（微生物学专业论文）北极海水中可培养寡营养细菌多样性研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 珊i i ii i ill ll l fnl ll lj i i f , , i i i i i i i i i i i i i i l l l | | y 18 9 9 0 6 5 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：和躲 日期：k 1 1 年r 月 7 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：书掘讫 e l 期：h 1 1 年s 月毒1e l 孙魏奶 7 0 ) 、低温( 9 ) 、低p h ( 1 5 ) 、高压( 4 0 0 a t m ) 、寡 营养等环境。然而，目前北极地区的气候与环境正在经历着巨大的变化，全球变暖 现象已经波及到北极，全年冰冻的冰川开始融化。气候的变化必然带来生态环境的 巨大变化，必然造成部分珍稀物种的灭绝。澳大利亚的古生物学家约翰阿罗伊经 过对l o 万块收集自世界各地的化石的研究发现，我们正处于新一轮生物大灭绝的 酝酿时期。 1 2 北极海洋中微生物资源的开发利用概况 极端微生物具有产生例如：抗冻物质、多不饱和脂肪酸、抗紫外辐射物质、抗 菌物质、抗肿瘤物质、低温酶等新型生物活性物质的潜能，被称为“新型天然药物 的潜在来源 ，它们在新药物开发、新保健品开发、新型食品开发以及环境保护等 方面具有巨大市场。目前研究表明，海洋微生物大约有1 0 0 万种，但是目前分离纯 化出来的可培养微生物却不到海洋微生物种类总量的1 。随着生物技术的迅猛发 展，对极地微生物的研究日新月异。利用基因工程技术来改造极端微生物的基因， 从而获得预期的微生物菌种。 2 北极海水中微生物研究概况 2 1 微生物多样性研究方法 微生物多样性研究，不仅是微生物学进入新的发展时代，更是生物多样性科学 发展的巨大进展汜，它在微生物遗传研究b 、微生物新物种资源开发方面等都 发挥着愈来愈大的作用。最早对微生物多样性开展的研究是显微镜的发明者列文虎 克利用显微镜进行的，之后科赫建立了微生物的纯培养技术是微生物学发展的里程 碑。但是这些传统观察、分离纯化技术具有明显的局限性，它们不可能全面而且准 确的反映出极地海洋微生物的多样性和北极海洋中微生物生态系统的结构与功能。 而现代分子生物学技术则打破了这种局限性，虽然应用分子生物学要求技术很高， 但是它能全面反应遗传信息的差异性。目前微生物多样性的每个单一研究方法已经 成熟，但是每一个单一方法都有本身的局限性。只有将不同研究方法进行组合优化， 才能更全面更好的反应微生物群落本身的多样性信息，但目前综合的微生物多样性 研究并未成熟d 。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 微生物多样性主要分为四个层面的研究：遗传多样性、生理多样性、物种多样 性、生态多样性，本文主要研究遗传多样性。对于北极海洋微生物而言，分离纯化 得到的菌株非常少，而且不同种微生物在形态结构上的差异不像宏观生物明显，因 而本文对微生物多样性的研究主要集中于研究遗传多样性的分子生物学方法。现代 分子生物学分析微生物多样性的方法主要有：核酸的探针杂交技术、1 6 s r d n a 克隆 文库方法、d g g e 等基因指纹技术等哺1 ，目前最常用的技术有：变性梯度凝胶电泳 ( d g g e ) 、温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 、限制片段多态性分析( i 讧l p ) 、荧光 原位杂交( f i s h ) 、1 6 s r d n a 克隆文库等。 变性梯度凝胶电泳：相同长度的d n a 片段因为其碱基序列组成不同决定了它 的解链区域和解链温度不同。而d g g e 胶则是加了变性剂( 尿素和甲酰胺) 形成变 性梯度的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度逐渐增加，当d n a 迁移到最低解链区域所 需变性剂浓度时该区d n a 域解链，d n a 迁移率降低，因此不同序列的d n a 片段 出现了不同带型。温度梯度凝胶电泳：是d g g e 的衍生技术，所不同的是，d g g e 所用的是变性梯度，而t g g e 用的则是温度梯度，当d n a 片段迁移到最低解链温 度时同样会解链，形成不同的条带。限制片段多态性分析：r f l p 是最早发展的一 项d n a 标记技术，它是利用不同d n a 片段的限制性片段长度不同，从而用限制性 内切酶切割分型。荧光原位杂交：设计核酸探针，将核酸探针与待检测d n a 杂交 经过变性退火复性，则探针会与同它是同源互补的序列形成靶d n a 核酸探针杂 交体，将探针的某种核苷酸做报告分子标记，则该报告分子会与荧光素标记了的特 异亲和素发生免疫反应，经荧光检测体系可对待检测的d n a 进行定性、定量或定 位分析。