（植物学专业论文）肌球蛋白x在神经轴突生长和导向中作用的研究.pdf

摘要 肌球蛋白x ( m y o x ) 是1 9 9 4 年在牛蛙的内耳中发现的、脊椎动物所特有的细胞 骨架蛋白，在肾、肝、脑等大多数组织中都有表达。有趣的是在神经系统中既表达完整 的m y o x 蛋白，又表达一种无头型的m y o x ，目前并不明确其在神经发育中的生物学意 义。m y o x 显著的特点是定位于细胞丝足的顶端和片状伪足的边缘。过表达m y o x 可明 显增加丝足的数目。而过表达m y o x 尾部区导致细胞丝足数减少或消失，因此，无头型 m y o x 也作为显性失活来研究m y o x 的功能。近来有研究表明，m y o x 与n e t r i n - 1 的受体d c c n e o g e n i n 相互作用，参与n e t r i n 1 介导的信号通路，其在神经轴突导向中 的作用尚待深入。 利用构建的m y o x 和系列缺陷型表达载体转染n g l 0 8 1 5 细胞，过表达m y o x - f 1 和头部结构域的n g l 0 8 1 5 细胞产生大量丝足，且丝足数目与长度明显增加，过表达 m y o x t a i l 蛋白的细胞几乎没有丝足，细胞呈现圆球状，内源性肌球蛋白x 在n g l 0 8 - 1 5 细胞的边缘表达量很高。在离体培养的小鼠大脑皮层神经细胞中，内源m y o x 与d c c 在神经细胞中分布几乎一致，n e t r i n - 1 诱导神经细胞后，神经轴突出现大量分支，且肌 球蛋白x 与d c c 仍然具有共定位现象。进一步，我们将构建的m y o x 和系列缺陷型表 达载体与p f l a g d c c 或p f l a g - n e o g e n i n 共转染h e k2 9 3 t 细胞，利用p r o t e i n - g 进行免 疫共沉淀分析，研究肌球蛋白x 与d c c 或n e o g c n i n 之间的相互作用情况。结果表明， d c c 和n e o g e n i n 是通过与肌球蛋白x 的尾部区相互作用的，m y o x 参与了n e t r i n - l 介 导的神经轴突导向过程。另外，体外培养的嗅球外植体被用来探讨m y o x 在神经细胞迁 移中的作用，培养5 0 小时的外植体，即有大量的神经细胞从外植体向周围迁移，而在 培养基中添加m y o x 的抗体阻断神经细胞迁移的过程，证明m y o x 抗体抑制了神经细 胞的迁移。综上所述，m y o x 的头部区对细胞丝足的生长是重要的。m y o x 与d c c 共定 位和相互作用，表明m y o x 参与了神经细胞轴突导向的n e l r i n - l - - d c c 信号通路，并且 是神经细胞的迁移中重要的影响因素。 关键词：肌球蛋白x ( m y o s i nx ) ；神经细胞迁移；n e t r i n - l ： a b s t r a c t m y o s i nx ( m y ox ) ，a na e t i n - b a s e dm o t o rp r o t e i n , w a sd i s c o v e r e di ni n n e re a rb yp c r i n1 9 9 4 m y o s i nxav e r t e b r a t e - s p e c i f i cm e m b e ro f m y o s i ns u p e r - f a m i l y , c a l lb ed e t e c t e di n m o s tt i s s u e sa n dc e l l s ，s u c ha sk i d n e y , h v b r a i n , a n ds oo i la ni n t e r e s t i n g l i n gi st h a ti n a d d i t i o nt of l a i l l e n g t hm y ox ，b r a i ne x p r e s s e sas h o r t e rf o r mo f m y ox t h er o l eo f m y ox i n d e v e l o p m e n to f n e u r a ls y s t e mi sn o tc l e a ry e t f u l l l e n g t hm y ox c a ns t i m u l a t et h ef o r m a t i o n o rs t a b i l i z a t i o no ff i l o p o d i a w h e nf u l l - l e n g t hm y oxi so v e r - e x p r e s s e d , i ti n c r e a s e st h e n u m b e ra n dl e n g t ho ff i l o p o d i ai nc o s 一7c e l l s ，w h i l et h eo v e r - e x p r