（物理化学专业论文）界面杂交与功能纳米结构生物体系的研究.pdf

摘要 摘要 界面杂交与功能纳米结构生物体系的研究 近年来，d n a 界面杂交模型与功能纳米结构生物体系的构筑，及其界面生 物电化学研究已成为生物传感器和生物芯片研究的热点之一。在基因生物传感器 的研究中，由于粒子一界面相互作用、界面浓度梯度及位阻现象等原因，使得该 固一液相界面反应的热力学及动力学性质与溶液相的相比存在较大的差异。因 而，研究固一液界面上的d n a 杂交对基因生物传感器的设计具有重要的意义。 同时，生物分子与具有及独特光学、电子学、磁学或催化性质的半导体纳米结构 材料相结合，可构建功能化纳米结构生物体系，该体系在生物学研究和医学诊断 中具有诱人的应用前景；研究生物分子与半导体纳米材料的相互作用，有利于构 建各种各样简单、高选择性和高灵敏度的功能纳米结构体系，并考察纳米材料对 生物分子生化功能的影响，即生物分子自身的安全性。 本文的工作围绕着d n a 界面杂交和功能纳米结构生物界面的研究展开，主 要进行了以下两方面的工作：( i ) 采用电化学石英晶体微天平( e q c m ) 现场 监测不同界面电场下完全匹配的靶标d n a 和不完全匹配的靶标d n a 分别与寡 聚核苷酸探针分子杂交的过程，考察了不同界面电场对杂交效率的影响，并进一 步探讨了引入界面电场后探针分子取向和微观作用力对d n a 杂交的影响；( i i ) 利用天然小牛胸腺d n a 作为模板及保护剂，制备c d s 量子点一d n a 生物缀合 物，考察了其荧光性质。研究取得以下主要结果： 一、采用e q c m 研究界面电场对d n a 杂交的影响 1 、控制合适的正电位，通过库仑吸引力富集靶标d n a 到工作电极附近，增 大了与探针分子杂交的几率。但此时，探针分子在电极表面为平躺吸附取向，该 取向使探针分子与电极表面的非特异性吸附达到最大，从而大大减弱了d n a 杂 交的特异性，容易导致假阳性。 2 、控制合适的负电位，使探针分子在电极表面保持垂直吸附取向，该取向 摘要 使探针分子与电极表面的非特异性吸附达到最小，有利于保持d n a 杂交的特异 性，从而有效抑制假阳性。 3 、因无需在电极表面修饰烷基硫醇分子，电极表面探针分子的覆盖度高达 2 2 1 0 1 3m o l e c u l e s c m 。2 ，不但简化了操作步骤，还提高了检测的灵敏度。 二、研究了c d s 量子点- d , 牛胸腺d n a 纳米结构生物体系的荧光性质 1 、分别用s s d n a 和d s d n a 作模板，制备了纳米c d s - - d n a 溶胶，构建了c d s 量子点一d n a 纳米结构生物体系，d n a 也起到了c d s 量子点保护剂的作用。 2 、紫外一可见吸收光谱表明，用焦磷酸钠、s s d n a 或d s d n a 作保护剂所制备 的c d s 量子点吸收的启动( o ns e t ) 波长很接近，与块体材料相比，蓝移了4 5 n m ， 表现出量子尺寸效应；d s d n a 或s s d n a 的量在2 0 0 r a g l - 3 5 0m g l j 的范围内 对所制备的c d s 量子点尺寸和产量影响不大。红外光谱表明，与小牛胸腺d n a 相比，c d s - - d s d n a 和c d s - - s s d n a 纳米结构生物体系中归属于d n a 的一些特 征峰位置几乎没有发生位移，c d s 量子点可能不会造成d n a 的损伤。光电流谱 表明，焦磷酸钠保护的c d s 量子点的光电流信号很显著，而s s d n a 或d s d n a 保护的c d s 量子点由于表面缺陷态密度较大，几乎检测不出光电流信号。 3 、荧光光谱试验结果表明： ( 1 ) 用d n a 作保护剂，增强了c d s 量子点的荧光光谱强度，表现为：i c d s - s a 4 p 2 0 7 ic d s 曲d n a ic d s s s d n a 。 ( 2 ) c d s - - d n a 的荧光强度随d n a 量( 在2 0 0 m g l 一3 5 0m g l 。1 范围内) 的增 加而增强。 ( 3 ) 解释了d n a 对c d s 量子点的荧光增强作用机理： a 、由于d n a 的磷酸骨架具有一定的刚性，使吸附在带负电荷的d n a 磷酸骨架 上的c d s 量子点相互间碰撞的几率比自由时小得多，同时c d s 量子点在磷酸骨 架上的排列也比自由时有序。这两个因素有利于提高了荧光的量子产率；d s d n a 上c d s 量子点间的距离比s s d n a 上的近，故其相对容易发生碰撞，导致荧光光 谱强度较后者弱。 b 、本实验测得的c d s 量子点的荧光谱带是表面缺陷态引起的，而光电流谱的实 验表明，c d s 量子点的表面缺陷态密度顺序是：c d s n a 4 a 2 0 7 c d s 一 摘要 d s d n a c d s - - s s d n a ，该顺序正好与c d s 量子点的荧光光谱强度的顺序一致。 