1 6 s r d n a 克隆文库：提取样品中微生物基因组总d n a ，扩增其1 6 s r d n a 全长片段，构建载体将目的片段克隆至细胞构建文库，对阳性克隆进行r f l p 分析， 分析其基因指纹图谱，对阳性克隆子分型，代表序列测序，从而获得文库多样性信 息。 目前对微生物多样性分析技术比较成熟且最常用的是p c r d g g e 技术和构建 1 6 s r d n a 克隆文库法，p c r - d g g e 技术比较直观快速，相对来讲比较适合定性分 析。而1 6 s r d n a 克隆文库法虽然费时费力，但是相对精确，比较适合定量分析。 本文将1 6 s r d n a 克隆文库法和p c r o d g g e 技术结合，取长补短达到相对完美。 2 2 寡营养细菌的分离纯化方法 自然界中，微生物的生存方式并非单一，而是各个种类混杂的生活在一起难以 分离。微生物的纯培养是指从复杂的生存环境中将一种细胞传代培养，从而得到单 3 一的后代。微生物分离纯化的方法较多，常用的技术主要有：平板划线分离法、稀 释倒平板法、单孢子或单细胞分离法、利用选择性培养基分离法。 平板划线分离法：在无菌操作台上，灼烧接种环待接种环不烫，用环挑取少量 待分离样品，在无菌平板上分区划线，第一针划完后灼烧接种环，待接种环不烫后 再划线，随着划线次数增加，微生物细胞将逐步分散，经过适宜条件培养后可得到 纯化菌落。稀释倒平板法：用无菌水将待分离样品做梯度稀释，取少量梯度稀释液 分别与溶化并冷却的培养基混匀，倒平板，待平板凝固干燥后，适宜温度培养，便 可在稀释梯度适宜的平板上得到单菌落。单孢子或单细胞分离法：在显微镜下，用 孢子分离器或者用特制的毛细血管取下单个孢子或者单个细胞，置于培养基中适宜 条件培养。利用选择性培养基分离法：不同微生物对化学试剂、抗生素等具有不同 的抗性，利用微生物这种特性制选择性培养基，在培养基中添加某种微生物具有抗 性而能够抑制其它微生物生长的试剂，以期获得目的菌株。 据有关研究表明：在庞大的环境微生物库中，只有很少部分微生物能够在实验 室成功分离培养，绝大部分微生物不能被成功培养。可培养得到的微生物占环境微 生物总量的0 0 0 0 1 - - - 1 5 ，尤其是本研究中的海洋寡营养细菌更是难以分离纯化 培养。可见传统的实验室微生物分离纯化培养技术存在着显而易见的局限性，针对 难培养和不可培养微生物的培养，k a e b e r l e i n 提出了原位培养技术。k a e b e r l e i n 认为微生物自然生长环境无法模拟这与实验室培养条件有差别，这成为微生物在实 验室条件下分离培养的关键。k a e b e r l e i n 设计了独特的小室原位培养法，从而获得 一些运用经典方法无法培养的菌株。本研究借鉴了k a e b e r l e i n 的原位培养法，以期 获得几株极地菌株。 2 3 海洋中微生物多样性的研究现状 浩瀚海洋占地球表面积的7 1 ，其中蕴藏着及其重要的微生物宝库。而北极地 区的浩瀚太平洋作为独特的微生物生存环境，蕴藏了更为稀有珍贵的微生物资源。 自从2 0 世纪8 0 年代，海洋生物技术兴起以来，世界各国均积极的对海洋微生物资 源的发掘利用开展研究。目前，各国对海洋微生物资源的开发应用初见成效，其中 美国遥遥领先，主要应用在：海洋活性物质药物、高端化学产品、环境保护、生物 治理等方面，例如劳伦斯利弗莫尔用海藻研制出“海胶”，该材料属于可降解产 品将来有望替代聚苯乙烯。而日本则致力于：生物活性物质开发、生物磁学、食品 添加剂、表面活性剂等的研究应用。相对于较发达国家，我国的海洋微生物开发起 步晚、技术不够成熟。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 4 北极海水中微生物的纯化分离现状 北极海洋微生物由于生存环境的特殊性生存竞争非常激烈，因而形成了不同于 陆生微生物的强防御能力和强识别能力，这些独特的能力是产生新型物质的基础。 虽然北极是微生物资源库，但是，目前已发现并成功分离培养的极端微生物却很少， 仅占北极细菌总量的0 0 0 1 - - - 1 5 噶。然而，随着人类的进步，海洋环境污染也 日益严重，赤潮等现象屡屡发生，海洋环保刻不容缓，积极分离培养保护海洋微生 物的遗传资源成为当务之急。j a n n a s c h 在太平洋深海底的火山口附近发现了一种氧 化硫细菌，该细菌是初级生产者。j o s e 从海底分离出一株玫瑰杆菌属( r o s e o b a c t e r ) 的细菌，它具有转化硫化物功能。我国目前已经建立了专门针对微生物菌种保藏的微 生物菌种保存库，用以收集和保藏各种菌株以保护各地宝贵的微生物遗传资源。 2 5 北极海水中微生物研究的发展前景 在海水中微生物从表层到深海污泥分布广泛，微生物多样性非常丰富，而且生 物含量巨大。极地微生物在北极的极端生存环境下演化出了它与众多环境中微生物 不同的生理生化特征，极地微生物在人们对医药开发、保健品开发、环境保护等方 面具有重要意义，而且它们还是北极海洋中的初级生产者，是海洋生态系统的重要 组成部分。极地环境下生存的极端微生物堪称生命的奇迹，它们的环境适应能力达 到了生命的极限。对这种古老而神秘生命的研究，为揭示极端生命形式的秘密甚至 对探索星球生命的奥秘都具有重大意义。 