e s s i o no f t h et a i lo f m y ox l e a d st h ed e c r e a s ea n dd i s a p p e a r a n c eo ff i l o p o d i & t h e r e f o r e ，h e a d l e s sm y oxc a nb eu s e dt o i n v e s t i g a t et h er o l eo fm y o s i nx i n t h ed e v e l o p m e n to fn e u r o n a ls y s t e m r e c e n t l yt h e l i t e r a t u r es h o w e dt h a tm y oxc o u l di n t e r a c t 丽md c ca n dn c o g e n i nw h i c hw e r er e c e p t o r so f n e t r i n - 1 h o w e v e r , t h er o l eo f m y oxi na x o n a lg u i d a n c ec o n t i n u e st ob ei n v e s t i g a t e d i nt h i sr e s e a r c h , as e r i a lo fc o n s t r u c t e do fm y 0x e x p r e s s i o n a lv e c t o r sw e r et r a s f e c t e d i n t on g l 0 8 - 1 5c e l l s ，t h en u m b e ra n dl e n g t ho fc e l lf i l o p o d i aw e r ei n c r e a s e dw h e nm y ox f l a n d m y ox - h e a dp r o t e i n w e r eo v e r - e x p r e s s e d , w h i l et h ec e l l st r a n s f e e t e dw i t h p e g f p m y o x - t a i lw e r er o u n da n dh a d f e wf i l o p o d i a i na d d i t i o n , m y ox l o c a l i z e da tt h e e d g eo fl a m p o d i ao rt h et i po ff i l o p o d i a i nn e u r o nt h em y ox a n dd c c n e a r l yc o - l o c a l i z e d a n dal a r g en u m b e ro fb r a n c h e sw e r ef o u n di na x o na f t e ri n d u c e db yn e t r i n - i t h e r e a f t e r , a s e r i a lo fc o n s t r u c t e do fm y oxv e c t o r sa n dp f l a g - d c c p f l a g - n e o g e n i nw e r ec o t r a n s f e c t e d i n t oh e k2 9 3 tc e l l s ，a n dt h e ni n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm y oxa n dd c c n e o g e n i nb yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nu s i n gp r o t e i ngt h ep o s i t i v er e s u l to ft h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nm y ox - t a i lp r o t e i na n dd c cw a so b t a i n e d as y s t e mo fe x p l a n tc u l t u r ew a s e s t a b l i s h e da n dt h er o l eo f m y oxi nn e u r o n a lm i g r a t i o nw a ss t u d i e df i n a l l y a f t e rc u l t u r i n gi n 5 0h o u r s ，m a n ys i n g l en e u r o n sm i g r a t e do u tf r o mt h ee x p l a n t t h ec e l lm i g r a t i o nw a s i n h a