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含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 摘要 内容摘要：毛细管电色谱是近年来发展起来的一种高效、快速的微分离技术， 它既有毛细管电泳的高效性又有高效液相色谱的高选择性。毛细管电色谱整 体柱由于具有制备简单、无需封口和固定相表面易于改性等优点，越来越受 到人们的关注。 在传统填充柱反相液相色谱中，固定相、待分离组分和流动相三者之间 相对极性的大小对组分在固定相上的保留行为及固定相对组分的选择性具有 十分重要的影响。在固定相极性不可改变的情况下，通常利用调整流动相的 组成，从而改变流动相极性大小的方法来控制组分的保留时间和固定相对组 分的选择性。对疏水性组分来说，降低流动相的极性可缩短组分的保留时间， 但会使固定相对组分的选择性变差；提高流动相的极性可改善固定相对组分 的选择性，但会导致组分的保留时间明显增加，影响分析效率。 本研究利用全氟辛基甲基丙烯酸酯部分取代整体固定相制备过程中所用 的甲基丙烯酸丁酯单体，制备了含c f 键疏水链的新型弱极性毛细管电色谱整 体固定相，并在电色谱操作模式下比较了几类化合物组分在含氟( 弱极性) 和非 含氟( 强极性) 整体固定相上的保留行为。结果表明，在流动相极性相同的情况 下，组分在弱极性的含氟整体固定相上的保留时间明显缩短，固定相对组分 的选择性也得到某种程度的改善。该实验结果对利用反相毛细管电色谱分离 疏水性较强的大分子组分，提高分离速度具有十分重要的意义。 紫外可见光分光光度法是目前毛细管电色谱分析中最常用的检测方法。 本文采用自制u 形检测池可有效提高光程，从而提高了该方法的检测灵敏度： 参考有关文献，建立了一种简单而实用接合毛细管整体柱和u 形检测池的方 法，可通过更换检测池来解决毛细管整体柱在检测窗口处易断的问题。 关键词：毛细管电色谱；含氟固定相；整体柱 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 a b s t r a c t c o n t e n t ： c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ( c e c ) i sa r e l a t i v e l y n e w m i c r o - s e p a r a t i o nt e c h n i q u e t h a tc o m b i n e st h e h i g he f f i c i e n c yo fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n dt h eh i g hs e l e c t i v i t y o fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a c c o r d i n g l y , i th a sa t t r a c t e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni n r e c e n ty e a r s u pt on o w , m o n o l i t h i cc o l u m n sh a v eb e e nc o n s i d e r e da st h em o s t s u i t a b l es t a t i o n a r yp h a s e sf o rc e cd u et ot h e i rs i m p l ep r e p a r a t i o np r o c e d u r e ， u n i q u ep r o p e r t i e sa n dn on e e d sf o rf r i t s i nt r a d i t i o n a lh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , t h ep o l a r i t yo ft h e s o l u t ei sr o u g h l yi n t e r m e d i a t eb e t w e e nt h o s eo ft h et w oc h r o m a t o g r a p h i cp h a s e s t h ec a p a c i t yf a c t o ra n dt h eg e n e r a ls e l e c t i v i t yc a nb ea f f a c t e db yp o l a r i t i e so ft h e t h r e et e r m s r e a s o n a b l er e t e n t i o nt i m e sa n dg e n e r a ls e l e c t i v i t yc a nb eo b t m n e d 、 r i t hm o b i l ep h a s eo f a d e q u a t ep o l a r i t y , w h e nt h es t a t i o n a r yp h a s ep o l a r i t yi sk c p t c o n s t a n t t h el o w e rt h em o b i l ep h a s ep o l a r i t y , h o w e v e r t h el o w e rt h ec a p a c i t y f a c t o rs h o u l db e ，a n dh e n c e ，t h el o w e rt h es e l e c t i v i t yo ft h ec h r o m a t o g r a p h i c s y s t e mb e c o m e s t oo p p o s i t ei sa l s ot r u e i nt h i st h e s i s ，an e wl o wp o l a r i t yo ft h ef l u o r i n e c o n t a i n i n g o r g a n i c p o l y m e r - b a s e dm o n o l i t h i c ( f c o p m ) s t a t i o n a r yp h a s ew a sp r e p a r e db yu s i n g 2 ( n - e t h y lp e r f l u o r o o c t a n e s u l f o n a m i d o ) e t h y lm e t h a c r y l a t e ( q o f 814 ) a so n eo f t