（生物化学与分子生物学专业论文）人新分泌蛋白基因的筛选、克隆与功能初步研究.pdf

上海交通丈学博上学位论文 人新分泌蛋白基因的筛选、克隆与功能初步研究 摘要 分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，参与了信号途径、形态发 生、细胞凋亡、细胞分化、免疫防御等多种过程。分泌蛋白能够适应 不同的药物运输机制，可用作治疗药物或治疗靶点。寻找新分泌蛋白 并确定其生物功能有重要意义。 本研究使用各种生物信息学手段，包括s e c r e t o m ep 1 0s e r v e r ， s i g n a lp ，s o s u i ，p s o r t ，p r o t e o m ea n a l y s t ss u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o ns e r v e r 和b l a s t ，从来自人公共蛋白数据库的共3 5 4 4 6 条蛋白序列中筛选新的分泌蛋白基因。其中n s p 0 7 0 ，n s p 0 7 8 ，n s p 0 9 2 和n s p 0 9 3 预测为经典分泌蛋白，而n s p 0 9 4 ，n s p 0 9 5 和n s p 0 9 6 预测 为非经典分泌蛋白。本论文着重对3 个新的候选分泌蛋白基因进行了 初步研究，它们分别是n s p 0 7 0 , n s p 0 9 2 , 及n s p 0 9 6 基因。 n s p 0 7 0 蛋白共有1 1 6 个氨基酸，分子量为1 3 3 0 2 d a ，定位于人1 2 号染色体短臂1 2 区1 带( 1 2 p 1 2 1 ) 。运用生物信息学分析得到，1 至 2 7 个氨基酸为信号肽，第5 8 、6 4 、7 3 、9 5 氨基酸为预测的丝氨酸磷 酸化位点，1 0 6 为苏氨酸磷酸化位点，第2 3 位为潜在的舯糖基化位点。 通过转染c o s - 7 细胞及w e s t e r nb l o t 技术验证了n s p 0 7 0 是一个分泌蛋 上海交通大学博士学位论文 白。亚细胞定位分析表明n s p 0 7 0 蛋白定位在细胞质中，且不与高尔基 体共定位，提示n s p 0 7 0 是一个经典分泌蛋白。再对n s p 0 7 0 进行布雷菲 尔德菌素a ( b r e f e l d i nh ，简称b f a ，一种对依赖内质网高尔基体的 蛋白分泌途径的抑制剂) 干扰实验发现，n s p 0 7 0 分泌被完全抑制，从 而证明n s p 0 7 0 是一个经典分泌蛋白。对n s p 0 7 0m r n a 水平上的组织分 布考察发现它在胎盘组织中有显著表达，在肺、肝、心、胸腺中也有 低水平的表达，同时免疫组化也揭示n s p 0 7 0 蛋白定位在胎盘细胞滋养 层中，提示它可能会在人胎盘和胚胎发育阶段起重要作用。另外，为 了进步证实是否有像s t r i n g 数据库所预测的n s p 0 7 0 蛋白与多个蛋 白存在相互作用的问题，又构建t n s p 0 7 0 原核表达载体转化大肠杆菌 b l 2 1 ，用异丙基一b - d 硫代半乳糖苷( i p t g ) 诱导，将制备并纯化好 的谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 融合蛋白送到上海生物工程中心制备抗 体。抗体经纯化，通过免疫沉淀技术，在人肝癌细胞s m m c 一7 7 2 1 中发 现有很多互作蛋白。表达量高的两个差异蛋白经质谱鉴定分别为肌动 蛋白( a c t i n ) 和乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) 。但是，当 用去除抗g s t 的n s p 0 7 0 抗体再次做免疫沉淀时发现并没有什么差异条 带，因此前阶段发现的互作蛋白很可能是假阳性。用纯化并去g s t 的 n s p 0 7 0 抗体在另外人肝细胞l 0 2 中做免疫沉淀发现，大约在7 0 k d a 附近 有一条差异条带，但由于蛋白含量偏低质谱鉴定未果。 n s p 0 9 2 蛋白共有3 9 3 个氨基酸，分子量为4 4 9 4 0 d a ，定位于人1 1 号染色体短臂1 5 区5 带( 1 l p l 5 5 ) 。运用生物信息学分析得到，1 至 2 0 个氨基酸为信号肽，8 1 至3 8 4 个氨基酸为g l y c o _ 1 8 结构域，第2 2 、 h 上海交通大学博上学位论文 2 4 、3 1 、3 8 、4 1 、1 6 6 、2 7 6 、2 8 9 、3 5 0 位为预测的丝氨酸磷酸化位点， 第2 0 、2 3 2 、2 4 2 、3 0 8 、3 2 4 、3 5 9 位为预测的苏氨酸磷酸化位点，第 8 4 、9 3 、1 5 7 位为预测的酪氨酸磷酸化位点。另外，无n - 糖基化修饰 位点。通过转染c o s - 7 细胞及w e s t e r nb l o t 表明旭r 礁缮因并不象预 测的结果那样编码了一个经典分泌蛋白，而是一个胞浆蛋白。对 艏黝彪基因在m r n a 水平上进行组织分布考察发现，它在肺、肾、肝、 心、胸腺中都有表达，其中肝最高。在大多数肝癌细胞中的r t - p c r 发现：舾凡l 彩基因在肝癌细胞株h e p g 2 高表达，而在p c l ，f o c u s 等其 它肝癌细胞株未见表达。此外胚黝l 铋在人结肠癌细胞株l o v o 里也未见 表达。遂将伪瑚铉基因在l o v o 细胞中建立稳定株。细胞生长曲线揭示 l o v o - n s p 0 9 2 稳定细胞株有生长抑制的现象，克隆形成实验也表明与 瞬时转染空载体p c d n a 3 1 相比，克隆形成数明显减少，而细胞周期分 析发现细胞株g 1 期发生阻滞( a r r e s t ) 。这表明施瑚坛有可能是个潜 在的抑癌基因。另) b n s p 0 9 2 蛋白因为其g l y c o _ 1 8 结构域而被预测具 有水解几丁质作用的含有几丁质酶结构域i 蛋白( c h i d i ) 。