b i t e dw h e n2 u g m lm y ox a n t i b o d yw a sa d d e d ，i nc o n c l u s i o n , o v e r - e x p r e s s i o no f m y ox r e v e a l e dt h a tt h eh e a dd o m a i no fm y oxw a si m p o r t a n tf o re l o n g a t i o no fa x o i l c o l o c a l i z a t i o na n di n t e r a c t i o nb e t w e e nm y oxa n dd c cs u g g e s t e dt h a tm y oxw a sa l l e s s e n t i a lm e m b e ri nn e u r a la x o ng u i d a n c ep a t h w a yi n d u c e db yn e t r i n - i d c c a l s o ，m y ox m a y b ea ni m p o r t a n tf a c t o ri nn e u r o nm i g r a t i o n k e yw o r d s ：m y o s i nx ( m y ox ) ，n e u r o nm i g r a t i o n , n e t r i n - 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：么垂鸯日期：鲤芝：2 z 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：缫 指导教师签名： 日 期：社日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 引言 1 1 轴突生长和导向是神经细胞迁移中的重要环节 神经系统作为机体各种生理活动的管理机构。具有维持生命活动的正常进行，调节 机体适应体内外环境变化的功能。在动物进化过程中，神经系统由简单的弥散型的神经 系统到复杂而精细的管状型神经系统，其结构和功能逐渐的复杂和完善起来。脊椎动物 管状型神经系统由中枢神经系统和外周神经系统两部分组成。中枢神经系统包括脑和脊 髓，外周神经系统包括外周神经节和肠道神经组织等。哺乳动物早期神经系统起源于胚 胎的神经外胚层，通过内层的中胚层的诱导作用神经外胚层卷曲形成神经管。神经管前 端膨大形成脑组织，包括端脑，中脑，小脑等。神经管后端形成脊髓。早期神经管由单 层神经上皮细胞组成，而发育成熟的大脑皮层则由六层结构组成。因此，在神经系统发 育过程中，神经细胞迁移是其中的一个必不可少的环节【“。在神经系统的发育过程中， 轴突的生长具有严格的方向性。轴突沿特定的路线生长、延长，并伸向与它建立突触联 系的靶细胞或神经元的胞体、树突或轴突。轴突末端称为生长锥，其扇形膨大部分称片状 伪足，在片状伪足的表面伸出许多细小的突起，称之为丝足。片状伪足的细胞骨架主要 是由微管构成，丝足的细胞骨架主要是不成束的肌动蛋白。生长锥对周围环境极其敏感， 其表面受体可识别细胞外基质中或周围细胞分泌的轴突导向因子( s l i t 。n e u i n 等) 哪 4 ”。 这些导向因子中，有的能够吸引生长锥向其生长，有的却是排斥生长锥向其生长，生长锥 就是在这样一个复杂的环境中，选择一条正确的路径到达目的地。 在神经细胞迁移导向过程中，生长锥内部经历过一系列复杂的过程，包括肌动蛋白 骨架系统的重建，膜上蛋白的运输以及膜与基质的黏附和去黏附几个过程【6 ，7 。广泛被 接受的一种观点认为，在细胞迁移过程中能量的主要来源于肌动蛋白骨架系统【9 】。但是 细胞内骨架系统与胞外神经迁移导向因子之间的相互作用机制尚不清楚。因此对神经细 胞轴突生长与导向的研究是发育神经生物学中一个很有意义也很具挑战性的问题。 1 2 神经细胞轴突导向因子介导轴突的生长和导向 神经细胞导向的分子机制研究是现代发育神经生物学的一个重要课题。从2 0 世纪8 0 年代起，多个实验室从不同的角度对神经细胞迁移的分子机制进行了研究，也取得了很 大的进展。1 9 8 4 年，c n u s s l e i n - v o l h a r d 等人发现了s l i t 基因的存在后，j r o t h b e r g 和c s g o o d m a n 克隆了该基因【1 0 “】，并发现s l i t 蛋白是一个比较大的分泌型蛋白，决定 果蝇神经索正中线的胶质细胞形成，与胶质细胞的形成和分化有关。饶毅等人在1 9 9 9 年 发表的结果显示，嗅球的神经细胞膜上有s l i t 的受体r o u n d a b o u t ( r o b o ) 的表达，正 是s l i t - r o b o 这一对配体一受体介导了端脑的隔区( a n t e r i o r s u b v e n t n c u l a r z o n e ) 对嗅球 神经细胞迁移的排斥f 】2 】。