（高分子化学与物理专业论文）hrp基因的表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究.pdf

辣根过氧化物酶基因的表达，进化夏其催化苯胺类化合物象合反应的研究 摘要 一、研究的背景及意义 苯胺类聚合物是一类最早合成的导电聚合物，f r i t z s c h e 早在1 8 4 0 年就报道了聚苯 胺( p a n i ) 的合成。苯胺类聚合物可采用化学合成法，也可采用酶催化法合成。化学合 成法主要包括，化学氧化聚合、电化学聚合、乳液聚合、反向微乳液聚合、缩合聚合和 模板聚合等。酶催化合成法主要采用过氧化物酶催化合成聚苯胺。采用不同的聚合方法 得到了导电性、溶解性等性能不同的聚苯胺。酶催化合成只需常温常压和温和的反应条 件，催化效率高，对底物和产物的立体专一性强，副反应少，产物易于分离纯化。酶催 化反应代替化学合成反应可以简化工艺、节省设备、无传统工艺的危险性和减少环境污 染等。近年来，酶催化化学反应越来越受到人们的广泛关注。 目前，可用于酶催化法合成苯胺类聚合物的酶有辣根过氧化物酶( h r p ) 、漆酶、 大豆过氧化物酶等。其中，h r p 己被最为广泛地应用于酶催化化学反应。可以预期，h r p 在催化氧化合成聚苯胺类化合物方面具有潜在的应用前景，利用h r p 催化氧化苯胺类 化合物发生聚合反应是合成聚苯胺类化合物的极具魅力的选择。h r p 可以催化氧化苯胺 类化合物，并可在水相或非水相溶剂中催化苯胺类化合物发生聚合反应，合成聚苯胺类 化合物，h r p 催化苯胺类单体聚合反应是在h 2 0 2 作为氧化性底物存在下进行的。然而， 令人遗憾的是：h 舢是h r p 的自杀性底物，在反应过程中抑制和灭活h r p ，制约了酶催 化聚合法在实际生产中的应用。目前，人们已经在反应方式上作了许多有益的探索研究， 但仍未能从根本上解决这一问题。我们认为从分子水平上改造h r p 分子的结构和性能， 提高h r p 的h 2 0 2 耐受性，使其适应在非生理条件下催化氧化苯胺类化合物发生聚合反 应的要求，是解决这一问题的一条新的有效途径，并将为探索酶催化聚合反应在实际生 产中的应用提供科学依据。 酶分子定向进化是一种在试管中使酶发生特定结构和功能改变的基因操作技术。 酶分子定向进化的基本策略是随机突变，定向筛选。这是一种非常有效且接近于自然 进化的酶工程研究新策略。它不仅能使酶进化出非天然特性，而且能使酶进化产生具 有多项优化功能，进而发展和丰富酶类资源。2 0 世纪9 0 年代以来，随着易错p c r 技 术和d n a 改组技术的出现，酶分子定向进化技术和策略才日趋成熟和完善。迄今为止， 人们已经成功地获得了几十种进化酶，并应用于不同领域，如进化的脂肪酶、蛋白水 解酶、纤维素酶等。由此可见，利用酶的定向进化技术可以从分子水平改造天然酶分 珊 辣根过氧化物酶基因的表达，进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 子的结构和构造新的非天然的酶分子，从而改变酶的活性、稳定性和底物专一性等性 能，使其更好地适应体外非生理条件下催化化学反应的要求。目前，有关过氧化物酶 进化研究只有少量相关文献报道。1 9 9 9 年c h e r r y j r 等研究进化了真菌过氧化物酶， 进化的真菌过氧化物酶热稳定性和氧化稳定性分别提高了1 7 4 倍和1 0 0 倍。2 0 0 0 年 m o r a w s k i b 等在大肠杆菌和酿酒酵母中进化了辣根过氧化物酶，进化的辣根过氧化物 酶对2 ，2 ，连氨基2 ( 3 乙基并噻唑啉6 ) 铵盐( a b t s ) 催化活力提高了5 a 倍。 然而，这些研究成果均以催化氧化小分子化合物( 如，a b t s ) 发生化学反应为进 化目标，而以催化氧化合成聚苯胺类导电聚合物为目标的硼冲进化研究尚未见报道。 我们将分子生物学、组合化学及酶分子体外定向进化的方法和技术应用于聚苯胺类导电 聚合物的酶催化合成，以催化苯胺类化合物发生聚合反应为目标进化h r p 。从分子水平 上，改造h r p 的结构和性能，提高h r p 在催化苯胺类化合物聚合反应过程中的h z 魄耐 受性，并利用毕赤酵母分泌表达进化h r p ，研究进化h r p 催化苯胺类化合物发生聚合 反应的性质、动力学及聚合物的性能，为瑚姆催化苯胺类化合物聚合反应在实际生产 中的应用奠定基础。 二、研究内容及结果 1 从辣根( a r m o r a c j ar u s t i c a n a ) 中克隆了h r p c 3 基因( h r p ) 并对其进行了分 析检测。h r p 基因是真核生物基因，为此，首先从辣根侧根中提取获得了辣根总r n a ， 琼脂糖凝胶电泳及紫外检测证明提取的辣根总r n a 符合要求。而后采用r t p c r 技术获 得辣根总m r n a 的e d n a ，最后利用设计的h r p c 3 基因特征引物通过p c r 扩增技术获得 h r p c 3 基因。经琼脂糖凝胶电泳检测获得的d n a 片段大小约为1 k b ，与预期结果一致。 采用重叠延伸剪切p c r 技术，使h r p 发生同义突变，获得了删除e c o r i 酶切位点的 突变h r p 。而后，采用限制性内切酶e c o r i 和x b a i 双酶切法，将目的基因( h r p ) 连接 到了p p i c z a - a 质粒中，成功地构建了p i c z a - a h r p 质粒；最后，采用化学方法使融合 质粒p p i c z a - a - h r p 成功地转化了e c o l it o p i o 。酶切法分析结果及测序分析结果表 明克隆到了h r p 基因，克隆的h r p 基因与n c b a 基因库中编号g i ：2 1 7 9 3 3 的h r p 序列比 对，其同源性达9 9 9 。 