然而将其 蛋白序列与现有已知的人的几个几丁质酶蛋白序列进行比对时发现： 它与其他序列的相似性很低，特别是n s p 0 9 2 不含有其它蛋白都具有的 负责几丁质催化活性的一段蛋白序列f d g l d l d w e f p g ，因此n s p 0 9 2 不具 有水解几丁质的功能。 n s p 0 9 6 蛋白共有1 3 2 个氨基酸，分子量为1 3 9 9 7 d a ，定位于人1 9 号染色体短臂1 3 区3 带( 1 9 p 1 3 3 ) 。第7 2 位为预测的丝氨酸磷酸化位 点，第1 0 、7 9 位为预测的苏氨酸磷酸化位点。运用生物信息学分析得 1 1 1 上海交通大学博士学位论文 到：无信号肽，是一个非经典分泌蛋白。那么，通过转染c o s - 7 细胞 及w e s t e r nb l o t 技术表明n s p 0 9 6 是一个分泌蛋白，且分泌不受 b r e f e l d i na 抑制，从而证实n s p 0 9 6 的确是一个非经典的分泌蛋白， 即其分泌途径不依赖于内质网高尔基体途径。亚细胞定位实验也证 实n s p 0 9 6 与高尔基体不共定位。糖苷酶p n g a s ef 的去糖基化实验也表 明n s p 0 9 6 无n - 糖基化修饰。这些都辅助说明n s p 0 9 6 蛋白的非经典分泌 这一性质。对舾黝身占基因m r n a 水平上组织分布的考察发现，n s p 0 9 6 在肝脏中有特异性表达，针对这种情况，决定考察n s p 0 9 躔因在肝癌 和癌旁中的表达情况。结果表明n s p 0 9 6 7 1 e 肝癌中的表达是下调的。这 也暗示了n s p 0 9 6 可能会在肝脏组织中发挥某种功能。另外嬲磁1 9 踬兰一 个潜在的年轻基因，从现有的所有被测序公布的物种来看，只是从黑 猩猩( p a nt r b g l o d y t e s ) 起才有，并且在进化过程中经历过纯化选 择，提示n s p 0 9 6 的功能不可替代。 关键词：分泌蛋白，非经典分泌，转染，免疫印迹，生物信息学分析 上海交通大学博上学位论文 s c r e e n i n ga n dc l o n i n go fn o v e lg e n e s e n c o d i n gh u mans e c r e t e dp r o t e i n sa n dt h e i r e l e m e n l l a r yf u n c n o n a ls t u d y a b s t r a ( 了r s e c r e t e dp r o t e i n sa r eo fg r e a ti m p o r t a n c ew h i c hi n v o l v ei nm a n y b i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，s u c h a s s i g n a lp a t h w a y s ，m o r p h o g e n e s i s ，c e l l a p o p t o s i s ，c e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，c e l ld e f e n s ea n ds oo n a n ds o m eo ft h e m c a nb em e d i c i n eo rt a r g e t si nm e d i c a lt h e r a p y s oi th a sm u c hp o i n ti n s c r e e n i n gn e ws e c r e t e dp r o t e i n sa n dd e t e r m i n i n gt h e i rf u n c t i o n i nt h i ss t u d yas e to f b i o i n f o r m a t i c sm e t h o d sw e r eu t i l i z e dt os c r e e n o u tn o v e lh u m a ns e c r e t e d p r o t e i n s f r o m3 5 4 4 6 p r o t e i ns e q u e n c e s o b t a i n e df r o mt h ep u b l i cp r o t e i nd a t a b a s e ，i n c l u d i n gs e c r e t o m e p1 o ， s i g n a l 只s o s u i ，p s o r t , p r o t e o m ea n a l y s t ss u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n s e r v e ra n db l a s t f i n a l l yn i n eh y p o t h e t i c a lh u m a ns e c r e t e dp r o t e i n s w e r ei s o l a t e d n s p 0 7 0 ，n s p 0 7 8 ，n s p 0 9 2a n dn s p 0 9 3a m o n gt h e mw e r e t h o u g h to fc l a s s i cs e c r e t e dp r o t e i n s ，w h i l en s p 0 9 4 ，n s p 0 9 5 ，n s p 0 9 6 w e r e t h o u g h to fn o n - c l a s s i co n e s t h e nif o c u s e dm ys t u d yo nt h r e eg e n e s v 上海交通大学博士学位论文 n s p 0 7 0p r o t e i