（分析化学专业论文）毛细管电泳——电化学检测在环境和药物分析中的应用研究.pdf

中文摘要 中文摘要 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，c e ) 是近二十年来发展最快的分离分析 技术之一，它将分离柱效提高到上百万理论塔板数，进样量也从微升水平进入纳 升水平，其研究和应用涉及环境分析、药物分析、生化分析等几乎所有的分析化 学领域。但毛细管电泳较小的进样量和极细的毛细管通道内径也给检测也带来了 困难。紫外、激光诱导荧光、质谱等各种检测方法都具有一定的优点，但往往存 在仪器比较昂贵、衍生化步骤烦琐等缺点。电化学检测中的安培检测技术，具有 比紫外检测更高的灵敏度，且仪器简单、价格成本低、线性范围宽、操作简便， 因而其与毛细管电泳联用后在分析化学领域得到了广泛的研究和应用。 近年来，随着人们对生活质量的关注，环境分析和药物分析也成为分析化学 研究的重点和热点。目前，使用的手段主要是色谱技术，包括薄层色谱( c ) 、 气相色谱( g c ) 、液相色谱( h p l c ) 。尽管这些色谱技术手段相对成熟，但是与 快速、灵敏、方便的分析科学发展要求还有一定的差距。本论文的目的是基于毛 细管电泳一安培检测技术在这方面的优点，在环境和药物分析领域进行了一些探 索，主要有以下四部分： 第一章为绪论。这部分综述了毛细管电泳的发展历史、特点、理论基础、分 离模式、进样方式和联用检测技术，介绍了毛细管电泳技术在环境和药物分析领 域的应用，并简单阐述了本论文的研究目的与意义。 第二章探讨了运用毛细管电泳安培检测联用技术分离测定水中的硝基苯酚 异构体的方法。对电泳条件进行了优化，研究了有机添加剂在提高分离度方面的 作用和机理。 第三章探讨了毛细管电泳安培检测联用技术在血液中检测复方利福平的方 法。讨论了主要的影响因素，提出了一些应对方法，得到了优化的实验条件。 该方法中利福平和异烟胼的检测下限分别为3 x 1o - 7 酌n l 和i lo - 7g m l ，并且在血 浆中检测了利福平和异烟肼的浓度。 第四章探讨了利用毛细管电泳一安培检测联用技术对滴鼻液中的盐酸麻黄碱 和磺胺嘧啶两成分进行质量控制的可行性。研究了各种实验条件对分离效果的影 响，得到了优化的实验条件。盐酸麻黄碱和磺胺嘧啶在三个数量级的范围内呈良 好线性关系，检测下限( s n = 3 ) 分别为7 0 x 1 0 - 8 9 m l 和3 0 x 1 0 罐幽n l 。该方法已 成功地应用于实际样品分析。 关键；蟊毛细管电泳，安培检测，环境分析，药物分析 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 英文摘要 英文摘要 c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( c e ) i so n e o ft h em o s ti m p o r t a n ts e p a r a t i o nt e c h n i q u e s i nt h ep a s tt w e n t yy e a r s b e c a u s et h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e ri sg r e a td e v e l o p e dt o t e n so f t h o u s a n d sa n de v e nm i l l i o n sa n dt h ev o l u m eo f s a m p l ei n j e c t i o nr e a c h e sn a n o m i l l i l i t e l - l e v e li nc ea n a l y s i s ，i ti ss t u d i e da n da p p l i e dt om e s ta n a l y t i c a la r e a s h o w e v e r , t h es m a l ls a m p l ei n j e e t i o nv o l u m ea n dv e r yt h i nc a p i l l a r yb r i n ga b o u t d i 伍c u l t i e st od e t e c t i o n s 1 h ec o m l n o nu s e dd e t e c t i o nm e t h o d sa r eu l t r a - v i o l e t ( u v ) ， l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) ，m a s ss p e c t r a ( m s ) a n de l e e t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( e d l e v e r yd e t e c t i o nm e t h o dp e r f o r m ss o m ea d v a n t a g e sa n ds u f f e r sf r o ms o m e s h o r t a g e st o o f o re x a m p l e ，l i fa n dm sa r ev e r ys e n s i t i v eb u tt h ei n s t r u m e n t u f i o n s a l ev e r ve x p e n s i v e a n ds o m ec o m p l i c a t e dd e r i v a t i o np r o c e d u r e sa r en e e d e d a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n “k d ) ，o n ek i n do fe l c c t r o c h c m i c a ld e t e c t i o n s ，i s m o r e s e n s i t i v et h a l lt h ec o m m o nu s e du vd 酏t i o ma n dh a v em a n