2 利用i n v i t r o g e nc o r p o r a t i o n 提供的p i c h i ap a s t o r i s 表达系统，采用电转化 方法转化了p i c h i ap a s t o r i s g s l l 5 ，并在p i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 宿主细胞中成功地分 泌型表达了h r p ，获得了具有生物活性的h r p 。p i c h i ap a s t o r i s 表达系统能够在甲醇诱 i v 辣根迁曩，佑物酶基因的表达、进| 化爰其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 导下高水平、分泌型表达辣根过氧化物酶。p i c h i ap a s t o r i s 表达系统以a o x l 基因启动 子为外源蛋白质表达的启动子，h r p 整合到了p i c h i ap a s t o r i s 宿主细胞的a o x i 中， 整合的p p i c z a - a h r p 表达质粒载体的a - 引导序列在合成的h r p 的n 一末端编码旷引导 肽，h r p 随宿主细胞a o x l 基因的表达而高水平表达。实验结果显示，h r p 与分泌引导序 列被正确地融合，表达的h r p 分泌到了p i e h i ap a s t o r i sg s l l s 宿主细胞外。 3 h r p 催化苯胺类单体聚合反应是在h 2 如作为氧化性底物存在下进行的。h 2 0 ：是h r p 的自杀性底物，在反应过程中抑制h r p 活性或使i t r p 变性失活。利用易错p c r 技术 ( e r r o r p r o n ep c r ) 和交错延伸重组技术( s t e p ) 构建h r p 突变文库，在p i c h i ap a s t o r i s 表达系统中定向进化h r p ，获得了进化h r p l 7 3 2 。 第一轮进化，采用易错p e r 技术构建了h r p 突变基因文库。筛选并获得了三株可表 达h 。o ：耐受性h r p 的突变菌株h r p 3 4 6 、h r p 2 3 2 和i t r p 3 - 1 7 。在第二轮进化中，采用了s t e p 技术，利用第一轮进化获得的三个突变子的h r p 为模板，构建了h r p 突变基因文库，筛选 并获得了可表达具有较高h 如耐受性h r p 的突变菌株h r p l 7 - 3 2 。采用电转化法转化p i c h i a p a s t o r i s 酵母细胞，构建表达文库大大提高了转化的效率，尽可能地满足了构建高库容 量突变文库的需求。 获得的进化t t r p l 7 - 3 2 ，经h ：0 2 处理后，残留活性为6 3 8 9u 1 ，为未突变野生型i i r p 的1 4 7 倍( l = 1 4 7 ，t ：= 0 8 1 ) 。h r p l 7 - 3 2 对h 。0 2 耐受性远远高于未突变野生型h r p ， 而其催化效率并未降低。突变表型检测结果显示获得的可分泌表达i t r p l 7 3 2 的突变子 h r p l 7 3 2 的突变表型为m u t + ，可在甲醇诱导下分泌表达进化h r p l 7 3 2 ，表达水平为 0 9 r a g 1 。发酵液中进化h r p l 7 3 2 催化氧化a b t s 的活性达到7 4 5 u 1 ，是野生型h r p 活 性的2 7 倍，进化t t r p l 7 3 2 的活性表达水平明显提高。进化i t r p l 7 - 3 2 催化对苯二胺聚 合反应结果显示：在 b 0 。存在下，进化t t r p l 7 3 2 可在非水相溶剂中催化氧化对苯二胺 发生聚合反应，反应产率为8 2 ；而未突变的野生型h r p 催化的反应产率为5 8 。 4 对重组的突变菌株h r p l 7 3 2 的发酵和产酶条件及h r p l 7 3 2 的分离纯化进行了 初步的探讨。在甲醇诱导下，重组的突变菌株h r p l 7 - 3 2 可分泌型表达i t r p l 7 3 2 。当甲 醇浓度为0 7 5 m l l 、p t t 6 0 、发酵4 8 小时后毕赤酵母h r p l 7 3 2 突变菌株细胞生长和产 h r p l 7 3 2 活性达到最佳。从发酵液中，分离纯化了进化h r p l 7 3 2 。h r p l 7 3 2 的总纯化 倍数为7 2 9 ，总收率为6 2 7 ，分子量在6 6 2 一1 1 6 0k d a 范围内。提取和纯化过程中， 酶的纯度提高、收率降低。e n d o d 内切酶去糖基化分析结果显示。h r p l 7 - 3 2 在p i c h i a v 辣根过氧化物酶基因的表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 p a s t o r i sg s 1 1 5 中表达过程中被不同程度的糖基化。 5 探讨了进化h r p l 7 - 3 2 催化氧化合成聚对苯二胺及其部分性质，对合成的聚对苯 二胺进行了表征。主要研究内容包括h r p l 7 3 2 催化氧化对苯二胺的反应动力学、 h r p l 7 - 3 2 的稳定性、聚对苯二胺的结构表征。 进化h r p l 7 - 3 2 催化氧化对苯二胺的最适温度为4 5 5 5 ，最适p h 值为6 0 ，最适 h 她浓度约为2 5 栅，酶催化反应的v m a x 为1 1 5 1 1 0 1 m m o l m i n 一m g ，k m 为0 7 6 洲。进化h r p l 7 3 2 经较高浓度h 2 0 ：处理后，其残留活性远远高于野生型h r p 。进化 h r p l 7 - 3 2 的酸碱稳定范围为p h5 6 7 0 ：在反应温度低于4 0 c 时h r p l 7 3 2 具有良好的 热稳定性；当i ，4 - - - 氧六环浓度小于2 0 h r p l 7 3 2 较稳定。与野生型h r p 相比，h r p l 7 3 2 的h 2 0 ：耐受性明显提高，酸碱稳定性、热稳定性以及在有机溶剂中的稳定性并没有降低。 