两种g t h 化学结构的差异。大麻哈鱼6 t hi 和g t h i i 都是糖蛋白，分 子量分别为5 0 0 0 0 和3 6 0 0 0 ，都由q ，b 两个亚基组成，单独的每个亚基只能保 留整个激素分子生物活性的很小部分。其中q 亚基含抗原决定因素，b 亚基起生 物特异性作用。氨基酸顺序分析表明，两种g t h 与哺乳类g t h 同源。g t hi 的q 亚基n 一端残基为酪氨酸，有两种类型，即ql 和q2 ，分别由9 5 和9 2 个氨基 酸组成；b 亚基只有一种类型，由1 1 3 个氨基酸组成，n 一端残基是甘氨酸，分 子量为1 7 0 0 0 。g t h i i 的q 亚基只有一种类型，与g t hi 的a2 亚基相同，b 亚基 有两种类型( 仅2 个取代基不同) ，都由1 1 9 个氨基酸组成，分子量1 8 0 0 0 ，n 1 6 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 端残基为丝氨酸。g t hi 与g t hl i 的p 亚基间只有3 1 的氨基酸顺序相同。氨基酸 顺序分析还表明，g t hi 的b 亚基与牛f s hb 亚基相似( 4 1 相同) ，g t h i i 的b 亚 基与牛l hb 亚基相似( 4 2 相同) 。因此，化学结构分析证明了大麻哈鱼脑垂体 可产生两种g t h ，分别与哺乳类f s h 和l h 相似。从其它硬骨鱼中分离纯化的两 种g t h 化学结构与大麻哈鱼相似。n o z a k i 掣3 0 】用抗大麻哈鱼g t hib 亚基和g t h i ib 亚基的血清对虹鳟和大西洋鲑鱼的脑垂体进行免疫细胞化学研究，发现了两 种免疫反应差别明显的细胞：和g t hib 亚基抗血清起免疫反应的细胞主要分布 在中腺垂体腹部，和g t hi ib 亚基抗血清起免疫反应的细胞主要分布在中腺垂体 中央。没有看到在同一个细胞内同时含g t hi 和g r i t i i 。说明g t hi 和g t h l l 分别 由两种脑垂体细胞分泌。 必须指出的是，尽管在很多鱼类已经证实g t hi 和g t h i i 的存在，它们分别 和哺乳类的f s h 和l h 相似。但是否所有的硬骨鱼都有两种g t h 还有待系统研究： 例如s c h u l z 等【1 4 5 1 在非洲鲇中暂时只发现g t h i i 的存在。所以，鱼类g t hi 和g t h i i 的研究目前还在继续深入进行。 1 2 26 t hi 和g t h l l 在硬骨鱼类性腺发育中的作用 研究表明，g t hi 在鱼类性腺发育早期，即精子生成和卵黄生成阶段起主导 作用，刺激性腺分泌雌二醇和睾酮等性类固醇激素，以调节配子的生成；g t hi i 在性腺成熟时大量分泌并达到高峰，主要刺激1 7q ，2 01 3 一二羟黄体酮的生成， 从而促使卵母细胞和精子的最后成熟并刺激排精和排卵【3 1 】。 1 2 3g t h 分泌的调控 同哺乳动物一样，硬骨鱼类脑垂体g t h 的分泌受下丘脑促性腺激素释放激素 ( g n r h ) 和促性腺激素释放抑制因素( g r i f ) 的双重调控及性类固醇激素的反馈 调节作用( 图1 - 1 ) 。 g n r h 可刺激脑垂体g t h 的释放，但垂体对g n r h 的反应性随性腺发育阶段的 不同而不同。由下丘脑神经分泌细胞产生的d a 起促性腺激素抑制因子( g r i f ) 的 作用m 。d a 抑制脑垂体g t h 分泌的作用广泛存在于许多硬骨鱼类。效果却因种类、 性腺发育时期、年龄的不同而异。