关键词：d n a ；界面杂交：纳米结构生物体系 i i i a b s t t a c t a b s t r a c t t h e i n v e s t i g a t i o no fi n t e r f a c i a lh y b r i d i z a t i o na n d f u n c t i o n a l n a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e s r e c e n t l y ，t h er e s e a r c hi n t e r e s t si nt h eb i o s e n s o r sa n db i o c h i p sa r ef o c u s e do nt h e f a b r i c a t i o no ff u n c t i o n a ln a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e sa n dm o d e lo fd n ai n t e r f a c i a l h y b r i d i z a t i o n , a n dt h ef u n d a m e n t a l u n d e r s t a n d i n g o ft h ei n t e r f a c i a l b i o e l e c t r o c h e m i c a lp r o c e s s e sw i t h i nt h e s es y s t e m s t h e r m o d y n a m i c sa n dk i n e t i c so f t h ei n t e r f a c er e a c t i o nm a ys u b s t a n t i a l l yd i f f e rc o m p a r e dt ot h es a m er e a c t i o ni nb u l k s o l u t i o na sar e s u l to ft h es p e c i e s - i n t e r f a c ei n t e r a c t i o n , i n t e r r a c i a lc o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t sa n ds t e r i ch i n d r a n c ei nt h ei n v e s t i g a t i o no fg e n eb i o s e n s o r s s oi ti sv e r y i m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h ed n ah y b r i d i z a t i o no ns o l i d - l i q u i di n t e r f a c ef o rt h e d e s i g no fg e n eb i o s e n s o r sa n dn a n o s t m c t u r e db i o i n t e f f a c e s a tt h es a m et i m e ， s e m i c o n d u c t o rn a n o m a t e r i a l st y p i c a l l yh a v et h eu n i q u eo p t i c a l ，e l e c t r o n i c ，m a g n e t i c ， a n d c a t a l y t i cp r o p e r t i e s t h u s ，t h e a r c h i t e c t u r eo ff u n c t i o n a ln a n o s t r u c t u r e s b i o i n t e r f a c e s ，w h i c ha r ef a b r i c a t e db ys e m i c o n d u c t o rn a n o m a t e r i a l sa n db i o m o l e c u l e s ， h a sp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s f o rb i o l o g i c a la p p l i c a t i o na n dm e d i c a ld i a g n o s i s 1 1 1 e r e s e a r c ho fi n t e r a c t i o nb e t w e e ns e m i c o n d u c t o rn a n o m a t e r i a l sa n db i o m o l e c u l e si s p r o p i t i o u st of a b r i c a t ev a r i o u sf u n c t i o n a ln a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e s 晰t l ls i m p l e ， h i g h l ys