u 、r v i s 光谱、f t i r 吸收光谱、x 一射线光电予能谱( x p s ) 对合成的聚合物的表征结果 显示合成的聚合物为苯环l ，4 一取代型聚对苯二胺，分子量为1 5 2 8 ( 斯) ，分子量分布 系数为1 0 1 2 。研究结果证实了h r p l 7 - 3 2 可以催化氧化合成聚苯胺类化合物。 6 利用进化h r p l 7 - 3 2 催化氧化对苯二胺和丙烯酸发生聚合反应，合成了水溶性聚 对苯二胺一丙烯酸，考察了影响酶催化聚合反应的几个重要因素。聚合反应的最适h 2 0 ： 浓度为0 0 5 ，最适p h 值为6 0 ，丙烯酸与对苯二胺的最适比例为1 ：l ，聚合反应进行 2 4 小时时，聚合反应产率达到最高。合成的聚对苯二胺一丙烯酸具有良好的水溶性。 利用f t i r 光谱、u v - v i s 光谱、x 一射线光电子能谱( x p s ) 、循环伏安法( c y c l i c v o l t a 删e t e r ) 、热重分析等方法，表征了合成的聚对苯二胺一丙烯酸的结构和性能。结 果显示，h r p l 7 3 2 催化对苯二胺和丙烯酸发生聚合反应合成的聚合物为对苯二胺和丙 烯酸的共聚物或更为复杂结构的聚合物。其主要聚合方式为l ，4 一取代型对位聚合，聚合 物结构中含有羧基( 一c o o h ) ，聚合物具有较高的热稳定性( 热降解温度为5 8 9 c ) ，循环 伏安法分析结果显示合成的聚对苯二胺一丙烯酸为具有电活性的聚合物。 三、创新性 1 应用组合化学、分子生物学及分子进化的方法和技术，在体外定向进化h r p ， 改造h r p 分子的结构和性能，并应用于酶催化聚合反应，目前尚未见文献报道。本文 首次探讨了酶定向进化技术在酶催化聚合反应领域的应用。 2 首次以酶催化合成聚苯胺类导电聚合物为目标定向进化h r p ，提高了h r p 的 h 2 0 2 耐受性。获得了具有较高h 2 0 2 耐受性的进化h r p l 7 3 2 ，以及可分泌表达进化 辣根过氧化物酶基因的表达、进化夏其催化苯胺类化合物秉合瓦应的研究 h r p l 7 3 2 的突变菌株。 3 利用r t - p c r 技术，从辣根中克隆了h r p c 3 基因( h r p c 3 ) 。研究了h r p c 3 在 p i c h i ap a s t o r i sg s 1 1 5 中的功能表达。首次在p i c h i ap a s t o r i sg s i l 中分泌型表达 了进化h r p l 7 - 3 2 。 4 首次利用获得的进化h r p l 7 3 2 催化氧化对苯二胺以及对苯二胺与丙烯酸发生 聚合反应，合成了聚对苯二胺和聚对苯二胺丙烯酸。研究了h r p l 7 3 2 催化氧化对苯二 胺的动力学性质及酶的稳定性；研究了影响h r p l 7 - 3 2 催化氧化对苯二胺与丙烯酸发生 聚合反应的几个主要因素以及酶的稳定性，并对合成的聚合物进行了表征。 关键词：辣根过氧化物酶，定向进化，聚苯胺，酶催化聚合反应 v 辣根过氧化物酶基因的表达、进化夏其催化苯胺类化合物秉合反应的研究 a b s t r a c t i b a c k g r o u n da n dm e a n i n g t h e p o l y a n i l i n ei st h ef i r s tc o n d u c t i n gp o l y m e r1 1 】i nt h el a s t2 0y e a r sp o l y m e r i z a t i o no f a n i l i n eh a sr e c e i v e dag r e a td e a lo fa t t e n t i o n ，b e c a u s eo ft h e i rm a n yp o s s i b l ea p p l i c a t i o n si n e l e c t r i c a l , e l e c t r o c h e m i c a l ，o p t i c a lp r o p e r t i e s a n dt h e i r g o o de n v i r o n m e n t a ls t a b i l i t y p o l y a n i l i n ei sc o m m o n l ys y n t h e s i z e db ym e a n so fe l e c t r o c h e m i c a l l y ，c h e m i c a l l y ，e n z y m a t i c p o l y m e r i z a t i o no fa n i l i n eo ri t sd e r i v a t i v e s p r e s e n t l y , e n z y m a t i cs y n t h e s i so fp o l y a n i l i n eh a s b e e n e x p l o r e d a sa nm o r ea t t r a c t i v ea l t e r n a t i v e s y n t h e t i c r o u t et ot h es y n t h e s i so f e l e c t r o n i c a l l y ，a q u e o u s s o l u b i l i t y0 1 o p t i c a l l y a c t i v ep o l y a n i l i n e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( e c l 1 1 1 7 ) m a yo x i d i z ea n i l i n e ，a n di th a sb e e nu s e de x t e n s i v e l yi nt h ec a t a l y s i so ft h e o x i d a t i v ec o u p l i n ga n df u r t h e rp o l y m e r i z a t i