nh a s1 1 6a m i n oa c i d sa n dl o c a t e si nh u m a n c h r o m o s o m e1 2 p 1 2 1 ，a n di t st h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i g h ti s1 3 3 k d a t h ea m i n oa c i d sf r o mt h e1 “t ot h e2 7 ma r ep r e d i c t e dt ob et h es i g n a l p e p t i d eb ys i g n a let h ea m i n oa c i do nt h e5 8 “，6 4 m ，7 3 一，9 5 1 hs i t ei s p r e d i c t e da sas e r i n e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e ，a n dt h e1 0 6 t ba m i n oa c i di s p r e d i c t e da s at h r e o n i n e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e ，t h e2 3 ma m i n oa c i di sa p o t e n t i a ln g l y c o s y l a t i o ns i t e b yc l o n ec o n s t r u c t i o n i np c d n a 3 1 b v e c t o r , t r a n s f e c t i o ni nc o s - 7c e l la n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i sw ek n o wt h a t n s p 0 7 0w a sas e c r e t e dp r o t e i na sp r e d i c t e d s u h c e l l u l a rl o c a t i o na l s o i n d i c a t e di tl o c a t e di nt h e c y t o p l a s ma n d d i d n tc o l o c a l i z ei n g o l g i a p p a r a t u s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tn s p 0 7 0c o u l db eac l a s s i c a ls e c r e t e d p r o t e i n b yb r e f e l d i na ( b f a , a c h e m i c a lu s e dt oi n h i b i tp r o t e i ns e c r e t i o n v i a t h ee r g o l g ip a t h w a y ) i n t e r f e r e n c ee x p e r i m e n t ，t h es e c r e t i o no f n s p 0 7 0w a sb l o c k e dc o m p l e t e l y s oi tw a sc o n f i r m e dt h a tn s p 0 7 0w a sa c l a s s i c a ls e c r e t e dp r o t e i n t i s s u er t - p c re x p e r i m e n tu n c o v e r e dt h a ti t e x p r e s s e da b u n d a n t l yi nh u m a np l a c e n t ab u tw e a k l yi nl u n g ，l i v e r , h e a r t ， t h y m u s ，a n di m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d y o nh u m a nt e r m p l a c e n t a d e m o n s t r a t e dt h a tn s p 0 7 0p r o t e i nw a sm a i n l yl o c a l i z e de x t r a c e l l u l a r l y s u r r o u n d i n gt h es y n c y t i o t r o p h o b l a s t i cc e l l s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tn s p 0 7 0 m i g h tp l a yar o l e i nh u m a np l a c e n t aa n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n t f o r f u r t h e rr e s e a r c hi nv i v o ，t h en s p 0 7 0 o r fs e q u e n c e ，s i g n a l p e p t i d e v l 上海交通大学博士学位论文 d e l e t e d ，w a st h e na s s e m b l e di n t op g e x4 t - 1v e c t o r , a n di n d u c e db y i p t gt oo b t a i nag s tf u s i o np r o t e i na sa n t i g e nt oi m m u n er a b b i t s