w u 等人利用组织块三维培养体系证明s l i t 是以浓度梯度的形 式起作用的【1 3 】。此后的一些研究还证实了s l i t 对神经细胞迁移的排斥有一定的普遍性 u 4 。此外，t i m o t h ye k e n n e d y 等人于1 9 9 4 年在鸡胚的大脑中克隆出n e t r i n l 和 n e t r i n - 2 的基因，并发现它们与线虫中的u n c 6 具有同源性，其功能是促进胚胎期脊髓 联合神经轴突的生长，并且具有化学吸引作用【3 1 5 1 。f e r n a n d od ec a s t r o 等人利用大鼠 嗅球外植体三维培养体系证明了不同的分泌型s e m a p h o r i n 对神经细胞的迁移起到化学 排斥和吸引的作用【4 】。因此，大量的实验证据表明神经系统发育过程中神经生长锥由吸 引或排斥性轴突导向因子受体激活导致丝状伪足延长或收回，从而与靶细胞建立正确 的突触联系。迄今为止，已确定的轴突导向因子及其相应受体家族主要有： n e t r i n d c c u n c 5 h 、s l i t r o b e 、e p h r i n e p h 、s e m a p h o r i n n e u r o p i l i n p l e x i n 【1 6 1 7 , 1 8 , 1 9 。现在关于神经细胞迁移的研究主要集中在神经轴突导向因子与其受体方面。 1 3n e t ri n 是双功能的轴突导向因子 n e t r i n 属于结构高度保守的轴突导向因子家族，由底板分泌，结构上与层黏连蛋白 ( 1 a m i n i n ) 短臂相关，其n 端与层粘连蛋白( 1 a m i n i n ) 的v 和结构域同源，随后是三 个保守的e g f ( e p i t h e l i a lg r 曲t hf a c t o r ) 重复结构域，最后是n e t r i n 2 c t ( n e t r i nc 2 t e r m i n a ld o m a i n ) 【2 0 川】。在几乎全部物种中，n e t r i n 蛋白在神经系统高表达【捌，缺乏 n e t r i n 导致本应向中线生长的神经轴突方向发生错误，例如：胚胎脊髓联合神经元轴突 被n e t r i n 吸引到神经管腹侧中线，在此处n e t r i n 扩散到远距离发挥作用：另夕b n e t r i n 也能发挥近距离( 仅几个细胞直径) 作用，如在哺乳动物表达d c c 的视网膜轴突形成视神 经过程中。n e t r i n 并非自由扩散，而是通过与细胞外基质( e x t r a c e l l u a r m a t r i x ，e c m ) 或与轴突膜上的跨膜蛋白受体相互作用，并由此决定其在远处或近处发挥作用。影响 n e t r i n 分布的分子主要有h s p g s ( h e p a r a ns u l f a t ep r o t e o g l y c a n s ) 和l a m i n i n 等细 胞外基质【”j 。 n e t r i n 家族在轴突生长过程中起到吸引作用还具有排斥性导向作用，如在脊椎动 物滑车运动神经轴突远离中线生长。研究证实缺乏n e t r i n - 2 可导致胼胝体、前连合、 海马连合等不能形成；在胚胎发育期的神经元、少突胶质细胞、中胚层细胞迁移中， n e t r i n 也发挥重要作用，说明n e t r i n 是哺乳动物神经系统发育所必需的1 2 ”。这种双重 导向作用可通过生长锥所表达的不同受体被激活：吸引作用需d c c ( d e l e t e di n c o l o r e c t a lc a n c e r ) 家族受体，这种跨膜蛋白包括d c c 和n e o g e n i n ( 脊椎动物) 、u n c 4 0 ( 线虫) 、f r a z z l e d ( 果蝇) ；排斥作用需要u n c 5 h 家族受体，脊椎动物已有四种同源物 ( u n c 5 h 1 、u n c 5 h 2 、u n c 5 h 3 、u n c s h 4 ) 被鉴赳”2 “”j 。 结肠癌缺失蛋白( d e l e t e di nc o l o r e c t a lc a n c e r ，d c c ) 、n e o g e n i n 和u n c 4 0 - - - 种 n e t r i n 家族受体组成了免疫球蛋白超家族的一个亚群，主要由三个功能区组成，胞外 是4 个免疫球蛋白和6 个型纤维连接蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 组成。跨膜区富含疏水性 氨基酸，胞内部分依次为p 1 、p 2 、p 3 结构域。d c c 在脊髓联合神经元轴突生长锥向底板 2 生长时、跨过后以及随后生长到腹部索( f u n i c u l u s ) 时表达，具有与n e t r i n 一2 直接结合 的活性，结合位点为n e t r i n 的l a m i n i n 结构域与d c c 胞外第五个f n 功能埘”】，继而引发 下游胞内p 3 区二聚化，传递吸引性信号介导轴突朝向n e t r i n 高浓度区域生长。