e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y t h eb i o c h e m i c a lf u n c t i o n a le f f e c t so fn a n o s t r u c t u r e d m a t e r i a l so nb i o m o l e c u l e s ，n a m e l yt h es e c u r i t yo fb i o m o l e c u l e st h e m s e l v e s ，a r e s t u d i e d a c c o r d i n g l y , t h ee m p h a s i so ft h i st h e s i si sp l a c e do ni n v e s t i g a t i n gt h ei n t e r f a c i a l d n a h y b r i d i z a t i o na n df u n c t i o n a ln a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e t h e s ew o r k sc a l lb e d i v i d e di n t ot w op a r t s ：( 1 ) t h eh y b r i d i z a t i o no fo l i g o n u c l e o t i d e sp r o b e 、i t i lm a t c h e d o rm i s m a t c h e dd n at a r g e tw a sm o n i t o r e db yac o m b i n a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a l c o n t r o la n di ns i t uq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c et e c h n i q u e 1 1 1 ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n t i n t e r f a c i a le l e c t r i c f i e l do nt h ee f f i c i e n c yo fh y b r i d i z a t i o nw a si n v e s t i g a t e d 1 1 1 ee f f e c t o ft h eo r i e n t a t i o no fo l i g o n u c l e o t i d e sp r o b ea n dm i c r of o r c e so nd n ah y b r i d i z a t i o n l v u n d e ri n t e r f a c ee l e c t r i cf e l dw a sd i s c u s s e d ；( 2 ) t h ed n a - t e m p l a t em e t h o d 、m 醛u s e d t op r e p a r ec d sq d s ( q u a n t u md o t s ) - c td n a ( c a l ft h y m u sd n a ) n a n o s t r u c t u r e d b i o c o n j u g a t e s ，a n dt h e i rp h o t o l u m i n e s c e n t ( p l ) p r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e m a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e d 嬲f o l l o w s ： 1 t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n ti n t e r r a c i a le l e c t r i c f i e l do nt h e e f f i c i e n c y o f h y b r i d i z a t i o ni n v e s t i g a t e db ye l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( e q c m ) t e c h n i q u e ( 1 ) u n d e rt h ec o n d i t i o no fc o n t r o l l i n gas u i t a b l ep o s i t i v ep o t e n t i a l ，t a r g e t d n aw i l lb ee n r i c h e da r o u n dt h ew o r k i n ge l e c t r o d e ，w h i c hi m p r o v