b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o ni nh u m a nl i v e rc a n c e rc e l l so fs m m c - 7 7 2 1w i t h r a b b i ta n t i g s t - 0 7 0a n t i b o d y , m o r et h a n1 0b a n d sw a ss h o w nd i f f e r e n t o nt h eg e la n dt w oo ft h e mw e r ee x c i s e da n di d e n t i f i e db ym a l d i - t o f m a s s o n ew a sa c t i n ，t h eo t h e rw a sl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e b u tw h e n r a b b i ta n t i g s t - 0 7 0a n t i b o d yw a sg o tr i do fa n t i - - g s ta n t i b o d y , n o d i f f e r e n tb a n dc o u l db ef o u n di nt h ei m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n ti n s m m c 一7 7 2 1c e l l s s ot h ei n t e r a c t i o n f o r m e r l y f o u n dc o u l db e f a l s e p o s i t i v e b yi m m u n o p r e c i p i t a t i o ni nh u m a nl i v e rc e l l so fl 0 2u s i n g r a b b i ta n t i g s t - 0 7 0a n t i b o d yw i t h o u ta n t i g s ta n t i b o d y , o n ep u t a t i v e l y d i f f e r e n tb a n dw a sf o u n dw i t ht h em o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t7 0 k d a h o w e v e ro w i n gt ot h el o w e rq u a n t i t yo ft h i sb a n d ，i tf a i l e d i nt h e i d e n t i f i c a t i o nb ym a s ss p e c t r o m e t r y n s p 0 9 2p r o t e i nh a s3 9 3a m i n oa c i d sa n dl o c a t e si nh u m a n c h r o m o s o m el l p l 5 5 ，a n di t st h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i g h ti s4 4 9 k d a t h ea m i n oa c i d sf r o mt h e1 吼t ot h e2 0 血a r ep r e d i c t e dt ob ea s i g n a l p e p t i d eb ys i g n a le a n df r o m8 1t o3 8 4i st h eg l y c o - 1 8d o m a i n t h e2 2 m ， 2 4 m ，3 1 m ，3 8 血，4 1 血，1 6 6 m ，2 7 6 t h ，2 8 9 t ha n d3 5 0 ma m i n oa c i d sa r ep r e d i c t e d a ss e r i n e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s ，a n dt h e2 0 “，2 3 2 ”，2 4 2 n d ，3 0 8 m ，3 2 4 ma n d 3 5 9 “a m i n oa c i d sa r ep r e d i c t e da st h r e o n i n e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s ，a n d t h e8 4 “，9 3 d ，1 5 7 “a m i n oa c i d sa r ep r e d i c t e da st y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n i 上海交通大学博：t 学位论文 s i t e s i na d d i t i o ni th a sn on - g l y c o s y l a t i o ns i t e b yc l o n ec o n s t r u c t i o ni n p c d n a 3 1 av e c t o r , t r a n s f e c t i o ni nc o s - 7 c e l la n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s w ek n o wt h a tn s p 0 9 2w a sac y t o p l a s m i cp r o t e i n ，n o ta sp r e d i c t e da sa s e c r e t e dp r o t e i n t i s s u er t - p c re x p e r i m e n tu n c o v e r e dt h