ym e f i t sw h e ne o u p l e d w i t hc e ，s u c ha ss i m p l ei n s t r u m e n t a t i o na n do p e r a t i o n , l o wc o s t , w i d el i n e a rr a n g e ， e r e t h ec o m b i n a t i o no fc ew i t ha di se x t e n s i v e l ys t u d i e da n da p p l i e di nm a n y a n a l y t i c a lf i e l d sf o ri t sa b o v ea d v a n t a g e s r e c e n t l y , w i t hm o r ea t t e n t i o np a i dt o t h eq u a l i t yo f1 i f e t h ea n a l y s i s i n e n v i r o n m e n ta n dm e d i c i n ef i e l dh a sb e c o m eah e t s p o to ft h ea n a l y t i c a lc h e m i s t r y r e s e a r c h a t p r e s e n t , t h et e c h n i q u e s w h i e ha r eu s u a l l yu s e di n v o l v et h e c h r o m a t o g r a p h y , i n c l u d i n gt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yf c ) ，g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) ，a n dh i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a l t h o u 曲t h e s e c h r o m a t o g r a p ht e c h n i q u e sa r ew i l d l yu s e d , t h e yc a nn o tk e e pu pw i t ht h ea d v a n c e so f a n a l y t i e a ls c i e n c e ，w h i c hd e m a n d aq m c ls e n s i t i v ea n dc o n v e n i e n tm o d e r ns e p a r a t i o n a n dd e t e c t i o nt e c h n i q u e b e c a u s eo ft h e s em e r i t so fc o m b i n a t i o no fc a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i sw i t hc h e m i c a ld e t e c t i o n ( c e e d ) h a ss h o w c di nm a n yf i e l d s ，t h eg o a l o ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o no fc e - e di nt h ee n v i r o n m e n ta n dt h e m e d i c i n ea n a l y t i c a lf i e i d s t i l i st h e s i si n c l u d e sf o u rp a r t s ： c h a p t e r1 i nt h i sc h a p t e r ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e ，t h eh i s t o r yo fc e ， d e v e l o p m e n ta n db a s i ct h e o r i e so fc e ，t h es e p a r a t i o nm o d e l s ，t h ed e t e c t o r s ，t h e s t u d i e sa n da p p l i c a t i o n so f c e - a ds i m p l yw e r ei n t r o d u c e d t h eg o a la n ds i g n i f i c a n c e o f t h i sd i s s e r t a t i o nw e r ei n l r o d u c c dt o o c h a p t e r2 a s i m p l e ，r e l i a b l ea n dh i g h l ys e n s i t i v em e t h o d ，b a s e do nc a p i l l a r y z o u e e l e e t r o p h o r e s i s w i t h a m p e r o m e 砸c d e t e c t i o n ,f o r t h es e p a r a t i o na n d d e t e r m i n a t i o no fn i t r o p h e n o lp o s i t i o n a li s o m e r sw a ss t u d i e di nt h i ss e c t i o n t h et h r e e a n a l y t e sc o u l db ep e r f e c t l ys e p a r a t e db yo n l ya d j u s t i n gt h er i mb u f f e rw i t hl i t t l e o r g a n i cm o d i f i e r 髓ee f f e c to fp e r c e n t a g eo fo