e st h er a t eo f h y b r i d i z a t i o no fo l i g o n u c l e o t i d e sp r o b e 、i t l lt a r g e td n a i t sf o u n dt h a ta tt h i s c o n d i t i o nt h eo r i e n t a t i o no fp r o b ed n aa d s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ei s p a r a l l e l ，a n dt h eo r i e n t a t i o nl e a d st ot h em a x i m u mn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o nb e t w e e n p r o b ed n a a n de l e c t r o d es u r f a c e t h u s ，t h es p e c i f i c i t yo fd n a h y b r i d i z a t i o ni s w e a k e n e d w h i c hl e a d st o f a l s ep o s i t i v e s ( 2 ) t h eo r i e n t a t i o no fp r o b ed n a a d s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ei s p e r p e n d i c u l a rb ym e a n so fa na p p r o p r i a t en e g a t i v ep o t e n t i a l t h i so r i e n m t i o n l e a d st ot h em i n i m u mn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o nb e t w e e np r o b ed n aa n de l e c t r o d e s u r f a c e ，w h i c hi sp r o p i t i o u st ok e 印t h es p e c i f i c i t yo fd n ah y b r i d i z a t i o na n dc a n a v a i l a b l yh a l th y b r i d i z a t i o nf o rm i s m a t c h e dt a r g e td n a ( 3 ) b e c a u s ei td o e sn o tn e e dt om o d i f yt h ee l e c t r o d es u r f a c eb ya l k a n e t h i o l s ， t h es u r f a c ec o v e r a g eo fp r o b ed n a i s 硒h i g ha s2 2x10 1 3m o l e c u l e s c m 之，w h i c h p r e d i g e s t st h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o na n de n h a n c e st h es e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o n 2 i n v e s t i g a t i o no fp lp r o p e r t i e so fc d sq d s - c td n a n a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e ( 1 ) u t i l i z i n g t h ee l e c t r o s t a t i c a t t r a c t i o n ，c d sq d s - d n an a n o s t r u c t u r e d b i o i n t e r f a c e sw e r ep r e p a r e db yu s i n gd s d n ao rs s d n a 嬲a t e m p l a t eo fc d sq d s i n a d d i t i o n , d n a ，o n t ow h i c hc d sq d s w e r ea t t a c h e d ，a c t e da sa p r o t e c t i n ga g e n t ( 2 ) t h ei 叫i sa b s o r p t i o ns p e c t r as h o wt h a tas i m i l a ro n - s e tw a v e l e n g t ho fc d s q d sp r o t e c t e db ys o d i u mp y r o