3 本研究的目的及意义 生物多样性不仅为人类提供了必要的物质资源，而且还为人类提供了赖以生存 的广阔自然环境。而极地广阔自然环境的海洋系统中广泛存在着各种各样类型的特 有微生物。这个巨大的微生物库是北极地区独特的生态系统的组成部分，北极具有独 特的环境，历经漫长历程演化出了具有独特代谢能力的微生物，它们能产生大量陆地 微生物所不具备的天然活性物质【9 】。但是，随着人类工业化推进极地上空臭氧的含 量在逐渐减少，强射线的作用正在不断威胁微生物的生存。u v 轻微变化能使极地 腰鞭毛虫死亡率上升【1 0 l ，气候变暖导致一系列北极环境的变化【1 1 、1 2 j ，这些变化会对 北极的分解者产生深远影响。因此，分离培养极地寡营养细菌意义深远。寡营养细 菌生长缓慢且生存环境难以模拟，因此分离培养较困难，目前海洋中的绝大多数微 生物都还未获得纯培养引，但是用活菌镜检计数法检测结果显示海水中占9 0 以上 5 硕士学位论文 m a s t e r s r h e s i s 的细菌都是活的【1 4 】。传统的微生物分离方法是采用标准的实验室培养方法，该方法 用在分离作为早期生命活化石的寡营养细菌时效率显得低下，会丢失大部分宝贵的 生物资源。后来研究发现，通过稀释培养法能从用传统培养方法己证明无菌的材料 中分离出大量的专性和兼性寡营养细菌【l5 1 6 1 。本研究则采用稀释寡营养培养法， 以期获得海洋可培养微生物i l 引。 对海洋微生物分子生态学的研究有助于加深人类对海洋微生物的认知，丰富海 洋微生物基因资源库【1 9 1 。以1 6 s r d n a 序列分析为基础的分子生态学的指导作用尤 为重要。1 6 s r d n a 文库和d g g e 是两种分子生态学最常用的研究微生物多样性的 方法，对可培养寡营养细菌研究尤为重要，它们克服了细菌分离遗漏的问题1 2 。 d g g e 较直观【2 ，但不适于定量分析。而1 6 s r d n a 文库能对微生物多样性准确定 量，却不直观。目前，随着d n a 测序技术的迅猛发展，建立环境中微生物的1 6 s r d n a 克隆文库法已经成为更有效的表征微生物多样性的手段。 本研究以第一代可培养菌混合液1 6 s r d n a 文库构建和p c r - d g g e 技术分析，初 步揭示北极n 8 3 站和c 1 9 站海水中可培养寡营养细菌菌落的种类和多样性。根据文库 中特殊菌的形态等特征，使菌株分离工作有的放矢。本研究为海洋寡营养细菌的快 速准确分离提供理论依据。 4 本研究的思路 本研究设计实验思路如下： 6 第二章结合1 6 s r d n a 文库法和p c r - d g g e 法研究 北极海水中可培养寡营养细菌多样性 1 实验材料 1 1 水样 本研究所用的实验样品为本实验 室的陈吉刚老师于2 0 0 8 年7 - - - 9 月参加 中国第3 次北极科考时带回，本次考察 范围见图2 所示。水样采自北极n 8 3 站( 1 5 0 。5 1 8 7 w ，8 3 。0 0 6 6 n ) ， c 1 9 站( 1 5 9 。5 8 7 1 w ，7 1 。2 6 8 0 m 。 1 2 菌株、载体 本研究克隆所用材料及培养设备 如下： o 图2中嚣第三次j 极科考站位蓬一 f i g2i n v e s t i g a t i o ns l a t i o n so f t h e t h i r d a r c t i cr e s e a r c he x p e d i t i o no f c h i n 和 7 =lli“f：j；l i i l l 一 鍪鬈纛霪麓慈鬟鬟i黪么1壤滋滋 1 3 仪器和试剂 本研究所用仪器以及试剂等如下： 实验仪器、试剂等采购公司 水浴锅 基因突变检测系统 低温冷冻离心机 纯水化系统 p c r 仪 低速离心机 微量移液器 凝胶成像系统 8 0 冰箱 4 0 冰箱 0 2 2 9 m 滤膜 真空抽滤系统 微量进样器 a p s 甘油 e xt a q l at a qd n a 聚合酶 t 4d n a 连接酶 d n am a r k e r r n a s e x g a l i p t g a m p 溶菌酶 蛋白酶k 胰蛋白胨 酵母浸出物 n a c l 琼脂糖凝胶回收试剂盒 琼脂糖 无水乙醇 硝酸银 4 0 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 去离子甲酰胺 尿素 基因组d n a 提取试剂盒 琼脂糖凝胶回收试剂盒 l a u d ac o m p a n y b i o r a dc o m p a n y s o r v a l lh e r a e u sc o m p a n y m e r c km i l l i p o r ec o m p a n y e p p e n d o r fb i o t e c hc o m p a n y e p p e n d o r fb i o t e c hc o m p a n y e p p e n d o r fb i o t e c hc o m p a n y b i o r a dc o m p