o no fa n i l i n e s t h eh r p - c a t a l y z e dp o l y m e r i z a t i o n o fm o n o m e ra n i l i n ew a sc a r r i e do u ti nt h ep r e s e n c eo fh 2 0 2a sa no x i d a t i o ns u b s t r a t e u n f o r t u n a t e l y , h r ps h o w e dl o w e rs t r u c t u r a ls t a b i l i t yi nr e l a t i v eh i g l ic o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 f o ri m p r o v e m e n to ft h ee n z y m a t i cs y n t h e s i s ，am o r ea t t r a c t i v ea l t e r n a t i v er o u t es h o u l d e n h a n c et h et o l e r a n c eo fh r pt oh 2 0 2 a so n eo ft h er a n d o ma p p r o a c h e sf o rp r o t e i ne n g i n e e r i n g , d i r e c t e de v o l u t i o nt e c h n i q u e s h a v ep r o v e nt ob ea ne f f i c i e n tr o u t ef o ri m p r o v i n gt h ep r o p e r t i e so fe n z y m e se v e nw i t h o u t i n f o r m a t i o no ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，t h u sy i e l d i n gan u m b e ro f p r o m i s i n gr e s u l t s i nt h i sp r o c e s s ，d i v e r s ep o o l so ft h em u t a n tl i b r a r ya r eg e n e r a t e di nv i t r ov i a r a n d o mm u t a g e n e s i sa n dr e c o m b i n a t i o no fg e n e s ，f o l l o w e db yd i r e c t e ds c r e e n i n go rs e l e c t i o n w i t ht h eh r pa sa ne u k a r y o t i cp r o t e i n ，o n eo ft h er e q u i s i t e st om o l e c u l a re v o l u t i o ni st h e e x p r e s s i o n i na c t i v ef o r mi nar e c o m b i n a n th o s t t h ee x p r e s s i o no fh r p , w h i c hi s g l y c o s y l a t e da n dc o n t a i n s d i s u l f i d eb o n d s ，h a sb e e nam a j o gt e c h n i c a li s s u ei nt h e d e v e l o p m e n to fi m p r o v e de n z y m ev a r i a n t s t h ee v o l u t i o na n dt h ee x p r e s s i o no f t h eh r p g e n e i ne c o l io ri ns c e r e v i s i a e ，f e wa c t i v ee n z y m e sc o u l db eo b t a i n e do rn o ta b l et os e c r e t et h e f u n c t i o n a le n z y m e t h ep i c h i ap a s t o r i sh o s tc e i l sf a c i l i t a t eg l y c o s y l a t i o na n dt h ef o r m a t i o no f d i s u l f i d eb o n d s ，a n da g ee s p e c i a l l yw e l ls u i t e df o rs e c r e t i o no ft h ef o r e i g np r o t e i n t h e d i r e c t e de v o l u t i o no fh r p ，f o rs p e c i f i ca p p l i c a t i o n s ，h a sb e e np e r f o r m e di ne c o i l ，s o m eo f t h e mh a v eb e e ne x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s ，w h e r et h e yg i v er i s et o5 4 - f o l d so fh r p 辣根过氧化物酶基因的表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 a c t i v i t yt o w a r da b t s 【2 ，2 - a z i n o b i s ( e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 一6 一s u l f o n a t e ) h e r e i ni sd e s c r i b e dav i t r od i r e c t e de v o l u t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei np f 曲缸 p a s t o r i sf u rt h ei m p r o v e m e n to ft h et o l e r a n c eo fh r pt oh 2 0 2 ，a i m e dt ot h ea p p l i c a t i o ni n s y n t h e s i so fp a n i e r r o r - p r o n ep c r a n ds t a g g e r e de x t e n s i o np c r ( s t e p ) w e r eu s e dt o g e n e r a t em u t a n tp o o l s t h ea c t i v ee v o l u t i o nh r pw a se x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 a n dt h ee n z y m a t i cr e a c t i o nk i n e t i c s 、s t a b i l i t i e sa n do t h e rp m p e r t i e so fh r pw e r ea n a l y z e d a l s o i i c o n t e n t sa n dr e s u l t s 1 t h eh r p c 3 g e n e ( h r p ) h a v e b e e nc l o n e da n da n a l y z e df r o ma r m o r a c i am s t i c a n a i n t h i sp r o c e s s ，w ef i r s t l yo b t a i n e dt h ee d n ao ft o t a la r m o r a c i am s t i c a n am r n au s i n g r t - p c rt e c h n o l o g y ，a n dt h e no b t a i n e dt h eh r p c 3g e n eu s i n gd e s i g n e dp r i m e rb yp c r t e c h n o l o g y t h ec l o n e dh r p c 3g e n ew a sc l o n e di n t oe c o l it o p l 0u s i n gp p i c z a - ab y c h e m i c a lt r a n s f o r m a t i o n c o m p a r i n gw i t ht h es e c q u e n c eo fh r p c 3 【g i ：2 1 7 9 3 3 1f r o mn c b a g e n e b a n k , t h eh o m o l o g o u so fc l o n e dh r p c 3w a s9 9 9 2 t h ec l o n e dh r p c 3 g e n gw a st r a n s f o r m e ds t w , c e s s f u i l yi n t op i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 ， u s i n gp i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e m ( f r o mi n v i t r o g e nc o r p o r a t i o n ) a n dt h ec l o n e d h r p c 3g e n gw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi np i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 a c t i v eh r pw a si s o l a t e d a n dp u r i f i c a t i o no b t a i n e df r o mc u l t u r i n gm e d i a , t h ee x p r e s s e dh r pw a ss e c r e t e do u to fp i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 3 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s es h o w sal o wc a t a l y s ea c t i v i t yt o w a r dp o l y m e r i z a t i o ni nt h e p r e s e n c eo far e l a t i v eh i g hc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 i no r d e rt oo b t a i nm u t a t i o n a lh r p ，w h i c h w e r es u i t e df u ru s i n gi ne n z y m a t i cp o l y m e r i z a t i o ni nt h ep r e s e n c eo fh 2 0 2 ，ad i r e c t e d e v o l u t i