r g a n i cs o l v e n t si nt h ee l e e t r o p h o r e t i c b u f f e ro nt h es e p a r a t i o no ft h r e ep h e n o l sw a si n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，o 一，m - ，p - n i t r o p h e n o lw e r es e p a r a t e ds u c c e s s f u l l ya n dg o o dl i n e a r i t y , r e p r o d u c i b i l i t ya n dr e c o v e r yw e r e o b t a i n e d 1 1 1 eu t i l i t yo ft h i sm e t h o dw a s 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 1 1 d e m o n s t r a t e db ym o n i t o r i n gd y e s t u f fw a s t e w a t e r , a n dt h ea s s a yr e s u l t sw e r e s a t i s f a c t o r y c h p t e r3 i nt h i ss e c t i o n , ah i g hp e r f o 皿a n c ee a p i n a r ye l e e t r o p h o r e s i sw i t h a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o nf f n c e a d ) m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc o m p o u n d m e d i c i n ec o n s i s t e do fr i f a m p i c i na n di s o n i a z i dw a sd e v e l o p e d t h ef a c t o r sa b o u t s e p a r a t i o nw e r ed i s c u s s e da n dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d t h el i m i t so f d e t e c t i o nf o rr i f a m p i c i na n di s o n i a z i dw e l e3 x l o - g m la n dl x lo 。g m l , r e s p e c t i v e l y n 圮c o n c e n t r a t i o nf o rr i f a m p i c i na n di s o n i a z i di nr a ts e r u l nw a sa l s o d e t e c t e d 1 1 1 em e t h o dw a sr a p i d , s e n s i t i v e ，s i m p l e , a n dh i g h l yr e l i a b l ef o rd r u ga s s a y ， a n dc 缸b eu s e dt om o n i t o rt h ec o n c e n t r a t i o no fr i f a m p i c i na n di s o i n a z i di ns c f u n l c l i n i c a l l y c h a p t e r4 i n t h i ss e c t i o n , am e t h o db a s e do nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t h e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( c e e d ) h a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f e p h e d r i n eh y d r o c h l o r i d ea n ds u l f a d i a z i n ei nn a s a ld r o p s t h ee f f e c t so fw o r k i n g e l e c t r o d ep o t e n t i a l ，p ha n dc o n c e n t r a t i o no fr u n n i n gb u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g ea n d i n j e e t i o nt i m e0 1 1c e e dw e r ei n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d m o u s ，t h e a n a l y t e sc o u l db es e p a r a t e di na5 0 m m o lb o r a t eb u f f e r ( p h = 8 0 ) w i t h i n7m i r aa 3 0 0 1 a md i a m e t e rc a r b o nd i s ke l e c t r o d eh a sag o o dr e s p o n s ea t + o 9 5v ( v s s c e ) f o r a l la n a l y t e s t h er e s p o n s ew a sl i n e a ro v e rt h r e eo r d e r so fm a g n i t u d ew i t hd e t e c t i o n l i m i t s ( s n = 3 ) r a n g i n gf r o m7 0 1 0 - 8g m et o3 0 x 1 0 8g m lf o rt h ea n a l y t e s t h e m e t h o dh a sb e e ns l l c c e s s f l 】1 1 ya p p l i e df o rt h ea n a l y s i so f r e a ls a m p l e ，诵1 hs a t i s f a c t o r y r e s a l t s k e yw o r d ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ， e n v i r o n m e n t a la n a l y s i s ，p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：聋马亳 日期：乏直：! ! 