a n y n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f i cc o m p a n y s a n y oc o m p a n y w h a t m a nc o m p a n y m e r c km i l l i p o r ec o m p a n y 上海生工生物工程技术服务有限公司 s i g m a - a l d r i c h s i g m a - a l d r i c h t a k a r ac o m p a n y t a k a r ac o m p a n y t a ka r a c o m p a n y t a k a r ac o m p a n y 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 o x o i dc o m p a n y o x o i dc o m p a n y 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 b i o w e s t 国药集团药业股份有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 t a k a r a 8 1 4 药品配制 本研究所用主要试剂配方： 试剂名称配方及终浓度 a m p 溶液储存液 x g a l 溶液储存液 i p t g l b t e 5 0 x t a e 5 x t b e 灭菌d d h 2 0 水配制成浓度5 0m g m l 用二甲基甲酰胺配成终浓度2 0 m g m l 灭菌d d h 2 0 水配制成浓度5 0m g m l 胰蛋白胨1 0 9 、酵母浸出物5g 、n a c i1 0g ，d d h 2 0 定容至 1 0 0 0m l ，调p h 值至7 0 - 7 2 ， l o 0m m o l lt r i s h c l ，1 0m m o l le d t a ，调p h 值至p h8 0 2 4 2 0 0 0 m gt r i s 碱，5 7 1m l 冰乙酸，1 0 0m l0 5m o l l e d t a ( p h8 0 ) ，d d h 2 0 定容至1 0 0 0m l 5 4 0 0 0 m gt r i s 碱。2 7 5 0 0 9 硼酸，2 0m l 0 5m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，d d h 2 0 定容至1 0 0 0m l 溶液i 溶液h 5 0m m 葡萄糖，1 0m me d t a ，2 5m mt r i s c 1 ( p h 8 0 ) 0 2m m n a o h ，l s d s 溶液i i i 3m m 乙酸钾( 冰醋酸调p h 值至4 8 ) d g g e 变性胶银染试剂配方： 试剂名称配方 9 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 1 5p c r 扩增引物 1 6 s r i a 基因全长引物： 引物名称 序列 8 f5 a g a g t t t g a t c c t ( c t c a g 一3 1 4 9 2 r5 ，- g g t t a c c 订g t l a c g a c t t - 3 1 6 s r r n a 基因v 3 一v 5 区引物： 引物名称：序列 3 4 l f5 ，- t c c c g c c g c c c c c g c c c g c c t a c g ( g a g g c a g c a g 3 9 0 7 l 5 ，- c c g t c a a t t c c t t t g a g t t ，】一3 i 3 4 1 f ( g c )5 g c c c g c c g c g c c c c g c g c c c g t c c c g c c g c c c c c g c c c g c c t a c g g g a g g c a g c a g 一3 2 实验方法 2 1 北极海水中寡营养细菌1 6 s r d n a 文库的构建 2 1 1 样品采集 本研究样品为本实验室的陈吉刚博士于2 0 0 8 年7 9 月参加中国第3 次北极科 考带回，水样用s e a 9 p l u s c t d 系统采集。n 8 3 站水样采自北极n 8 3 站( 1 5 0 。5 1 8 7 7 w ，8 3 。o o 6 6 7 n ) ，c 1 9 站水样采自北极c 1 9 站( 1 5 9 。5 8 7 1 7 w ，7 1 。2 6 8 07 。 2 1 2 北极海水中寡营养细菌的富集培养 采集北冰洋水样5 0 0 m l ，在无菌条件下将海水抽滤至聚碳酸脂膜( 孔径为0 2 i t m ) 上。用采自北极的1 5 m l 无菌原位海水反复冲打洗涤碳酸脂膜，然后加入终浓度为 l 的放线菌酮后将液体移入无菌锥形瓶中。置于4 c 冰箱中静置1 2 h ，预处理完毕 之后将液体转移到2 0 m l 的连续培养透析室中。