体外实 验中利用抗d e c 抗体可以功能特异阻碍n e t r i n - 1 依赖性联合神经元轴突的生长 2 4 1 。缺乏 u n c 4 0 、f r a z z l e d 和d c c 可导致本应由n e t r i n 吸引的轴突生长方向的错误。敲除d c c 小 鼠的表型与缺乏n e t r i n 的表型非常类似。这些都支持d c c 家族是n e t r i n 受体，是传递神 经轴突导向生长作用的关键分子。另外，通过蛋白质相互作用分析表明肌球蛋白x 的尾 部区与d c c 的胞内p 3 区相结合，参与n e t r i n - i 介导的神经细胞突起的生长和导向作用【2 ”。 因此本论文主要兴趣集中在肌球蛋白x 在神经细胞在迁移过程中轴突的生长和导向方面 的研究。 1 4 肌球蛋白x 参与n e t ri n 介导的神经突起生长和导向 早在1 9 8 1 年，h e i d e m a n n 等就发现了肌动蛋白丝和微管构成的细胞骨架在神经生 长和生长锥导向过程中的重要作用【2 6 1 。在神经系统发育过程中，正是由于细胞骨架的参 与，轴突才能沿着正确的路径长至相应的靶位点。在生长锥中，由导向因子n e t r i n 和 其受体d c c 等诱导激活的多种细胞内信号传递通路综合作用于细胞骨架，并通过后者调 节生长锥的活动。另外，在神经细胞迁移研究领域中，已证明肌动蛋白一肌球蛋白所形 成的微丝作为细胞的骨架蛋白在神经细胞迁移过程中参与了细胞内骨架系统的重建和 膜上蛋白的运输。 肌球蛋白x 是在1 9 9 4 年通过p c rs c r e e n 技术在内耳中发现的【2 7 】，基因定位于 小鼠第1 5 号染色体人的第5 号染色体上。很多资料表明肌球蛋白x 是脊椎动物所特 有的一种肌球蛋白，尚未曾在ce l e g a n s ( 线虫) 和d r o s o p h i l a ( 果蝇) 中发现肌球 蛋白x 的存在1 2 8 1 。肌球蛋白xm r n a 点印记实验表明在人的大部分组织中都有肌球蛋 白x 的表达，但表达量不同【2 9 1 。另外，在c 5 7 b l 6 小鼠的背根神经节损伤后肌球蛋白x m r n a 的表达量比平时高出7 倍，因此我们推断肌球蛋白x 可能参与了神经再生时细胞 骨架的重排【3 0 】。n o r t h e r n 印记实验显示，肌球蛋白xm r n a 全长约有9 2k b ，在大脑 中存在一短的约6 0k b 的形式【钆2 9 ，3 1 1 ，现已知肌球蛋白x 蛋白全长分子量约有2 4 0 k d a ，大脑中表达一种分子量约为1 8 0kd a 的缺少头部区的形式。两种形式的肌球蛋白x 在脑中的表达存在着差别。s o u s a 等人发现全长型的肌球蛋白x 在大脑和小脑中都有表 达，其中在大脑中从出生后第5 天到第1 5 天都有表达。而在小脑中从出生后第5 天开 始表达后表达量持续增长。缺头型肌球蛋白x 在大脑中的表达与全长型一致，而在小脑 中只有在出生后第5 天有较高的表达量，之后表达量减少，在地第1 0 天几乎没有表达。 因此s o u s a 等人推测缺头型肌球蛋白x 在神经细胞中可能起到抑制或在空间上限制全 长型肌球蛋白x 的活性p ”。 肌球蛋白x 定位于神经细胞丝足顶端和膜的边缘，过表达全长型肌球蛋白x 可在 丝足的顶端和片状伪足的前缘看到明显的积累f 3 2 3 3 1 。对于肌球蛋白x 的研究发现，缺 头型肌球蛋白x 与全长型存在很大的差别，不能够定位到细胞丝足的顶端，说明头部区 为肌球蛋白x 行使功能的核心，是肌球蛋白x 在丝足顶端的定位所必须的元件，其头部 区a c t i n 结合位点的突变将影响到肌球蛋白x 的生物学功斛抖3 5 1 。另外我们也证明了缺 头型肌球蛋白x 只存在于神经细胞，尚未获得在非神经细胞中存在的证据，而全长型肌 球蛋白x 却在很多细胞中有发现。现在对于肌球蛋白x 的功能研究仍在进行中，其全 长在神经系统中的作用尚不明确，有待于迸一步的研究。肌球蛋白x 除含有动力头部 区和颈部区外，其尾部区具有独特的结构：o p e s t 区：为c a 2 + 依赖的蛋白酶即钙蛋白 酶水解位点，含有丰富的脯氨酸( p r o l i n e p ) 、谷氨酸( g l u t a m a t e - e ) 、丝氨酸 ( s e r i n e s ) 、苏氨酸( t h r e o m i n e t ) 。在p e s t 区附近还有钙蛋白酶的识别位点。三 个p h ( p l e c k s t r i nh o m o l o g y ) 区：是肌球蛋白x 所独有的一个性质；匿) m y t h 4 区：约 有1 5 0 个氨基酸残基，具有高度保守的特点。、f e r m 区：是骨架蛋白和整合蛋白结 合位点。肌球蛋白x 尾部区独特的结构即表现在其不同的部位结合不同的蛋白【2 9 1 。