在鲤科鱼类，d a 既直接抑制基础g n r h 和g t h 的释放，亦抑制g n r h 刺激的g t h 释放；而在鲶鱼类，d a 只能抑制由g n r l 4 刺激 1 7 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 松果体 图1 - i 硬骨鱼类促性腺激素( g t h ) 分泌活动的神经内分泌调节示意图( 依 r e p e t e r ，1 9 7 9 ) f i g 1 - 1s k e t c hm a p o fn e u r o e n d o c r i n er e g u l a t i o no fg t hi nt h et e l e o s t 的g t h 分泌，不能直接抑制基础的g t h 分泌；也有报道对g t h 释放无影响的( 石 首鱼) 。d a 和a p o 对g t h 分泌的抑制作用和d o m 对g t h 分泌的刺激作用在6 月龄 鲤鱼性腺发育早期最明显，在性腺成熟期作用减弱；而在鲶鱼类，单独注射d o m 不能刺激g t h 分泌。此外，n e 、5 - h t 、n p y 既能刺激g n r h 的产生，从而促进g t h 的释放，还能直接刺激脑垂体释放g t h 。t r h 、t 3 也能直接刺激脑垂体释放g t h 。 y 一氨基丁酸( g a b a ) 能刺激g n r h 和g t h 的产生及增强g n r h 刺激g t h 释放的作用。 性类固醇激素( 睾酮、雌二醇) 也通过正、负反馈作用影响脑g n r h 合成和垂体g t h 人弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 的释放。在性未成熟鱼以正反馈为主，性类固醇激素的存在促进g n r h 、g t h 的合 成和分泌；在性成熟鱼，随着性类固醇激素的含量增加到一定程度，激活了d a 神经元和d a 脑一脑垂体通路，分泌d a 抑制g t h 的分泌；性类固醇激素还能降低 g a b a 浓度，阻断其对g t h 分泌的刺激作用，从而起负反馈调节作用【3 2 3 9 】。 由此可见，鱼类g t h 的激素调控是多因子的，调控的机理是多样性的，性 腺发育成熟后最终能否排卵还有赖于g t h 峰是否超过“排卵阈值 ，排卵和产卵 是以血清g t h 的急剧升高为先导的【3 3 3 6 1 。硬骨鱼类促性腺激素的分泌调控见图 l 一1 。 1 3 鱼类性类固醇激素的研究进展 1 3 1 性类固醇激素分泌部位 超微结构和组织化学研究表明，鱼类卵泡中的滤泡细胞可以合成类固醇激 素，某些特殊种类的黄体和间质腺细胞也具有这种功能即】。对于发育和成熟的 卵泡，类固醇激素是在颗粒细胞和鞘膜细胞中合成。根据卵巢类固醇激素合成的 两类细胞模型，雌二醇的合成是在颗粒细胞中进行，睾酮在膜细胞中合成。这一 模型在哺乳类、鸟类及某些两栖类中也得到证明。 硬骨鱼类卵母细胞外面的滤泡细胞有两层：内层为颗粒层，许多鱼类排卵前 滤泡颗粒层内有3b 一羟类固醇脱氢酶( 3b - h s d ) 4 1 1 ，该酶可促进类固醇激素的合 成活性；外层为鞘膜，颗粒层和鞘膜层之间由基膜分隔开。卵子成熟后会从两层 滤泡中脱落出来。己证明，卵巢中产生类固醇激素的部位在滤泡颗粒层和鞘膜均 有，但它们的分泌作用在排卵前后不同。排卵前的滤泡鞘膜和颗粒层一样可以分 泌类固醇激素。鱼类排卵后不久的特点是：高度脉管化的鞘膜及过度肥大的颗粒 细胞。鱼类在排卵后不久的滤泡颗粒细胞立即改变形态成为黄体细胞，鞘膜细胞 特化，有活跃的类固醇分泌现象。滤泡层是排卵后合成黄体酮的主要部位。 有充足的证据证明鱼类精巢间质细胞与哺乳类的l e y d i g s ( 莱迪希式) 细胞 同源，且具有典型的产生类固醇细胞的特征：细胞较大而成多角形，具有发达的 光滑型内质网和许多有管峭的线粒体，还具有3b h s d 的活性【3 。间质细胞成 为雄性激素合成的主要部位。