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：蚴 导师签名：训帝卜 第一章绪论 第一章绪论 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l o c t r o p h o r e s i s c e ) 又称( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 或毛细管电分离法( c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n m e t h o d ，c e s m ) ，是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品 中各组分在毛细管中分配行为和淌度的差异而进行高效、快速分离的一种新型的 液相分离分析技术。该技术是2 0 世纪8 0 年代中后期迅速发展起来的，被誉为是 2 0 世纪9 0 年代最为重要的分离分析方法之一。该技术实际包括电泳、色谱以及 相关交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱技术之后的又一重大进展，它使分 析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。 在生命科学、医药分析、环境监测、食品分析等领域应用前景极为广阔。 第一节毛细管发展历史及概述 1 毛细管电泳的发展历史 电泳( e l e e t r o p h o r e s i s ) 是指带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极 移动的现象o1 8 0 8 年俄国物理学家v o nr u e s s 首次发现电泳现象，1 8 9 7 年 k o h l r a u s c h 首次提出离子迁移方程。但电泳真正被视为一种在生物化学中有重要 意义的技术，是由1 9 3 7 年t i s e l i u s 首先提出，他利用电泳技术第一次从人的血清中 分离出白蛋白、昝、争和1 l 球蛋白。t i s e l i u s 对电泳技术的贡献，使他获得了1 9 4 8 年诺贝尔奖。但传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的高电压所引起的电介 质离子流的自热，或称焦耳热。这种焦耳热会导致体系内部出现径向温度梯度， 引起溶液对流，扰乱分离谱带，降低分辨率。这一局限性限制了当时电泳技术的 进一步推广应用。1 9 6 7 年，t i s e l i u s 的学生h j e r t e n 首先提出在高电场强度下，在 直径为3m m 并用甲基纤维素涂布管壁石英管中作自由区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e 1 e c t x o p h o r o s i s ，c z e ) 的设想，并以巧妙实验成功地证实了他的设想。尽管操作 繁琐，但h j e r i c h 的设想对电泳技术的发展产生很大的启发作用 1 】。1 9 7 0 年，等 速电泳的先驱e v e r a e r t s e 2 等报道了有关等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 中的c z e 研究，所用方法成为现代电泳的雏形，只是由于当时柱效低，未能引起人们足够 的关注。1 9 7 4 年v i r t e n a n 提出用2 0 0 5 0 0 舯内径的毛细管作电泳分离，拓展了 s j e r t e n 的方法 3 。1 9 7 9 年e v e r a e r t s 和m i k k e r s 以2 0 0 肿内径的聚四氟乙烯管作 电泳分离通道，以紫外和电导检测器在线检测，用区带电泳模式分离了1 6 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 1 第章绪论 种有机酸，获得了小于1 0p a n 的塔板高度，取得t c z e 发展历史上的一个重大突 破【4 】。他们的工作奠定了毛细管电泳的发展基础。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 用内 径7 5 a n 的石英毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行c e 测定，以荧光检测器做在 线检测，获得理论塔板数高达4 0 万的高分离性能，j o r g e n s o n 等人的研究工作轰动 了整个分离科学界，成为毛细管电泳发展史上具有划时代意义的里程碑，标志着 现代毛细管电泳技术的创立 5 】。1 9 8 3 年后，h j e r t e n y 、先后提出了毛细管凝胶电 泳【6 】和毛细管等电聚焦电泳 7 模式，大大提高了电泳分离电的效率，为毛细管 电泳技术的推广应用奠定了坚实的基础。1 9 8 4 年t e r a b e 在含有s d s 胶束的缓冲液 中分离了中性组分，实现了电泳和色谱的完美结合【8 】。这种方式被成为胶柬电 动毛细管色谱( m i c 2 l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e c c 或m 卫k c ) 。 