例如， 在x e n o p u s 中发现m y t h 4 区是肌球蛋白x 与微管结合的位点；酵母双杂交实验和 g s t p u l ld o w n 分析表明f e r m 区可与整联蛋白的1 3 。1 3 。和1 3 。亚基的胞内区相互作用， 推测肌球蛋白x 可能参与了丝足上整联蛋白的转运和锚定，但是我们还不清楚是否起 到激活整联蛋白的作用【3 6 1 ，p h 区与p 1 3 激酶结合，在p 1 3 激酶调控的的下游3 7 3 剐。 在非极性细胞的有丝分裂中肌球蛋白x 还参与了整联蛋白( i n t e g r i n ) 依赖的纺锤丝的 定向【3 9 1 。 神经细胞在迁移的过程中，周围环境中的轴突导向因子( 如n e t r i n ) 通过与神经 突出前端的特化结构生长锥膜上的蛋白作用，将胞外的排斥或吸引信号传递到胞 内，引起细胞骨架的重排。在此过程中，细胞膜上的跨膜蛋白d c c 、n e o g e n i n 、f a k 、 i n t e g r i n 1 4 , 3 9 , 4 0 , 4 1 捌等跨膜蛋白将胞外n e t r i n 导向因子的吸引或排斥信号都通过胞内段 与肌球蛋白x 相互作用，肌球蛋白x 再通过与肌动蛋白的相互作用细胞骨架的重排，导 致细胞丝足的生长和定向( 如下图所示) 。另外，实验也证明肌球蛋白x 通过尾部区与 细胞膜上的跨膜蛋白p i p 3 相互作用。 4 1 5 立题依据 在神经细胞迁移过程中，肌球蛋白x 作为一个动力蛋白分子，起到连接细胞膜蛋白 与细胞内骨架蛋白的桥梁作用。但是关于肌球蛋白x 在神经细胞迁移导向中具体的作用 机制还不是很清楚。本论文是综合以上近几年在肌球蛋白x 研究中最新进展，为进一步 阐明肌球蛋白x 在神经细胞迁移中的作用而立题的。 5 2 材料和方法 2 1 动物材料和细胞株 新生( p o - 5 ) 昆明小鼠购于吉林大学基础医学部 n e t r i n 一1 分泌型h e k2 9 3 稳定转染系由美国熊文诚老师惠赠 n g l 0 8 1 5 细胞购于上海生命科学学院细胞库 h e k2 9 3 t 细胞 2 2 表达载体 本实验使用c l o n t e e h 的p e g f p - c 1 构建g f p 融合表达载体( 如表一) ： 表一：本论文中所用载体插入片段大小 质粒名称插入片段大小( b p s ) 表达蛋白序列( a a ) p e g f p m y o x f l 6 1 7 71 - 2 0 5 9 p e g f p - - m y o x h e a d 4 1 7 91 1 3 9 3 p e g f p - - m y o x t a i1 3 5 7 68 6 0 2 0 5 9 p e g f p - c 1 2 3 化学试剂 多聚赖氨酸( p o l y l l y s i n e ) 购于r h o c h e 公司， d i b u t r y lc y c l i ca m p ( b t 2 c a m p ) ( c o t n o 3 4 9 8 8 ) 购于f l u k a 公司， 神经细胞培养基成分： b 一2 7s u p p l e m e n t ( c o t n o 1 7 5 0 4 0 4 4 ) 购于g i b c 0 公司。 c y t o s i n e b d - a r a b i n o f u r a n o s i d e ( c o t n o c 1 7 6 8 ) 购于s i g n m 公司， n e u r o b a s e dm e d i u m ( c o t n o 2 1 1 0 3 0 4 9 ) 购于g i b c o 公司， d m e m f 1 2 培养基( c o t n o 1 1 3 2 0 - 0 3 3 ) 购于g i b c o 公司， d m e m 高糖培养基购于g i b c o 公司， 新生牛血清购于g i b c o 公司， 青霉素一链霉素，l 一谷氨酰氨，胰酶，7 5 乙醇，蒸馏水，i xp b s ， 台盼蓝，无水乙醇，异丙醇，酚：氯仿( 1 ：1 ，v v ) s u o e r s i g n a l w e s tp i c oc h e m il u m i n e s c e n ts u b s t r a t e ( c a t n o 3 4 0 7 7 ) 购于p i e r c e 公司， 6 p r o t e i ng ( c a t n o 1l ，7 1 9 ，4 1 6 ，0 0 1 ) 购于r h o c h e 公司， d s p ( c a t n o 2 2 5 8 5 ) 购于p i e r c e 公司， 2 4 抗体 兔源肌球蛋白x 抗体购于s a n t a c r u s 公司， 鼠源肌动蛋白抗体( c o t n o a 5 4 4 1 ) 购于s i g m a 公司， 羊源d c c 抗体( c o t n o s c 6 5 3 5 ) 购于s a n t a c r u s 公司， n e u r o nb t u b u l i n 一a n t i b o d y ( ) 购于s i g m a 公司， f i t c 偶联羊抗兔抗体( 4 8 8 n m ) 购于m o l e c u l a rp r o b e 公司， c y 3 偶联羊抗鼠抗体( 5 4 9 n m ) ( c o t n o c 2 1 8 1 ) 购于s i g m a 公司， c y 3 偶联兔抗羊抗体( 5 4 9 n m ) ( c o t n o c 2 8 2 1 ) 购于s i g m a 公司， 2 5 仪器 解剖镊，解剖剪 钨针( 0 2 5 m m9 9 9 5 。