将透析室依次放入到装有原位海水 的连续培养装置中，4 c 连续旋转培养3 个月眨2 。无菌条件下抽取透析室中培养 的细菌，将细菌抽滤至硝酸纤维素膜( 孔径为0 2 2 i t m ) 上，正向贴于预先准备好的 基础海水琼脂培养基上，2 c 冰箱中培养4 个月，于解剖镜下观察菌落的生长情况， 菌落逐个长出且生长良好。将膜上菌落随机接种于寡营养琼脂上，8 c 冰箱中培养 1 5 天左右。长好的菌落用无菌超纯水洗脱，2 0 冰箱中保存备用。 1 0 2 1 3 样品的预处理 将洗脱之后的细菌合并于5 0 m l 无菌离心管中，放于离心机中1 ，2 0 0 r m i n 离 心1 0 m i n ，弃去上清。用l m l 无菌d d h 2 0 将沉淀悬浮，将液体移至1 5 m l 无菌e p 管中，再次用l ，2 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，弃去上清，沉淀便是实验所用总细菌。 2 1 4 细菌基因组d n a 的提取 用基因组d n a 提取试剂盒，提取n 8 3 ，c 1 9 两个站位的细菌基因组总d n a 。 具体方法见说明书。 2 1 5 细菌基因组d n a 的p c r 扩增 1 6 s r r n a 基因全长序列p c r 扩增程序如下： 16 s r r n a 基因v 3 v 5 区p c r 扩增程序如下： 本研究p c r 体系( 5 0 9 l 体系) 如下： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 书。 2 1 6p c r 扩增产物的回收纯化 采用琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收p c r 产物，以备克隆运用。具体方法见说明 2 1 7 氯化钙法制备大肠杆菌受态细胞 制备方法如下： 从大肠杆菌d h 5 盔平板中挑取一个单茵落，接种于3m ll b 液体培养基中，3 7 c 2 0 0r i n i n 剧烈振荡培养过夜，1 ：1 0 0 转接到装有5 0m ll b 的盐水瓶中，继续培养约 3h 。至o d 翰值0 3 左右收集茵体。在在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰 预冷的5 0m l 聚丙烯离心管中，冰上放置3 0r a i n ，于4 4 0 0 0r m i n 离心l om i n 。 弃上清，将离心管倒置1r a i n 使残留培养液流尽。加1 0m l 冰预冷的0 1m o l lc a c l 2 重悬沉淀，冰浴3 0 m i n 后，4 4 0 0 0r ，m i n 离心l o m i n 。弃上清，沉淀中加入2m l 用冰预冷的0 1m o l ；lc a c l ：重悬。悬浮的惑受态细胞可马上用于转化( 置于4 冰 箱可使用1 周) 。如长期保存，则需加入无菌甘油至终浓度为1 5 ，分装0 1m l 詹， 7 0 冰箱保存备用( 最长嘟艮3 个月) 。一 2 1 8 目的片段与载体的连接及转化 本研究克隆实验如下： 1 ，在无菌操作台上，于1 5 m l 无菌e p 管中加入p m d l 8 tv e c t o rl “l 、纯化 d n a 3 t l 、无菌d d h 2 0 1 p l 、s o l u t i o ni5 p l 。混匀，短离。 2 ，将混合液置于低温连接仪中，1 6 连接反应3 0 m i n 。 3 ，反应完毕之后，将液体移至1 0 0 1 t l 感受态细胞，冰浴3 0 m i n 。 4 4 2 水浴，热击4 5 s ，立即置冰上l m i n 。 5 ，加入3 7 c 预热的液体l b 培养基9 0 0 p l ，3 7 c2 2 5 r p m m i n 震荡培养l h 。 6 ，取6 0 0 i t l 细胞培养液，涂布于x g a l i p t g a m p 的l b 选择培养基上。待平 板干后，倒置于3 7 培养箱中，培养大约1 6 h 。 7 ，挑取平板上白色菌落进行鉴定。 2 1 9 重组质粒的鉴定 本研究采用碱裂解方法小量提取质粒旺引： 1 ，挑取转化平板上白色菌落接种于5m ll b 灭菌液体培养基中，放在3 7 2 2 5 r m i n 震荡培养箱中培养过夜。取培养好的菌液lm l 于1 5m l 灭菌e p 管中，置于 台式离心机中，1 2 0 0 0r m i n 离心1m i n ，弃去无菌体的上清液。 1 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 ，事先将碱裂解溶液i 放置冰上预冷，加1 0 0 9 l 溶液i 于上述离心的含菌体 e p 管中，涡旋充分混匀。置于冰上，冰浴1 0m i n 。 3 ，事先将碱裂解溶液i i 放置冰上预冷，取出冰浴的e p 管加2 0 0 1 a l 溶液i i ，轻 轻上下颠倒混匀3 次，放冰上冰浴1 0m i n 。 4 ，事先将碱裂解溶液i i i 放置冰上预冷，取出冰浴的e p 管加1 5 0 p l 溶液i i i ， 轻轻颠倒混匀3 次，置于冰上冰浴1 0m i n 。 