p h o s p h a t e ，d s d n ao rs s d n a t h ea b s o r p t i o no n s e to f v a b s t r a c t t h e s ec d sq d sb l u e s h i f ta b o u t4 5n mc o m p a r e dw i t ht h a to ft h eb u l kc d s ，w h i c h i n d i c a t e saq u a n t u ms i z ee f f e c t i na d d i t i o n ，t h es i z ea n dp r o d u c t i o no fc d sq d sw e r e a l m o s tn o ta f f e c t e db yd i f f e r e n td s d n ao rs s d n ac o n c e n t r a t i o nw i t h i nt h er a n g eo f 2 0 0m g l t o3 0 0m g l i nt h ei rs p e c t r a , t h ec h a r a c t e r i s t i cp e a k so fd n af r o mt h e n a n o s t r u c t u r e db i o i n t e r f a c e so fc d sq d 卜d s d n ao rc d sq d s - s s d n aa l m o s td o n t s h o wa n ys h i f tc o m p a r e d 淅t l lt h o s ef r o mc td n a t h u s ，i ti sl i k e l yt h a tc d sq d s h a v e n tm a k e da n yd a m a g e0 1 1d n a t h ep h o t o c u r r e n ts p e c t r ai n d i c a t et h a ta r e m a r k a b l ep h o t o c u r r e n ts i g n a lo fc d sq d sc a p p e dw i t hs o d i u mp y r o p h o s p h a t ew a s o b s e r v e d b u tt h ep h o t o c u r r e n ts i g n a lo fc d sq d sp r o t e c t e db yd n aw a sh a r d l y o b s e r v e d ，d u et om a n ys u r f a c ed e f e c ts t a t e s ( 3 ) t h ea n a l y s i so np ls p e c t r as h o w s t h a t ： ( a ) t h ep le n h a n c e m e n te f f e c to fd n a o nc d sq d si se x p r e s s e d 鹤f o l l o w s ： i c d s - n a 4 p 2 0 7 ic d s - d s d n a ic d s 哪d n a ( b ) t h ep li n t e n s i t yo fc d sq d s d n a e n h a n c e sw h i l ei n c r e a s i n gt h ed n a c o n c e n t r a t i o nw i t h i nt h er a n g eo f2 0 0 m g l t o3 0 0 n a g l 一 ( c ) t h ef a c t o r so ft h ep le n h a n c e m e n te f f e c to fd n a o nc d sq d sa r e ： ( a ) t h ep h o s p h a t eb a c k b o n eo fd n a h a sac e r t a i nr i g i d i t y t h er a t eo fc o l l i s i o n s b e t w e e nc d sq d so nt h ep h o s p h a t eb a c k b o n e 、 r i t l ln e g a t i v ec h a r g ei sf a rl e s st h a n t h a ti nu n r e s t r i c t e ds p a c e ，w h i c hl e a d st om o r eo r d e r e da r r a yo fc d sq d s t h e s et w o f a c t o r se n h a n c et h ep lq u a n t u my i e l d t h ed i s t a n c eb e t w e e nt h ec d sq d sa d s o r b e d o nd s d n