c o t n o 1 0 4 0 8 ) 购于阿法埃莎( 天津) 公司， 实体解剖镜( s f c 1 1 ；m o t i c ) ， 正置荧光显微镜( e c l i p st e 2 0 0 0 - u ，n i k o n ) ， 倒置荧光显微镜( 8 0 i ，n i k o n ) 1 2 孔培养板，1 0 0 m m 培养盘， 3 7 细胞培养箱( s n 4 3 8 0 卜3 1 4 0 ，t h e r m o f o r m a ) ， b d - 细胞滤网( 4 0 u mr e f 3 5 2 3 4 0 ) 购于b db i o s c i e n c e s 公司 圆形盖玻片( 由1 8 m m 厚度i m m ) ，血细胞细胞计数板 1 5 m i 离心管，5 0 m l 离心管 刻度吸管( 5 m l ，l o m l ) ，巴斯德吸管， 微量移液器( i m l ，2 0 0 u l ，f o u l ) 恒温水浴锅 常温低速离心机 免疫组化湿盒 e c m 一8 3 0 电转仪( b t x ) ， 2 r m 电转杯 2 6 小鼠大脑皮层神经细胞的原代分离和培养 2 6 1 准备 1 实验前先对盖玻片( 中1 8 m m 厚度：i m m ) 进行处理，用l ：l 混合的冰醋酸和乙 醇溶液浸泡玻片1 小时，蒸馏水洗约5 分钟，7 5 的乙醇灭菌l 小时，然后在超净 7 台中取出盖玻片，无菌风吹干后，用镊子取出放入到1 2 孔培养板中。 2 用l op9 m l 的多聚赖氨酸处理1 2 孔培养板。取l m l 包被液加入到含盖玻片的培养 孔中，室温放置过夜。然后移去多聚赖氨酸，无菌水洗3 次。处理好的培养板可放 置于4 冰箱中，待用。 3 实验前2 小时，将解剖用具，如解剖剪和解剖镊于7 5 乙醇中浸泡1 5 小时后，取 出后放于超净台中紫外线灭菌3 0 分钟。 4 所用培养基放于3 7 水浴锅中预热。 5 实验前需要高温高压灭菌的试剂及材料：蓝色t i p s ：黄色t i p s ；1 5 m l 离心管； 刻度吸管；弯头吸管；5 0 m l 离心管；i x p b s ( 1 3 7 m mn a c i ，2 7 i i l ik c l ，l o m m n a 2 h p 0 4 1 2 h 。0 ，2 m mk h 2 p 0 4p t - i7 2 ) 。 2 6 2 胚胎小鼠大脑皮层神经细胞的原代分离与培养 1 取e 1 5 5 1 8 5 天的胚胎小鼠。首先断颈处死怀孕母鼠，打开腹腔，将子宫暴露 于体外，用解剖剪将子宫全部取出，放于含有i x p b s 的培养盘中，用解剖镊将子宫 中的胚胎鼠轻轻取出，置于含有1 x p b s 的培养盘中。然后，用解剖剪打开小鼠颅骨， 用解剖镊快速取出大脑，放入另一含1 x p b s 的培养盘中。 2 在实体解剖镜下，用解剖镊分离大脑皮层，用镊子将大脑皮层的脑膜剥离开来。 将蓝色邱s 前端剪去一段，分离5 - 6 个胚胎后，用移液器将皮层组织移入1 5 m l 离 心管中。用解剖剪剪碎组织。 3 将剪碎的组织转入一离心管中，管内含有合适体积的终浓度为o 2 5 胰酶消化液。 一般1 2 个胚胎需要2 4i n l 胰酶消化液。3 7 c 水浴锅中孵育1 5 分钟，切勿摇动离心 管。 4 往离心管中加入l 2m ld m e m f 1 2 + 1 0 血清培养基，终止消化。 5 室温下静置5 分钟。用移液器将消化液中团状粘性物移出，加入到另一含有1 0 m l d m e m 伊1 2 + l o 血清培养基的5 0i n l 离心管中。 6 用弯头吸管吹打团状粘性物，将其吹散，制成细胞悬液。 7 取一新的5 0i i l l 离心管固定于离心管架上，将b d 细胞滤网放于其上。吸取细胞 悬液加到细胞滤网上，利用重力作用过滤，以获得单个的神经细胞。 8 取3 0 i ll 神经细胞悬液，加入等体积的l x 台盼蓝试剂，利用血细胞计数板进行 细胞计数。 9 将细胞以合适的浓度接种到多聚赖氨酸处理的培养板上，接种密度为4 6 x 1 0 6 细胞ml o o m m 。 1 0 8 小时后更换为培养神经元的培养基： 9 0 n e u r o - b a s e dm e d i u m 1 0 b 一2 7s u p p l e m e n t 2 m ml - 谷氨酰氨 8 i o o u 青霉素一链霉素 1 1 细胞培养两天后加入1 0umc y t o s i n e - b - d - a r a b i n o f u r a n o s i d e ，以抑制非神经细胞 的生长。 