o no ft h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew e r em a d ei np i c h i ap a s t o r i $ i nt h ep r o c e s s ，t h e e r r o r - p r o n ep c rt e c h n o l o g ya n ds t e pw a se m p l o y e ds e p a r a t e l yt oc r e a t em u t a t el i b r a r y a f t e r t w or o u n do fd i r e c t e de v o l u t i o n ，t h es e l e c t e db e s tm u t a n th r p l 7 - 3 2 ，w h i c hi se n h a n c e dt h e t o l e r a n c et oh 2 0 2 ，s h o w e da1 4 7 一f o l di n c r e a s ei nt h er e s i d u a la c t i v i t y ( 6 3 8 9u l ，3 2 - - 1 4 7 ， t 2 = 0 8 1 ) c o m p a r e dt o t h a to fw i l d t y p ee n z y m e t h em u t a t ep h e n o t y p eo fh r p l 7 3 2 m u t a n ti sm u t + ，t h em u t a n tc a ne x p r e s s e d s e c r e t e d l yh r p l 7 - 3 2u n d e ri n d u c t i n gb ym e t h a n o l ， t h ee x p r e s s i o nl e v e lr e a c h e d0 9 m g l ，a n da2 7 - f o l da c t i v i t yo fh r p l 7 3 2h a v eb e e nd e t e c t e d x 辣根过氧化物酶基因的表达，进化夏其催化苯胺类化舍物秉合反应的研究 i nc u l t u r i n gm e d i a ，c o m p a r i n gw i t hw i l d - t y p eh r pr e c o m b i n a t i o ns t r a i n 。 4 t h ec u l t u r i n gc o n d i t i o na n ds e c r e t e de n z y m ec o n d i t i o no f m u t a t eh r p l 7 - 3 2 r e c o m b i n a t i o ns t r a i nh a v eb e e nr e s e a r c h e d ，a n dt h eh r p l 7 - 3 2w a si s o l a t e da n dp u r i f i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o no ft h eg r o w t ha n ds e c r e t i o nh r p l 7 - 3 2o fr e c o m b i n a t e dp i c h i a p a s t o d sg s l l 5b ym u t a t eh r p l 7 3 2 ，i s0 7 5 m l lm e t h a n o l ，p h 6 0a n dc u l t u r i n gt i m ef o r4 8 h o u r s t h et o t a lp u r i f i c a t i o nf o l do fh r p l 7 - 3 2i s7 2 9 ，a n dt h et o t a lr e c o v e ry i e l do fh r p l 7 3 2 i s6 2 7 t h em o l e c u l a rw e i g h to fh r p l 7 3 2i sr a n g i n gf r o m6 6 2t o1 1 6 0k d a h r p l 7 - 3 2 a r eg l y c o s y l a t e di nd i f f e r e n td e g r e e ni ne x p r e s s i o n 5 t h e1 ，4 - d i a m i n o b e n z e n e ( p p d ) w a so x i d i z e da n dp o l y m e r i z e du s i n gh r p l 7 3 2i na m i x t u r eo f p h o s p h a t e b u f f e ra n d o r g a n i cs o l v e n t , a n d t h es t r u c t u r eo f p o l y - 1 ，4 - d i a m i n o b e n z e n ew a sc h a r a c t e r i z e db yaf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r u m ( 删e t c t h e s y n t h e s i z e dp o l y - 1 ，4 - d i a m i n o b e n z e n ew a sc o m p o s e do fp a r a - d i r e c t e du n i t s ，a n dm o l e c u l a r w e i g h tw a sa b o u t1 5 2 8 ( m w ) ，t h ep o l y d i s p e r s i t ya b o u t1 0 1 2 a