5 ，取出冰浴好的e p 管，置于冷冻离心机中，设置4 1 2 0 0 0r m i n ，离心l o m i n 。 6 ，小心将上清液转移至无菌1 5 m l 的e p 管中，加等体积酚氯仿异戊醇 ( 2 5 ：2 4 ：1 ) 、氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 液体分别抽提一次。 7 ，抽提完之后，加0 6 倍体积的异丙醇和0 1 倍体积的5m o l ln h 4 c ( p h 为 5 2 ) 轻轻混匀，室温静置沉淀1 0m i n ，于4 1 2 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 。 8 ，弃上清，用7 5 乙醇洗涤沉淀2 次，室温干燥，加3 0 9 l t e 重悬沉淀。 9 ，加l g lr n a s e ，3 7 作用1h 。 l o ，用与扩增插入片段同样引物再次p c r ，鉴定阳性克隆。 2 1 1 0 代表序列送样测序及序列分析 本研究样品均送至i n v i t r o g e n 公司测序。i n v i t r o g e n 公司测序结果显示，n 8 3 站 6 0 个均测序成功，c 1 9 站5 6 个测序成功。序列输入至g e n e b a n k 数据库中，并通过 运用b l a s t 程序比对对序列进行分析处理。下载与本研究序列有同源性的序列， 本研究采用邻接法( n e i g h b o r - j o i n i n g ，j c ) ，应用4 0 版本的m e g a 软件汜扪绘制序 列系统发育树。用d n a m a n 软件对序列归类，序列相似性 9 7 的归为一个操作 分类单元( o t u ) 。文库覆盖率( c ) 计算公式： c = ( 1 - ( n n ) ) x1 0 0 ( 2 5 ) 其中，n 为序列的克隆总数，n 为o t u 数量。 用p i e l o u 均匀度指数( j7 ) 眨们和用香农威纳( s h a n n o n w e i n e r ) 指数( h ) 眨7 来描述构建的1 6 s r d n a 克隆文库中序列的多样性和均匀性。 h 7 = 一( n i n ) 1 0 92 ( h i n )( 2 7 ) 式中：h7 为多样性指数，n i 为第i 个o t u 包含的序列条数，n 为该文库序列 总数，n i n 为第i 个o u t 中序列条数占文库序列的百分数。 j = h h m 觚h m 觚= j 0 92 s( 2 6 ) 式中：s 为该文库o t u 总数，h m 戤是群落理论上的最大多样性指数。 1 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 北极海水中寡营养细菌1 6 s r d n av 3 一v 。区的变性梯度凝胶电泳 2 2 1寡营养细菌基因组d n a 的p c r 扩增 1 6 s r r n a 基因v 3 v 5 区降落p c r 扩增程序如下( 引物含g c 夹) ： 反应温度反应时间 9 4 5 m i n 94lmin 6556lmin 72lmin 1 0 c y c l e s ( 每一循环降低温度1 ) 9 4 5 5 7 2 2 0 c y c l e s l m i n l m i n l m i n 7 2 1 0 m i n 9 4 9 4 5 4 7 2 3 0 c y c l e s m l n m l n m l n m l n 7 2 1 0 m i n 2 2 2p c r 扩增产物的变性梯度凝胶电泳 使用基因突变检测系统对p c r 反应产物( 1 6 s r r n a 基因v 3 一v 5 区含g c 夹) 进 行d g g e 电泳分离d n a 。使用梯度胶制备装置制备变性剂浓度从4 0 - - - - 6 0 ，6 的 1 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 聚丙烯酰胺凝胶平行胶，变性剂浓度从上向下递增。使用的缓冲液为l t a e 。p c r 产物加样量为2 5 p l ，其中含有1 0 的6 l o a d i n gb u f f e r 。在1 0 0 v 电压下，6 0 电 泳7 h 。电泳后对胶板进行硝酸银染色e b 染色，凝胶成像系统拍照。 2 2 3 条带回收与克隆测序 p a g e 胶剥下之后，用e b 染色。紫外灯下对d g g e 主条带回收，置于t e 中过夜，之后以t e 中的d n a 浸出液为模板p c r 扩增( 引物不带g c 夹) ，产 物经纯化后，转化至e c o l id h 5q 感受态细胞，涂布含有x g a l 和i p t g 的l b 抗 性平板。挑取白色菌落经鉴定后送i n v i t r o g e n 公司测序。 3 结果与分析 3 11 6 s r d n a 文库结果与分析 3 1 1 寡营养细菌的富集培养 采自北极太平洋的海水，经原位旋转透析室培养3 个月之后，过滤至硝酸纤维 素膜上，正向贴于基础海水琼脂上如图3 所示，于培养箱中2 培养。 