a ti te x p r e s s e d i nl u n g ，k i d n e y , l i v e r , h e a r t ，t h y m u s ，b u th i g h e s ti nl i v e r c e l lr t - p c r s h o w e dn s p 0 9 2g e n ee x p r e s s e dh i g h e s ti nh e p g 2c e l l ，b u td i d n te x p r e s s i np c l , f o c u sa n do t h e rl i v e rc a n c e rc e l l s m o r e o v e r , i tw a sf o u n d n s p 0 9 2d i d n te x p r e s si nl o v oc e l lo fh u m a nc o l o nc a n c e r t oe x a m i n e w h e t h e rn s p 0 9 2 g e n e c o u l dh a v es o m ee f f e c to nc e l l g r o w t h ， l o 、，o - n s p 0 9 2s t a b l ec e l ll i n e sw e r ee s t a b l i s h e da n dc e l lg r o w t hc u r v e w a sd e s c r i b e d i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h eg r o w t hr a t eo fl o 、，0 一n s p 0 9 2 s t a b l ec e l ll i n e sw a si n h i b i t e d c l o n ef o r m a t i o na s s a ya l s os h o w e dt h a tt h e e f f i c i e n c y o fc l o n ef o r m a t i o nw a sc l e a r l yr e d u c e dc o m p a r e dw i t h t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o no fp c d n a 3 1i nl o v 0c e l l s a n dc e l lc y c l ea n a l y s i s a l s os u p p o r t e dt h o s er e s u l t ss i n c eg 1p h a s eo fs t a b l ec e l ll i n e sw a s a r r e s t e d s on s p 0 9 2c o u l db eap o t e n t i a lt u m o rs u p p r e s s o rg e n e i n a d d i t i o n ，n s p 0 9 2i sa l s on a m e da sc h l d lp r o t e i n ，w h i c hm e a n sh o m o s a p i e n sc h i t i n a s ed o m a i nc o n t a i n i n g1 b u tw h e nm u l t i - a l i g n m e n tw a s p e r f o r m e da m o n gn s p 0 9 2a n do t h e rk n o w nh u m a nc h i t i n a s ep r o t e i n s e q u e n c e s ，n os i m i l a r i t i e sw a sf o u n d e s p e c i a l l y , n s p 0 9 2d i d n tc o n t a i n c o n s e r v e d p r o t e i ns e q u e n c e f d g l d l d w e f p g r e s p o n s i b l e f o r c a t a l y z i n gc h i t i na c t i v i t y t h e r e f o r e ，n s p 0 9 2w a s n o tac h i t i n a s e v i l l 上海交通大学博士学位论文 n s p 0 9 6p r o t e i nh a s1 3 2a m i n oa c i d sa n dl o c a t e si nh u m a n c h r o m o s o m e1 9 p 1 3 3 ，a n di t st h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i g h ti s1 4 k d a i t w a sp r e d i c t e dt ob eo n en o n - c l a s s i c a ls e c r e t e dp r o t e i nb ys e c r e t o m ep 1 0 bs o f t w a r e t h e7 2 血a m i n oa c i di s p r e d i c t e d a sas e r i n e p h o s p h o r y l a t i o n s i t e a n dt h e1 0 ma n da m i n oa c i di s p r e d i c t e d a sa t h r e o n i n e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e b yc l o n ec o n s t r u c t i o ni np c d n a 3 