1 9 8 6 年，l a u e r 报道了有关蛋白质的毛细管区带电泳( c z e ) ，并获得了1 0 6 m 理论 塔板数的极高的柱效 9 】。1 9 8 7 年h j o f t e n 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管 内进行，开创了毛细管等电聚焦焦( c a p i l l a r yi s o e l e e t r i cf o c u s i n g , c i e f ) 电泳模式 【l o 】。同年，c o h e n 和k a r g c r 1 l 】发表了他们所做的毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e l e l e e t r o p h o r e s i s ，c g e ) t 作，这是现代效率最高的分离方法。1 9 8 8 年，c e 商品化 仪器推出，毛细管电泳分离科学开始突飞猛进地发展。近年来，分离科学家又将 液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，发展出毛细管电色谱，扩大了电泳的应用 范围。现在毛细管电泳已成为一种相当普遍的微量分离分析方法 1 2 1 ，并成为某 些标准和常规的分析方法。 2 毛细管电泳的基本原理 2 1 基本装置 图1 1 毛细管电泳仪器示意图 常规的电泳仪器示意图如图1 1 所示，主要包括高压电源、毛细管、缓冲液池、 检测器。商品化的仪器还包括控温系统与进样系统。 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 2 第一掌绪论 2 2 基本概念 2 2 1 电泳 电泳是电介质体系中带电粒子在电场作用下以不同的速度向与其电荷相反 的电极方向迁移的现象。利用这种现象对混合组分进行分离分析的技术称之为电 泳技术。毛细管电泳泛指在极细的毛细管内实现的一大类电泳技术。毛细管从材 料来分有聚四氟乙烯、玻璃、石英三种。最为常用的是熔融石英毛细管，外壁有 聚亚酰胺涂层增加其强度，因而具有一定的弹性。一般内径为2 5 1 0 0 珊吐，外径 为3 0 0 - - 5 0 0 z m ，标准的外径是3 7 5 x m 。毛细管电泳与传统电泳比又有其独特的 地方，其原因是由毛细管的特点引起的。 2 2 2 电渗流 电渗流：毛细管内的体相溶液在外加电场作用下整体朝一个方向运动的现 象。其来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。 图1 - 2 毛细管内壁双电层示意图 根据界面化学的理论可知，浸没在液体中的所有表面都会形成双电层，通常是由 两相界面处相对固定和游离的两部分离子组成，它们与表面自身电荷异号。毛细 管内壁与内充电解质溶液接触界面形成双电层( 如图1 2 所示) 。通常电解质溶 液p h 大于3 时，使石英毛细管内壁硅羟基解离而带负电荷，此负电荷为定域电荷， 它吸引溶液中的正离子形成双电层。第一层为吸附层s t e r n 层h e l m h o l z 层，第二 层为扩散层，两层交界面上的电位称为z e t a 电位，记做厶双电层的形成使得靠 近管壁的溶液层中高出溶液本体的“自由”离子，这些溶剂化的离子在电场作用下 推动管内液体整体发生相对固体表面的移动。这种液体相对于固体表面的移动的 现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流( e l e c t r o o s m o t i e f l o w ，e o f ) 。在多数水溶液体系中，石英和玻璃毛细管产生指向负极的的电渗 流。许多有机材料，如聚四氟乙烯和聚苯乙烯，也会因残留的羧基而产生定域的 负电荷，同样产生指向负极的电渗流。 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文3 第一章绪论 2 3 基本理论及公式 电泳迁移速度( e l e c t r o p h o r e t i cv e l o c i t y , d ) c e 系统中，离子在缓冲液中的 电泳迁移速度( p 昂) 与电场强度( e ) 和电泳淌度( 脚) 呈正比，即 | 印2 i c e p 上 电泳淌度又称电泳迁移率( d e c t r o p h o r c t i cm o b i l i t y ) ，定义为单位电场强度下 粒子的平均电泳速度。它取决于离子自身的电荷数目、离子半径及介质的粘度， 即 # e p = q ( 6 m r ) ( p 。：电泳淌度，q ：离子的电荷，”：介质的粘度，：离子的有效半径) 电渗流电渗淌度又称电渗迁移率( l e o ) 或电渗流系数，定义为单位电场强度下电 渗流的迁移速度，即 风。= 舾= e a ( 4 7 n 1 ) ( p e o ：电渗速度，e ：溶液的介电常数，管壁的z e t a 电势， 7 ：介质的粘度) 表观迁移速度与表观淌度粒子在毛细管内介质中的运动速度是电泳和电渗流 的两种速度的矢量和，即 = f + p e o ( k ：表观迁移速度，协有效迁移速度即电泳速度，：电渗流迁移速度) 若以淌度表示，则为 ，= 比f + # e o ( i 砩：表观淌度，f c f = 有效淌度即电泳淌度，如。：电渗淌度) 对于带正电荷的粒子，电泳和电渗流的方向相同，故带正电荷粒子最先流出； 中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于e o f 速度；带负电荷粒子电泳 方向与e o f 方向相反，因e o f 速度一般大于电泳速度( 前者的速度是后者的5 7 倍) ，故它将在中性粒子之后流出【1 3 】。各种粒子因迁移速度不同而实现分离，这 就是最常见的毛细管区带电泳的基本分离原理。通过调节缓冲液介质的p h 值可 以改变很多物质的离子化程度和电荷，进而改变了它们的电泳淌度，以达到分离 的目的。各组分按其淌度大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的 电泳谱图。 