精巢叶状( 管状) 部分内壁的足细胞，它的作用除了 为精细胞供应养料、转移代谢产物和吞噬那些未受精的多余的精子等作用之外， 1 9 人弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 还有分泌类固醇激素的机能。 1 3 2 性类固醇激素的作用 在所有的脊椎动物中，脑可以凭借类固醇激素的反馈作用及时了解并调节外 周的生理状况，这个机制被称为g n r h g t h 一类固醇激素轴，与生殖关系极为密 切。鱼类脑垂体g t h 分泌除了受下丘脑释放的肽类和胺类神经激素的双重调节 外，同样受类固醇激素的反馈调节。性腺生成类固醇的能力和种类与性腺发育周 期密切相关【4 2 】。大量的在体和离体实验均己证明，雌激素和可芳香化为雌激素 的雄激素对g t h 分泌有负反馈作用【4 3 1 。雌激素对性成熟鱼类g t h 的负反馈调节 机制己基本上阐述清楚，主要过程是：雌激素在二羟化酶的作用下转化为儿茶酚 雌激素，最后经儿茶酚氧甲基转移酶( c o m t ) 甲基化，成为无活性的二甲氧雌激素。 由于儿茶酚雌激素是c o m t 的更好底物，当它存在时，d a 的失活( 甲基化) 减弱， 导致d a 浓度上升，间接促进了g t h 的抑制作用，实现了负反馈调节。而非芳香 化的雄激素则无此作用，由此可见在鱼类性腺发育成熟和排卵过程中，性类固醇 激素能通过负反馈作用来协调脑垂体g t h 适量的合成与释放，以促进正常的性腺 发育和排卵，在更高层次上它可能参与整合h p g 轴各因子的协调作用。 卵巢类固醇激素可促进雌性附属器官和性细胞的发生、产生副性征。注射同 性激素能刺激性细胞的发育，注射异性激素可导致某些鱼类性转变的结果；雌二 醇有促进肝脏合成卵黄蛋白原的作用。此外，雌激素还能调节碳水化合物和脂肪 的代谢。卵黄形成期，血液的雌激素含量增加，主要是e 2 起负的反馈作用。卵 黄形成后期，与形成雌激素相关的酶活性即停止，因而在卵母细胞成熟和排卵前， 雌激素的水平逐渐降低，这可能是和排卵前要消除e 2 对g t h 分泌的负反馈作用 有关，因为排卵前需要g t h 迅速而大量得释放出来【3 1 1 。产卵后e 2 浓度还会进一 步下降。血清e 2 和g t h 在外源卵黄形成中为正相关，生殖周期之末为负相关。 孕酮能促使成熟的亲鱼产卵，但效果不如垂体激素，必须在内源垂体激素存 在的情况下，孕酮才能起诱导产卵作用。赵维信等 4 4 1 ( 1 9 8 6 ) 曾发现大西洋鲑鱼 ( s a l m os a l a r ) 卵巢中完整成熟的卵细胞，在g t h 刺激下，可连续地释放1 7q ， 2 0b - d h p ，此时胚泡破裂达到最后成熟，从而证明1 7a ，2 0b - d h p 是一种高效 催熟剂。 大弹涂鱼生殖节律的内分泌研究 1 3 3 性类固醇激素受体的研究 在卵泡的生长发育过程中，性类固醇及其受体有很重要的调控作用。受体是 能够识别配体并与之结合从而诱导产生一系列生化反应的特异蛋白，是靶细胞接 受生理调节和药物作用的位点。类固醇激素受体主要存在于靶细胞的胞质和胞核 中，受体在胞质中合成后进入核内。激素进入细胞后与之结合，通过胞质和胞核 中类固醇激素受体的穿梭，调节核基因组相关产物的转录、翻译及分泌一些生物 活性物质，以发挥激素的作用。卵巢类固醇激素受体研究和应用较多的是性激素 受体( s e xh o r m o n er e c e p t o r ，s e x - h r ) ，包括雌激素受体( e s t r o g e nr e c e p t o r ， e r ) 、孕激素受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r ，p r ) 和雄激素受体( a