1 b v e c t o r , t r a n s f e c t i o ni nc o s 一7c e l la n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i sw ek n o wt h a t n s p 0 9 6w a sas e c r e t e d p r o t e i n f o rt e s t i f y i n g t h e p r e d i c t i o n o f n o n c l a s s i c a ls e c r e t e dp r o t e i n ，w ed i db r e f e l d i na ( b f a ) i n t e r f e r e n c e e x p e r i m e n t b y 4 8 ha n d7 2 hb f at r e a t m e n t r e s p e c t i v e l yd u r i n g t r a n s f e c t i o n t h es e c r e t i o no fn s p 0 9 6w a sn o ta f f e c t e d s ot h i sr e s u l t p r o v e dt h a tn s p 0 9 6e n c o d e san o n - c l a s s i c a ls e c r e t e dp r o t e i na n di t s s e c r e t i o np a t h w a yw a se r g o l g i - i n d e p e n d e n t t h e ns u b c e l l u l a rl o c a t i o n a l s ou n c o v e r e dt h a ti tw a sl o c a t e di nt h ec y t o p l a s ma n dd i d n tc o - l o c a l i z e w i t hg o l g ia p p a r a t u s b yp n g a s efd e g l y c o s y l a t i o na n a l y s i s ，n s p 0 9 6 w a sc o n f i r m e dt h a ti th a dn on - g l y c o s y l a t i o nm o d i f i c a t i o ns i t e s i n a d d i t i o n ，r t - p c re x p e r i m e n t u n c o v e r e dt h a ti tw a s e x p r e s s e d s p e c i f i c a l l yi nl i v e rt i s s u e ，a n dd i f f e r e n t i a t e d l yi nn o r m a ll i v e rt i s s u e ， w h i c hs u g g e s t e dt h a tn s p 0 9 6m i g h th a v es o m ef u n c t i o ni nl i v e r i n a d d i t i o n ，n s p 0 9 6w a sap o t e n t i a ly o u n gg e n es i n c ei tw a so n l yf o u n d f r o mp a nt r o g l o d y t e si nt h es c o p eo fp u b l i cs e q u e n c e do r g a n i s m s a n di t u n d e r w e n ta p u r i f y i n gs e l e c t i o nw h i c hi m p l i e dt h a tt h e f u n c t i o no f i x 上海交通大学博上学位论文 n s p 0 9 6 p r o t e i nw a sa n - r e m o v e d k e y w o r d s ：s e c r e t e dp r o t e i n ，n o n - c l a s s i c a ls e c r e t i o n ，t r a n s f e c t i o n ， w e s t e r nb l o t ，b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s x 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：至钦秉 日期：加f 年月纠日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：劲乏象 日期：加年月刁e t 砌喈 日期：护年月2 fe t 上海交通大学博 学位论文 1 经典的分泌蛋白 1 分泌蛋白的重要生理功能 第一章前言 分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分 化、增殖、凋亡和信号转导等过程中发挥着重要作用。人体中分泌蛋白占人类蛋 白质组的十分之一，消化酶、胞外基质与血浆中的很多主要因子，以及激素、神 经肽、细胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潜在的临床应用价值，并已 得到了广泛的应用，如生长激素、干扰素和白细胞介素、促红细胞生成素、集落 细胞刺激因子、胰岛素等。越来越多的新的分泌蛋白正作为抗体作用的靶点及候 选药物而不断被发现“1 。 1 2 分泌蛋白的合成及其经典分泌途径 分泌蛋白的合成是在细胞质基质中开始的。首先合成的是一段含1 6 2 6 个 氨基酸残基的多肽链，这段多肽链能够起到信号的作用，叫做信号肽( s i g n a l p e p t i d e ) 。