图3极地寡营养细菌初步培养于基础海水琼脂上 f i g 3 t h ea r c t i co l i g o t r o p h i cb a c t e r i aw e r ec u l t u r e do nt h em e d i u mc o n t a i n i n g a g a ra n di n i t i a ls e a w a t e r 4 个月后，将长好的菌落随机接种于寡营养培养基上，称为极地菌的f l 代。于 8 培养，约1 5 天长出寡营养细菌菌落，如图4 所示。 1 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 图4f l 代寡营养细菌菌落 f i g 4o l i g o t r o p h i cb a c t e r i ac o l o n i e so f n o 1g e n e r a t i o n 3 1 2 基因组d n a 提取 将菌落洗脱液离心沉淀得到高浓度寡营养细菌，提取其总基因组，。图5 为基因 组d n a 琼脂糖凝胶电泳检测结果。本结果显示研究提取的基因组d n a 片段完整无 降解拖带，条带大小为2 3 k b 左右，与预期结果吻合，适合进行1 6 s r d n a 的p c r 扩增。 2 3 13 0 b p m12 图5 北极水样中细菌基因组总d n a 的电泳图 注：1 , c 1 9 站基因组d n a ；2 ，n 8 3 站基因组d n a ；m ，h i n d i l ld i g e s t e d x d n am a r k e r f i g 5e l e c t r o p h o r e s i so fg e n o m i cd n ao f b a c t e r i ai nt h ea r c t i c 1 , c19s t a t i o ng e n o m i cd n a ；2 , n 8 3s t a t i o ng e n o m i cd n a ；m ，h i n di i id i g e s t e d i d n a m a r k e r 1 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 3 1 3p c r 扩增 以3 1 2 提取的基因组d n a 为模板，p c r 扩增全长1 6 s r d n a ( 所用引物为 8 f 1 4 9 2 r ) ，琼脂糖凝胶电泳结果如图6 所示。p c r 扩增产物检测的目的片段长度 约1 5 k b ，与预期结果大小符合。阴性对照组无特异性扩增条带，p c r 扩增产物可 用于1 6 s r d n a 克隆文库的构建。 1 5 0 0 b p 一 123m 一2 0 0 0 b p 图6p c r 扩增1 6 s r d n a 全长片段电泳图 1 , c 1 9 站1 6 s r d n a ；2 ，n 8 3 站1 6 s r d n a ；3 ，对照；m ，d l 2 0 0 0 f i g 6e l e c t r o p h o r e s i so f16 s r d n a 1 , c19s t a t i o n16 s r d n a ；2 ，n 8 3s t a t i o n16 s r d n a ；3 ，c o n t r o l ；m ，d l 2 0 0 0 3 1 41 6 s r d n a 克隆文库的构建 经蓝白斑筛选，从转化平板上随机挑取6 0 个白斑。扩大培养后取1m l 培养液 提取质粒，经p c r 鉴定，挑选含有插入片段的克隆子。本研究中分别挑取6 0 个克 隆进行鉴定，均有插入片段，克隆阳性率达到9 0 以上。经过初步文库容量预测分 析，送i n v i t r o g e n 公司测序。 3 1 51 6 s r d n a 克隆文库分析 经i n v i t r o g e n 公司序列测定，本研究数据初步分析结果显示，c 1 9 站获得5 6 个 有效序列，n 8 3 站获得6 0 个有效序列。应用d n a m a n 软件进行多重序列对比， 构建序列同源树。将相似性大于9 7 的序列归为1 个o t u ，c 1 9 站位分别得到1 2 个o t u ，序列同源树如图7 所示。n 8 3 站位得到1 1 个0 t u ，序列同源树如图8 所 1 7 示。文库信息见表1 ，c 1 9 、n 8 3 站位的文库覆盖率c c l 9 、c n 8 3 值分别为：7 8 5 7 、 8 1 6 7 ，表明本文库的覆盖率较高，能较全面反映样品中细菌的多样性。c 1 9 站的 s h a n n o n w e i n e r 指数、p i e l o u 均匀度指数均高于n 8 3 站，提示c 1 9 站微生物群落结构 更复杂、更稳定。 表1 克隆文库信息 t a b l e1 c l o n i n gl i b r a r yi n f o r m a t i o n 。