n dt h ee n z y m a t i cr e a c t i o n k i n e t i c sa n ds t a b i l i t i e so fh r p l 7 3 2w e r ea l s oa n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ek m v a l u eo fh r p l 7 3 2i s0 7 6m m ，t h ev m a xi s1 1 5 1 x 1 0 2m m o l m i n d m g 1 ，o p t i m u m c o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2i s2 5m m ，t h eo p t i m u mp hv a l u ei s6 0 ，a n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e i s4 5 - 5 5 u n d e rt h er e a c t i o nc o n d i t i o n t h es t a b i l i t yc o n d i t i o n so fh r p l 7 3 2w a gp h 5 6 7 0 、r e a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 、a n d2 0 c o n c e n t r a t i o no fd i o x a n e t h es t a b i l i t i e so f h r p l 7 3 2i sm o r eh i g h e rt h a nt h a to f w i l d h r p 6 h r p l 7 - 3 2c a t a l y z e dp o l y m e r i z a t i o no f1 , 4 - d i a m i n o b e n z e n e ( p p d ) a n da c r y l i ca c i d h a v eb e e nc a r r i e do u ti na na q u e o u sb u f f e r a n dt h ec o n d u c t i v i t y , u v - v i ss p e c t r a ，f t - i r s p e c t r a ，x - r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) ，a n dt h e r m o - g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ( t g a ) o f t h er e s u i t i n gp o l y m e rh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h es y n t h e s i z e dp o l y m e r ( p a n 0i sas e l f - d o p e d p o l y ( 1 ，4 - d i a m i n o b e n z e n e a c r y l i ca c i d ) w i t h1 , 4 - d i s u b s t i t u t e da r o m a t i cr i n g , a n ds h o w s e l e c t r o - a c t i v i t y , a q u e o u s s o l u b i l i t y , a n dh i g h e rd e c o m p o s i t i o nt e m p e r a t u r e ( 5 8 9 ) t h e p r o p e r t i e sa n dy i e l do fp a n lh a v eb e e nf o u n dt ob ed e p e n d e do nt h ep ho ft h eb u f f e r , t h e c o n c e n t r a t i o n so fh 2 0 2u s e d , t h er a t i oo ft h ep p dt o a c r y l i ca c i d ，a n dt h et i m e o f p o l y m e r i z a t i o ne t c 。 x l 辣根过氧化物酶基因的表迭、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究 i n n o v a t i o n 1 u s i n gt h et e a c h n o l o g ya n dm e t h o d so f c o m b i n a t o r i a lc b e m i s t r y 、m o l e c u l a rb i o l o g ya n d p r o t e i nd i r e c t e de v o l u t i o n ，e v o l v e da n di m p r o v e dt h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t yo fh r p , a n d a p p l i c a t i o ni ne n z y m a t i cp o l y m e r i z a t i o n ，h a sn o tb e e nr e p o r t e di nl i t e r a t u r e s 2 t a k i n gt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fc o n d u c t i n gp o l y a n i l i n e sa sas p e c i f i ca i m ，f i r