3 毛细管电泳的特点 毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱的优点，其突出特点表现在以 下几个方面： ( 1 ) 所需样品量少、仪器简单、操作简便。 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 4 第一章绪论 毛细管进样体积一般为纳升级( 可少到1n l ，消耗体积在l 5 0 n l ) ，仪器 结构简单，容易使用，易于维护，仅需简单的培训就能掌握基本操作。而且商品 化的仪器自动化程度很高，操作可通过程序控制，省去一些繁琐的步骤。 ( 2 ) 分析速度快，分离效率高，分辨率高。 高电场的应用提高了分离效率，缩短了分离时间，一般几十秒到十几分钟就能 完成一次分离。由于液体流动由电场驱动，为平面型流，且进样端和检测端都无 死体积，峰展宽程度小，另外由于毛细管极细的内径，焦耳热得到有效的克服， 因此具有很高的柱效。凝胶毛细管电泳可以识别相差一个碱基d n a 片段，因而 被广泛的用来进行基因测序。 ( 3 ) 操作模式多，开发分析方法容易。 毛细管电泳至今已经发展出多种分离模式，适用于不同的分离对象，这是其 他分离技术无法媲美的。 ( 4 ) 实验成本低，消耗少。 只需少量的流动相和低廉的毛细管就能实现分离目的。另外，大部分分离媒 介为水介质的体系，不仅成本低，而且不会对环境造成污染，属于绿色分离，这 与化学的发展趋势相一致。 ( 5 ) 应用范围极广。 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、 体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸核苷酸、 蛋白质多肽氨基酸、糖类糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分 子等的快速分析，以及d n a 序列分析和d n a 合成中产物纯度测定等，甚至可 用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子有机酸、单细胞分析、药物 与细胞的相互作用和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则可用于手性分 离中性化合物。毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在i 晦床医学 等领域的应用也有较多应用。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、 代谢研究、病理研究、同工酶分析、p c r 产物分析、d n a 片段及序列分析等。 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 第一章绪论 第二节毛细管电泳的分离模式和进样方式 i 分离模式 毛细管电泳经过二十多年的快速发展，已经渗透到分离学科的各个领域。为 了适应不同分析对象的要求，分离科学家们已经开发出多种毛细管电泳分离模式 ( 参见表1 1 ) ，从而使毛细管电泳技术不断趋于成熟和完善。它们各具特色，成 为毛细管电泳技术重要组成部分。 表1 - 1c e 分离模式的分离依据及应用范围 分离模式分离依据应用范围 可解离的或离子化合物、手性 毛细管区带电泳( c z e )溶质在自由溶液中的淌度差异 化合物及蛋白质、多肽等 毛细管胶柬电动色谱溶质在胶柬与水相间分配系数 中性或强疏水性化合物、核酸、 ( 匝c c ) 的差异多环芳烃、结构相似的肽段 溶质分子大小与电荷质量比差 毛细管凝胶电泳( c g e )蛋白质和核酸等生物大分子 异 。 毛细管等电聚焦( c r e f )等电点差异蛋白质、多肽 溶质在电场梯度下的分布差异 毛细管等速电泳( c r r p )同c z e ，电泳分离的预浓缩 ( 移动界面) 毛细管电色谱( c e c )电渗流驱动的色谱分离机制同h p l c 亲和毛细管电泳受体( r e c e p t o r ) 和配体 研究各种类型的配体一受 体相互作用 ( a c e )0 i g a n d ) 间特异性亲和作用 手性分离，药物筛选 非水毛细管电泳不易溶于水而易溶于有机 ( n a c e ) 溶质在自由溶液中的淌度差异 溶剂的物质 现对这些模式作简要的介绍。 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文 6 第一章绪论 1 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 毛细管区带电泳是以具有缓冲能力的电解质溶液为载体，以毛细管为分离通 道的一种高压电泳模式，是应用最早也最为广泛的一种分离模式。其分离原理是 根据被分析物的电泳淌度差异实现分离。在外加电场作用下，具有不同电泳淌度 的分离对象将在彼此分开的区带中迁移，而具有相同电泳淌度的分离对象将在同 一个区带中共迁移。毛细管区带电泳除具有一般的电泳迁移外，还受到电渗的影 响。在毛细管区带电泳中，毛细管内壁如果没有进行修饰，正离子迁移的方向与 电渗方向一致，负离子迁移的方向与电渗方向相反，因此正离子在毛细管的迁移 速度加快，负离子在毛细管的迁移速度减慢。多数情况下，电渗的速度比电泳速 度快5 7 倍，故在毛细管中负离子也总是向负极移动，所以在毛细管区带电泳中 利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次毛 细管区带电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。在实际使用c z e 过程中， 常常通过一些管壁修饰技术，功能化添加剂等来减少管壁的吸附，提高分离效率， 扩大应用范围。目前，主要使用的添加剂有以下几类： ( 1 ) 无机电解质，如n b c l 、k c l 等。它们可以压缩区带，减少蛋白质等在 管壁的吸附。 ( 2 ) 高分子添加剂，如聚乙烯、纤维素等。它们可以形成分子团或特殊的 局部结构，影响样品的迁移，改善分离，可用于构建各种电动色谱。 ( 3 ) 表面活性剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基季铵盐等。可在管壁形成 吸附层，可用于电渗控制或抑制蛋白质在管壁的吸附。 ( 4 ) 功能化试剂，如环糊精、手性冠醚。可以提高分离的选择性，在手性 分离中应用广泛。 ( 5 ) 小分子有机溶剂，如甲醇、乙腈、丙酮等。可以增加疏水性物质在水 溶液中的溶解度，拓宽应用范围；还可以提高选择性，改善分离度。 2 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y , m e c c 或m e k c ) 1 9 8 4 年，t e r a b e 用含s d s ( 十二烷基磺酸钠) 的胶束溶液分离了中性分子e 8 ， 开创了毛细管电泳的一个重要分支，即胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 。后来， t e r a b e 等又相继发展了环糊精e k c ，离子交换e k c ，从而丰富和发展y m e k c 。 胶束电动毛细管色谱是在电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂，如十二烷基硫酸 钠( s d s ) 来实现的。当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂 2 0 0 7 年华东师范大学申请硕士学位论文7 第一章绪论 分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束假固定相。通过分离对象在胶束相和水 相之间的分配系数不同而实现分离。虽然s d s 胶束带负电，但一般情况下电渗速 度仍大于胶束的电泳速度，故胶束仍以较低的速度向负极移动。胶柬电动毛细管 色谱的突出优点是不仅能分析离子化合物，还能分析不带电荷的中性化合物，把 电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物，从而拓宽了毛细管电泳的应用 范围。此外，胶束电动毛细管色谱还能很快且很容易地通过改变流动相和胶束 相的组成来增加分离选择性，非常适合于手性化合物的分离。近年来，各种各样 的表面活性剂得到了研究，如环糊精、聚乙烯吡啶等，并在许多样品测试中得到 了应用 1 4 - 1 7 。 3 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s c i t p ) 常规等速电泳在上世纪7 0 年代已经成熟。1 9 8 7 年h j e r t e n 等证明在小孔径毛 细管中实现等速电泳是可行的。他们用5 0 微米内径的毛细管以等速电泳的模式成 功的分离了几种染料 1 0 】，开创了毛细管以等速电泳。等速电泳属于不连续介质 电泳，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。在等 速电泳中，不能同时分离阴阳离子混合物，只能进行同电荷物质的分离。此技术 的关键是两种电解质的选择，就带负电荷物质分离而言，前导电解质中阴离子迁 移速率应大于被分析物的，而后继电解质中迁移速率应小于分析物的。当电场施 加进行电泳分离时，电位梯度的扩展使所有离子最终以同一速度泳动，样品带按 淌度大小彼此连接而互不重叠。目前，毛细管以等速电泳在分析和微制备中的应 用，特别是作为一种在柱的样品预浓缩方法得到了普遍重视。 4 毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r y i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 1 9 8 5 年，h e r t e n 首先将等电聚焦电泳方式引入c e 分离，使毛细管等电聚焦成 为蛋白质分离的强有力的微柱分离工具 刀。等电点聚焦就是在电泳槽中放入载 体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加 的p h 梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电 点相当的p h 位置上。电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差 o 0 1 0 0 2 p h 单位的蛋白质分开：一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所 走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄。由 于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点，很稀的样品 也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0 0 1 p h 单位。电聚焦 技术的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉 2007年华东师范大学申请硕士学位论文8 第一章绪论 淀，二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的 蛋白质。 5 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y , c e c ) 毛细管电色谱可以看成是c z e 中的毛细空管被色谱的固定相涂布或填充的 产物，从另一角度也可看成液相色谱的机械泵被“电渗泵”取代的产物。1 9 7 4 年， p r e t o r i o u s 等 1 8 1 指出在毛细管中可以使用电渗流驱动流动相，由于他采用的毛 细管内径太大，未能展示电色谱的优越性。1 9 8 2 年，t s u d a 等 1 9 进行了第一次 开管毛细管电色谱( o t c e c ) ，验证了o t c e c 的高分离能力。m a r t i n 等 2 0 2 1 1 研 究了开管电色谱的轴向扩展及峰展宽，从理论上证实了用电渗流推动流动相的优 越性。1 9 9 0 年，b r u i n 等【2 2 】在1 0 胛的石英毛细管中4 0 0s 内分离了8 种p a r i s ，取 得了很好的分离效果，进一步证实了c e c 的优越性。此技术结合了毛细管区带电 泳和高效液相色谱的优