卜胁 采样深度克隆子数o t u 数覆盖率 ( 意g 翟挚( n c l o u m n i n b e r 曲o fo f o ( n u m t u b e r ) 。v 孑e a g 刖 r c 1 9 n 8 3 0 m 3 0 m 5 6 6 0 1 2 l l 7 8 5 7 2 3 9 8 1 6 7 1 7 3 o 6 7 o 5 0 1 8 c 1 9 一一t c 1 9 ：一一2 c 1 9 _ “一1 2 c 1 9 一一1 9 c 1 9 一# 一2 3 c 1 9 l # 一5 2 c 1 9 一一7 c 1 1 l # 一4 1 c l 9 一一：；4 c 1 s _ 一4 8 c 1 9 一一4 9 c 1 9 一_ 一2 5 c 1 9 # 一2 9 c 1 9 一一3 3 c 1 9 一6 c ：1 9 l # 一3 c 1 9 _ 一3 9 c 1 s - 一3 6 c 1 9 一一4 c 1 9 l 一1 7 c 1 p 一一1 8 c 1 9 l _ 一3 1 c 1 s ，_ 。一3 8 c i t 9 _ # 3 7 c 1 1 l 一4 7 c 1 9 一# 一5 5 c 1 9 l # 一2 2 c 1 9 _ 一一1 0 c 1 9 一一i t 6 ( ：1 9 l 一t 4 c 1 9 一一8 c 1 5 l 一5 0 c 1 9 一5 图7c 1 9 站位序列同源树 f i g 7s e q u e n c eh o m o l o g yt r e eo fc 19s t a t i o n 1 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s n s 3 一1 1 n b 3 一4 2 n 8 3 一2 6 n 8 2 1 一一2 8 n 8 3 一一3 8 n 8 3 一4 6 n 8 3 一4 7 n i l 3 一5 4 n 8 3 一一2 7 n 8 3 一一1 5 n 8 3 一1 0 n 8 3 一一5 7 n 8 3 s n s 3 一1 2 n 8 3 一一一1 3 n 8 3 一拌2 ， n 8 3 一9 n 8 3 4 n 8 3 一3 2 n 8 3 一一3 p n b 3 一一4 5 n b 3 一6 图8n 8 3 站位序列同源树 f i g 8s e q u e n c eh o m o l o g yt r e eo f n 8 3s t a t i o n 2 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 3 1 6 序列系统发育分析 在微生物多样性的研究中对系统发育分析的运用越来越受到科研者的重视和 应用【2 引。目前，对微生物多样性的研究中，一般分析5 0 1 0 0 个阳性克隆子来研究 样品中的优势类群【2 9 l 。 表2c 1 9 站位细菌1 6 s r d n a 克隆文库结果 t a b l e2b a c t e r i a l16 s r d n ac l o n i n gr e s u l t so fc 19s t a t i o n c 1 9 站1 2 个o t u 中a l p h a p r o t e o b a c t e r i a 所占比例最高，达到6 7 8 7 ，其次优 势顺序为：a c t i n o b a c t e r i a ( 2 8 5 7 ) 、g a m m a p r o t e o b a c t e r i a ( 1 7 9 ) 、未知其分 类位置的细菌( 1 7 9 ) 。a l p h a p r o t e o b a c t e r i a 细菌分布于3 个属：r o s e o b a c t e r ( 4 8 2 1 ) 、 p s e u d o r h o d o b a c t e r ( 17 8 6 ) 、s u l f i t o b a c t e r ( 1 7 9 ) 。g a m m a p r o t e o b a c t e r i a 细菌分布于 1 个属：h a l o m o n a s ( 1 7 9 ) 。a c t i n o b a c t e r i a 细菌分布于1 个属：s a l i n i b a c t e r i u m 。 c 1 9 站各个o t u 代表序列如下： 2 1 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s o t u l ： i 山。比ul 山卫山l 翌山，。盟山l 山卫l 卫i 卫 g g 工了a 0 口工g 工了a s a c 工了c a c i 严c c a g t c o c 工g a a z c c i a c c g t g t c c g c t s c c t c c 了c 渤惦量0 9 了t 盆0 c7 0 g c a c 各s c cg _ i c o s g 了a ；鱼c c o a a c i ：( ：a 了g g t s t g a c g g g c g g t g t g t a c a a g g c c c s g a a c g t a i 了c1 4 0 a