ai ss h o r t e rt h a nt h a t0 1 1s s d n a t h u s ，t h ec d sq d sa d s o r b e do nd s d n a 御 e a s i e rt oc o l l i d e ，w h i c hl e a d st oaw e a k e ri n t e n s i t yo fp l ( b ) t h ep ls p e c t r a lb a n do fc d sq d so b s e r v e di sd u et os u r f a c ed e f e c ts t a t e s t h ei n t e n s i t ys e q u e n c eo fs u r f a c ed e f e c ts t a t e so fc d sq d sf r o mp h o t o c u r r e n ts p e c t r a i s ：c d s - n a 4 p 2 0 t c d s - - d s d n a 1 8 ) 【。d n a 储备溶液采用 i r i s 缓冲溶 液( 10 m m o l l 1 i r i s ，1 0m m o l l n a c l ，p h = 7 4 ) 配置。 p b s 缓冲溶液( 0 1 3 6 7t o o l l 1 n a c i ，0 0 0 2 7t o o l l k c i ，0 0 0 9 7 m o l l n a 2 h p 0 4 ，0 0 0 7 3m o l l k h 2 p 0 4 ) ，p h = 7 0 。 其他试剂均为分析纯。 实验所需的水溶液均经m i l l i p o r em i l l i q ( 1 8m q e r a ) 超纯水净化系统过滤 后的超纯水配制。 2 2 电极和电解池 一、电极 ( 一) 工作电极( w e ) ：e q c m 的工作电极为a t - c u t 石英晶振电极( 双面镀金， 9m h z ，金电极的几何面积是0 1 9 6c m 2 ，质量灵敏度为1 0 7n g h z j ) ；光电流谱 测试使用的电极为i t o 电极： 3 l 第二章实验 ( 二) 辅助电极( c e ) ：铂片电极。 ( 三) 参比电极( i 也) ：饱和甘汞电极( s c e ) ，文中除特别说明外所有电极电 位均相对于s c e 。 二、电解池 电化学石英晶体微天平实验专用的自制t e f l o n 反应池( 如图2 2 1 所示) 。 金电极 图2 2 1 电化学石英晶体微天平实验专用的自制t e f l o n 反应池示意图 2 3 实验条件 文中所有的实验及测量除特殊说明外均在常温常压下进行，每个实验具体的 操作步骤以文中说明为准。 电化学实验 2 4 实验仪器 3 2 铂电极 扩 第二章实验 m o d e l2 6 3 恒电位仪( e g & gp a r ) ；c h i 6 6 0 型电化学工作站( c hi n s t r u m e n t s ， m o d e l6 6 0e l e c t r o c h e m i c a lw o r k s t a t i o n ，u s a ) 二、紫外一可见光谱( u v ) 测量 日本岛津( s h i m a d z u ) 公司生产的u v - 2 1 0 0 型紫外一可见分光光度计 三、荧光光谱测量 日本日立( h i t a c ) 公司生产的f - 4 5 0 0 型荧光光谱仪 四、拉曼散射光谱测量 法国d i l o r 公司生产的 a b r a mi 型共焦显微r a m a l l 光谱仪。激发波长为 6 3 2 8n m ( 红光) ，谱仪分辨率为2c m 1 。 五、电化学石英晶体微天平( 印c m ) 实验 现场e q c m 检测系统是由m o d e l2 6 3 恒电位仪( e g & gp a r ) 和q c a - 9 1 7 型 石英晶体微天平( p e r k i ne l m e ri n s t r u m e n t s ) 组成。 六、光电流谱测量 光电流谱技术中，通常进行两种测量：( 1 ) 恒定电位下，测量光电流i p i l 与激 发光波长h 或光子能量b y ) 之间的关系，得到的谱图是光电流作用谱( 简称光电流 谱) ；( 2 ) 恒定波长下，测量光电流i p h 与电极电位9 之间的关系，得到的谱图为 光电流一电位曲线。 本文利用自行研制的联用系统进行光电化学测量【2 1 。该系统包括光学系统、 电化学控制系统、数据采集和计算机控制系统四个部分，可在紫外一可见光区测 量相对反射率变化电极电位曲线( a r r - - 叩) 、相对电反射差谱( r 依以) 、光电 流电极电位曲线( i p h q ) 、光电流谱( i p h 的、光电流时间曲线( i p h d 、电极 交流阻抗、m o t t - s c h o t t k y 图及光电容谱。测量光伏曲线时采用氙灯灯源直接照射 电极，实验中所测量的光电流均不包含暗态电流。 