2 7 培养细胞的免疫荧光染色 1 取培养状态良好的神经细胞，加入含有n e t r i n 一1 的细胞培养基，诱导分化3 0 分 钟后，吸去剩余的培养基。 2 用o 0 1 m 的p b s ( 1 9 m m n a h 2 p 0 4 ，8 i m m n a 2 h p 0 4 ，n a c ip h7 2 7 4 ) 冲洗三遍。 3 细胞固定：将1 2 孔细胞培养板放置于冰上，每孔中加入l m l - 2 0 c 冰冷的甲醇， 一2 0 下固定2 0 分钟。甲醇既作为细胞固定剂又可以作为细胞膜穿孔剂。 4 去除甲醇，用1 x p b s 洗5 分钟 5 用解剖镊将盖玻片从1 2 孔培养板中取出，细胞面朝上放于湿盒中，剩余的玻片可 在4 c 中保存一周。 6 细胞封闭：配制封闭液2 b s a 1 x p b s ，取2 0 0u1 封闭液滴加到每张盖玻片上， 室温下封闭3 0 分钟 7 去除封闭液，从4 冰箱中取出一抗：兔源肌球蛋白x 抗体和羊源d e c 抗体。用 封闭液稀释配制一抗工作液：1 ：2 0 0 0 稀释m y o l 0 抗体和d c c 抗体。取1 0 0 u1 一 抗工作液滴加到盖玻片上，室温下反应l 一2 小时或4 c 过夜。 8 去除一抗工作液。i x p b s 洗三遍，每次1 5 分钟。 9 二抗反应：用封闭液稀释配制二抗工作液：l ：2 0 0 稀释f i t c 偶联羊抗兔抗体和 c y 3 偶联兔抗羊抗体。取1 0 0pl 一抗工作液滴加到盖玻片上，室温下反应1 2 小时， 或4 过夜。 l o 去除二抗工作液，1 x p b s 洗三遍，每次15 分钟。 1 1 用无菌水洗两次每次5 分钟。 1 2 用吸水纸吸去剩余液体，小心吸去水珠。加入9 0 的甘油一滴与长有细胞一面 的盖玻片上，细胞面朝向载玻片方向压片，用滤纸吸去多余甘油后，取指甲油涂抹 在盖玻片边缘封片。 1 3 荧光显微镜下观察。 2 8n g l0 8 - 15 细胞的培养及转染 n g l 0 8 1 5 细胞是小鼠成神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤细胞杂交而成的杂交瘤细 胞。具有神经细胞和胶质细胞的特性。n g l 0 8 1 5 细胞经诱导后可以呈现出片状伪足及 丝状伪足，是用于研究神经细胞轴突生长的很好的细胞材料。 2 8 1n g l 0 8 1 5 细胞的培养及诱导分化 1 n g l 0 8 1 5 细胞的培养条件为：1 6 4 0 培养基、1 0 新生牛血清、5 h a t ，3 7 c 5 c 0 2 。 9 2 诱导分化：配制1 0 0 m m 的诱导剂二丁基- c a m p 储存液。 3 将诱导剂加入新的1 6 4 0 培养基中，终浓度为l m m 。 4 去掉原来的培养基，加入新的含有诱导剂的培养基到n g l 0 8 1 5 细胞。放入细胞 培养箱中，培养过夜。 5 相差显微镜下观察。 2 8 2 电转化法转染n g l 0 8 1 5 细胞 本实验利用b t x 公司生产的的e c m8 3 0 电转仪，将n g l 0 8 - 1 5 细胞与质粒用电转 缓冲液重悬后，利用电场的作用将质粒转入细胞中表达目的蛋白。本实验方法操作简单， 转染效率要比普通磷酸钙法高，有些较难转染的细胞，如神经细胞可考虑利用此方法表 达外源蛋白。 2 8 2 1 质粒制备 1 碱裂解法常规制备质粒的大量抽提物。从2 0 0 m ll b 培养基制备质粒提取物，用 1 0 0 3 0 0u l 无菌水溶解沉淀。 2 酶切鉴定。 3 a 2 6 0 2 8 0n m 测量吸收值。( a 2 6 0 2 8 0n m 应为1 7 1 9 ) ，浓度大于l u g u l 。测定公 式：o d a 2 6 0x 5 0 稀释倍数( 4 0 0 ) = 浓度( u g m 1 ) 2 8 2 2 电转缓冲液的制备 1 s o l u t i o ni ： a r p n a 2 0 2 9 m g c l 2 6 h 2 0 1 2 9 h 2 0 1 0 m l 用0 2 2 u r n 的滤器过滤，8 0 u 1 分装- - 2 0 度储存 2 s o l u t i o n i h k h 2 p 0 4 6 9 n a h c 0 3 o 6 9 葡萄糖0 2 9 h 2 0 3 0 0 r a l 用n a o h 调p h 值7 4 然后将最终浓度调至5 0 0 m l 用0 2 2 u r n 的滤器过滤4 m 1 分 装- - 2 0 度储存。将8 0 u ls o l u t i o ni 和4 m ls o l u t i o ni i 混和制成电转液，储存于4 度，可保存一个月。 3 从细胞培养箱中取出n g l 0 8 1 5 细胞，胰酶2 分钟。室温，1 0 0 0 r p m m i n 离心收 集细胞。 4 将所有的培养基吸走( 这一步很重要，要用2 0 0 u l 的枪头将剩余的液体全部去掉) 。 5 用1 x p b s 重悬细胞，进行细胞计数