当多肽链延伸至8 0 个氨基酸左右时，n 端的信号肽与信号肽识别颗 粒( s r p ) 结合使肽链延伸暂时停止，并防止新生肽n 端损伤和成熟前折叠，直 至信号肽识别颗粒与内质网膜上的停泊蛋白( s r p 受体) 结合，核糖体与内质网 膜的易位子( t r a n s l o c o n ) 结合。此后，信号识别颗粒脱离了信号序列和核糖体， 返回细胞质基质中重复使用，肽链又开始延伸。以环化构象存在的信号肽与易位 子组分结合并使孔道打开，信号肽穿入内质网膜指引正在合成的多肽链穿过内质 网膜，转移至内质网腔中。内质网腔面上的信号肽酶将信号肽切除，多肽链继续 延伸，完成整个多肽链的合成。进入内质网腔的多肽链还要经过加工，如糖基化、 羟基化、酰基化和二硫键的形成等，最终成为有特定结构和功能的蛋白质，然后 由内质网腔膨大、出芽形成具膜的小泡，包裹着蛋白质转移到高尔基体，把蛋白 上海交通大学博士学位论文 质输送到高尔基体腔内，做进一步的加工。接着，高尔基体边缘突起形成小泡， 把蛋白质包裹在小泡里，运输到细胞膜，小泡与细胞膜融合，把蛋白质释放到细 胞外( f i g 1 - 1 ) “。“。这样的分泌方式又称为经典的或依赖内质网高尔基 体的分泌途径( c l a s s i c a lo re r g o l g id e p e n d e n ts e c r e t o r yp a t h w a y ) 。 分泌蛋白 细胞胍 小泡 商尔基体 核糖体 内质同 图1 一i 合成的分泌蛋白运输到细胞外的过程示意图 f i g i - 1s k e t c hm a po f c l a s s i cs e c r e t e dp r o t e i n st r a n s p o r t e de x t r a c e l l u l a r l y 1 3 分泌蛋白的糖基化 糖基化伴随着多肽链的合成同时进行，是内质网中最常见的多肽链加工方 式。在内质网腔面，寡糖链连接在插入膜内的磷酸多萜醇上，当与糖基化有关的 氨基酸残基出现后，通过在膜上的糖基转移酶( g l y c o s y l t r a n s f e r a s e ) 的作用， 将寡糖基由供体磷酸多萜醇转移到新生肽链特定的三肽序列的天冬氨酸残基上 ( a s h - x - s e t 或a s n - x - t h r ，其中x 是除p r o 以外的任何氨基酸。1 ) ，称为n 一连接的 糖基化( n 一1i n k e dg l y c o s y l a t i o n ) ，与天冬酰胺直接结合的糖都是n 一乙酰葡萄 糖胺。也有少数糖基化是发生在丝氨酸或苏氨酸残基上，称为o _ 连接的糖基化 ( o - l i n k e dg l y c o s y l a t i o n ) 。后者也可能发生在羟赖氨酸或羟脯氨酸上( 如胶 原蛋白) ，与之直接结合的糖是n 一乙酰半乳糖胺。旷连接的糖基化主要发生在高 尔基体中，同复杂的n 一连接的糖基化一样，最后一步是加上唾液酸残基，这一反 应发生在高尔基体反面膜囊和反面高尔基体网状结构( t g n ) 中，至此完成全部 2 上海交通大学博上学位论文 糖基的加工与修饰。 目前对蛋白质糖基化生物学意义的了解还不够深入，从已有的研究结果来 看，不同的蛋白质糖基化具有不同的功能。对多数由高尔基体分选的蛋白质来说， 糖基化并非作为蛋白质的分选信号，而更主要的作用可能是蛋白质在成熟过程中 折叠正确的构象和增加蛋白质的稳定性。但即使是这样，仍很难解释糖侧链在内 质网，特别是在高尔基体中的如此复杂的加工过程。有些学者从进化的角度提出， 因为寡糖链具有一定的刚性，限制了其它大分子接近细胞表面的膜蛋白，这就可 能使真核细胞的祖先具有一个保护性的外被，同时又不像细胞壁那样限制细胞的 形状与运动。这可能是在进化过程中逐步演化产生的。 当多肽链被输送到高尔基体腔后，在内质网腔中加在多肽链上的寡糖链， 还要再进行一系列复杂的加工。酰基化发生在内质网的胞质侧，通常是软脂酸共 价结合在跨膜蛋白的半胱氨酸残基上，类似的酰基化也发生在高尔基体甚至膜蛋 白向细胞膜转移的过程中。多肽链在内质网腔中要进行折叠。不能正确折叠的多 肽链一般不能进入高尔基体，这类多肽一旦被识别，便通过s e c 6 1 p 复合体从内质 网腔转至细胞质基质，进而被蛋白酶体所降解旧。通常经典分泌蛋白在内质网膜 间转位运输过程中是以解折叠的构象存在的“，除了蛋白在细胞核和细胞质中 转换以及蛋白进入过氧化物酶体慨”“”。 3 上海交通大学博士学位论文 2 非经典的分泌蛋白 2 1 非经典分泌蛋白的概念及其特点 在1 9 9 0 年，r u b a r t e l l ia t l 2 1 和h u g h e srcn 3 1 等人分别发现自介素- 1o ( i l - 1 p ) 和半乳糖昔凝集素- 1 ( g a l e c t i n - 1 ) 蛋白没有信号肽，仍能分泌到胞外，而 且分泌途径不经过内质网和高尔基体。这类蛋白的分泌途径被称为非传统分泌 ( u n c o n v e n t i o n a ls e c r e t i o n n o n c l a s s i c a le x p o r t ) 。 w a l t e rn h 4 1 在2 0 0 3 年总结出这类分泌蛋白的一些特点：a n 端没有信号肽； b 分泌不经过典型的分泌细胞器如e r 或g o l g i ，所以也不会有在这种细胞器中 的翻译后修饰例如n 一糖基化；c 分泌不受布雷菲尔德菌素a ( b r e f e l d i na ) “ ”“”( 简称b f h ，一种依赖内质网高尔基体途径分泌的抑制剂) 抑制：d 这种分 泌途径依赖于能量和温度“，而且不同处理会抑制或促迸分泌；e 非经典蛋白的 分泌可以被调控，如g a l e c t i n 一1 的分泌受细胞分化的调控“制；i l - 1b 的分泌 被激活的单核细胞所诱导“。蜘；成纤维生长因子一l ( f g f 一1 ) 的分泌受压力条件 如热激、血清饥饿1