光电流实验中，来自光源的光通过光栅单色仪分离出单色光，单色光经过光 第二章实验 斩波器调制成脉冲单色光，再透过光学电解池的窗片或电池的透明导电基底准直 投射到研究电极表面，光电流信号则直接被电流跟随器转换为电压信号后由锁相 放大器检测。 本实验系统所配仪器型号、规格及生产厂家如下： 1 氙灯：氙灯采用上海电光器件厂生产的双环牌型球形氙灯 2 单色仪：a c t or e s e a r c hc o r p o r a t i o n ( a r c ) 公司生产的s p e c t r o p r o 一2 7 5 型0 2 7 5 m e t e rt r i p l eg r a t i n gm o n o c h r o m a t o r s p e c t r o g r a p h 3 单色仪波长扫描控制器件：a c r 公司生产的s p e c t r o d r i v e t m ，s t e p p i n gm o t o r s c a nc o n t r o l l e r 4 光斩波器：美国e g & g ，p a r 公司生产的m o d e l1 9 4 a ，速度：0 5 - - 5 0 5 r p s 5 光偏振器 6 光电倍增管及光电倍增高压电源：s t a n f o r dr e s e a r c hs y s t e m s ，i n c 生产的 m o d e lp s3 2 5 型h i g hv o l t a g ep o w e rs u p p l y ，2 5 0 0 v ，2 5 w 7 恒电位仪恒电流仪：e g & gp a r2 7 3 恒电位仪 8 锁相放大器：5 2 0 6t w op h a s el o c k - i na m p l i f i e r ，美国e g & g 公司生产 9 利用带有r k p 5 7 6 a 探针的r k 5 7 1 0 光功率测试仪测量入射光强。 七、其他 上海雷磁仪器厂生产的p 耶一2 9 0 型便携式酸度计 参考文献 【l 】赖江南，薛建明，覃怀莉，陈国华，魏雄辉，王宇刚小牛胸腺d n a 的m e v 重离子辐照 研究【j 】蔹炭术2 0 0 5 ，2 8 ：6 7 8 - 6 8 0 【2 】2l u o ，j ；l i n , z h ；w u , l l ；h u a n g , y ；t i a n , z w i ns i t ue l e c t r o n i cs p e c t r o s c o p i c t e a e h n i q u e sf o ri n t e r r a c i a le l e c t r o c h e m i s t r y j c h e m i c a lr e s e a r c hi nc h i n e s eu n i v e r s i t r i e s , 1 9 9 6 ，1 2 ( 3 ) 第三章界面电场对d n a 杂交过程的影响 第三章 界面电场对d n a 杂交过程的影响 基因传感器分子识别( 即感受器) 的基础是修饰在固体表面上d n a 探针分 子与溶液中靶标d n a 的杂交。由于粒子一界面相互作用、界面浓度梯度及位阻 现象等原因，这种固一液相界面反应与溶液相中同样的反应相比，热力学及动力 学性质有很大不同。因此，研究界面电场对d n a 杂交的影响具有重要的意义。 目前，如何快速、简便及高效检测修饰在固体表面的d n a 探针分子与其互 补靶标序列的特异性识别，作为d n a 界面杂交的关键技术问题之一迄今还待解 决与完善。同时，还需要建立一种d n a 表面杂交模型，解释一系列相关热力学 和动力学参数变化的规律。为了探究这些问题，本章利用末端修饰巯基的寡聚核 苷酸探针分子在金基体表面自组装，并采用e q c m 现场监测不同界面电场下完 全匹配的靶标d n a 和不完全匹配的靶标d n a 分别与寡聚核苷酸探针分子杂交 的过程，考察了不同界面电场对杂交效率的影响，并进一步探讨了引入界面电场 后探针分子取向和微观作用力对d n a 杂交的影响。 第三章界面电场对d n a 杂交过程的影响 3 1 引言 由于基因检测和临床医学诊断的需要，基因传感器和基因芯片的研究引起了 广大科研工作者的关注。基因传感器分子识别的基础是修饰在固体表面上d n a 探针分子与溶液中靶标d n a 的杂交。作为一种界面装置，d n a 探针分子与溶液 中靶标d n a 的界面杂交与膜上杂交相似，属于固一液界面杂交。界面杂交过程 及杂交效率受到多种因数的制约，包括表面对杂交识别过程的影响、基体表面 d n a 探针的覆盖度、探针的吸附取向和探针分子间的横向相互作用等1 5 一。使得 这种固一液相界面反应与溶液相中同样的反应相比，热力学及动力学性质有很大 不同。传感器表面的杂交与检测的最优化条件往往是有冲突的( 尤其是在电化学 基因传感器中) 【l 】：( 1 ) 强吸附有利于d n a 探针分子在传感器表面的固定，有 利于增大检测信号，但强吸附的同时可能会加剧非特异性吸附，从而降低d n a 杂交的特异性及阻碍杂交的进行；( 2 ) 为了降低检测限，传感器的面积应尽可 能小，但为了更容易捕获靶标d n a ，又需要面积相对大的传感器。在已有的工 作中，为了减少探针分子与固体表面的非特异性吸附，一般采用在传感器表面组 装探针分子后，再修饰烷基硫醇的方法【2 。4 1 。但这种方法也不能完全除去非特异 性吸附，而且组装烷基硫醇后，降低了传感器表面探针分子的覆盖度，不利于提 高d n a 检测的灵敏度。 h e a t o n 等采用表面等离子激光共振( s p r ) 光谱技术，研究了界面电场对 d n a 杂交和变性的影响。通过控制正的电极电位富集带负电荷的靶标d n a ，此 时杂交效率较高，但容易发生错配杂交( 假阳性) ；控制较负的电极电位排斥靶 标d n a ，使探针分子基本上不能杂交，还能在几分钟内使大部分错配杂交的d n a 解链。他们认为界面电场主要通过电极与靶标d n a 之间的库仑力来影响d n a 杂交【4 】。我们对自组装d n a 的电化学现场s e r s 研究表明，d n a 在电极表面形 成双螺旋时以b 型构象存在，且可以通过控制界面电场使d n a 探针分子在电极 表面的吸附取向在垂直一斜插一平躺之间有规律的变化，认为引入界面电场后， 探针分子的取向变化也会影响到d n a 的杂交过程【l 引。 石英晶体微天平( q c m ) 的石英晶振电极上的微小的物质质量变化，都会 3 6 第三章界面电场对d n a 杂交过程的影响 引起石英晶振电极的谐振频率变化。当其它条件相同时，晶体谐振频率的降低正 比于电极上质量的增加，s a u e r b r e y 方程【1 6 1 ( 公式3 1 1 ) 描述了两者之间的关系： 厂：- 2 6 x 1 0 6xf02x 出l ( 3 1 1 ) = 一 ( 1 1 ) 彳 其中，厂为变化的频率，万为基频，为变化的质量，彳为电极面积。自o k a h a t a 等1 1 7 1 首次用q c m 对组装在石英晶振电极上的d n a 探针分子与溶液中靶标序列 杂交进行实时、定量检测。近年来q c m 在核酸分子杂交识别和测定方面已显示 出巨大的潜力，被公认为一种无须标记即可对d n a 杂交进行实时检测的有效手 段，具有广阔的应用前景【1 8 2 6 1 。 目前，未见有关从分子水平对d n a 界面杂交所引起的结构、构象变化进行 现场、动态研究的报道。建立一个合理的d n a 表面杂交模型具有重要意义。 本章采用电化学石英晶体微天平( e q c m ) ，现场监测不同界面电场下完全 匹配的靶标d n a 和不完全匹配的靶标d n a 分别与探针分子杂交过程，研究施 加界面电场对d n a 杂交过程的影响。 3 2 寡聚核苷酸探针分子自组装单层的制备和组装量的测量 一、电极预处理 电极用浓硫酸和双氧水( 比例为浓h 2 s 0 4 ：h 2 0 2 = 3 ：1 ) 的混合液浸泡1 5m i n ， 除去电极表面的有机物，再分别用三次水和超纯水淋洗电极表面，氮气吹干，电 极可以通过以上步骤处理进行反复利用多次。 将金电极在0 1m o l l h 2 s 0 4 溶液中以l o o m v s j 的扫描速度在一2 5 0 mv + 1 3 0 0 mv ( v ss c e ) 之间进行循环电位扫描，直到得到稳定的循环伏安图( 图 3 2 1 ) 。电化学清洗后，再分别用三次水和超纯水淋洗电极表面。 3 7 第三章界面电场对d n a 杂交过程的影响 宅 2 与 u 0 - 4 0 004 0 08 1 2 0 0 p o r e n t i a l l m v 图3 2 1 金电极在0 1t o o l l 。1h 2 s 0 4 溶液中的循环伏安图 二、寡聚核苷酸探针分子自组装单层量的制备和测量 由于长时间存放的硫醇易被氧化形成二硫化物【2 7 1 。因此，使用前需对寡聚核 苷酸探针以d t t 还原处理。还原处理按以下方法进行 2 8 1 ：将一定体积和浓度的 寡聚核苷酸探针与一定体积和浓度的d 订按一定比例混合( 如3 0p l l 6p m o l l 。1 寡聚核苷酸探针与7 5l a l 0 0 3m o l l d t r ) ，并在室温下反应6 0m i n ，然后将一 定体积的乙酸乙脂( 如1 5p l l 0m o l l 以) 加入上述反应混合物中，旋转混合3 0s 后离心8m i n ，小心吸出浮在上层的溶液，下层溶液即可用于d n a 探针的固定 化过程。 石英晶振电极的频率变化不但与电极表面的质量变化有关，干态下电极频 率还与导纳成线性关系，因此必须首先测定干态下电极频率与导纳关系的工作曲 线。此外，干态时的电极频率会随时间和环境变化而略为波动，可以通过选取一 石英晶振电极作为参考电极，扣除在工作电极组装探针分子期间因电极频率波动 引起的误差。我们通过以下步骤制备和测量d n a 探针分子自组装单层量： 1 、测量参考电极频率与导纳关系的工作曲线，并得到斜率；工作电极经 预处理后，真空抽干3 0m i n ，测量工作电极频率与导纳关系的工作曲线，并 得到斜率，得到干态空白电极的频率与导纳的关系曲线，如图3 2 2 所示。 第三章界面电场对d n a 杂交过程的影响 2 、测量工作电极和参考电极的频率及相应的导纳值( 参考电极对应的频率 和导纳用厶和表示；工作电极对应的频率和导纳用血和表示) 。 3 、然后在工作电极表面滴加经d t t 处理过的h s s s d n a 溶液，室温下自组 装2h 后，工作电极用超