h ep o l y m e r i z a t i o nm o n o m e r s t h er e t e n t i o nb e h a v i o r so fs e v e r a lc o m p o u n d so n f c o p ms t a t i o n a r yp h a s e ( 1 0 wp o l a r i t y ) a n dc o n v e n t i o n a lo r g a n i cp o l y m e r - b a s e d m o n o l i t h i c ( c o p m ) s t a t i o n a r yp h a s e ( s t r o n gp o l a r i t y ) w e r ec o m p a r e du n d e rt h e s a m ee l e c t r o c h r o m a t o g r a p h i ce x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tt h er e t e n t i o nd e c r e a s e sm a r k e d l yo nt h ef c o p ms t a t i o n a r yp h a s ew i t ht h e s e l e c t i v i t ys l i g h t l ym o d i f i e d ，p r o v i d e dt h a tt h em o b i l ep h a s ep o l a r i t yi sk e p t c o n s t a n t t h ef c o p ms t a t i o n a r yp h a s ef o rt h es e p a r a t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l e s a p p e a r st ob cg o o di nt h er e v e r s e d p h a s ec a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y u l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r o m e t r yi st h ed e t e c t i o nm e t h o dm o s tc o m m o n l yu s e d f o rc e cc u r r e n t l y i nt h ep r e s e n tw o r k ，ah o m e m a d ef l o wc e l lo fu - s h a p ew a s u s e df o rp r o l o n g i n gt h eo p t i c a lp a t hl e n g t h ，a n dc o n s e q u e n t l ym o d i f y i n gt h e i i 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 s e n s i t i v i t y a l s oas i m p l em e t h o df o rc o u p l i n gt h eu - s h a p e df l o wc e l la n dt h e c a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m nw i t ht h ed e a dv o l u m en e a r l yz e r ow a se s t a b l i s h e d ， a n dt h u st h ep r o b l e mo fe a s yb r e a k a g ew i t ht h ec o l u m nc a nb er e s o l v e db ys i m p l y r e p l a c i n gt h eb r o k e nf l o wc e l lw i t han e w o n e k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ；f l u o r i n e c o n t a i n i n gs t a t i o n a r yp h a s e ； m o n o l i t h i cc o l u m n i i i 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：曲虹潼 日期：加孵， 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：曲虹谨 指导教师签名：f 套像彳 日 期：2 0 0 2 j j 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 第一章文献综述 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y , c e c ) 是近年来发展十分 迅速的一种以电渗流为驱动力的微分离技术。它是将固定相填充在毛细管中 或在管壁涂布、键合色谱固定相，以电渗流作为流动相的驱动力，根据样品 中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中自身电泳淌度的不 同而实现分离的一种高效微分离技术。毛细管电色谱是高效液相色谱( h p l c l 和毛细管电泳( c e ) 相结合的分离模式，它同时具有h p l c 的高选择性和c e 的 柱效高、分析速度快以及样品和溶剂消耗小等优点。因此，自二十世纪九十 年代以来，c e c 受到了越来越广泛的关注。本章对c e c 的发展历史、基本理 论以及整体柱制备技术等方面进行评述。 1 1 毛细管电色谱的发展历史 早在5 0 年代，电渗流就已在薄层色谱中用作流动相的推动力【1 1 ，但直到 2 0 年代后才由p r e t o r i o u s 等人【2 j 指出用电渗流取代泵作为柱色谱中流动相推动 力的巨大优越性。但由于采用的柱子直径较大，这种优越性并未能充分体现 出来，因而未受到重视。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 等人【3 】发表了在毛细管电泳史上 具有里程碑意义的论文，他们用1 7 0 “m 内径的毛细管柱填充了1 0 “m 的o d s 填料分离了9 甲基葸和芘，获得了3 1 0 0 0n m 的柱效，第一次向世人展示了 毛细管电色谱法的巨大潜力。1 9 8 2 年t s u d a 等人1 5 击】从理论上研究了开管柱毛 细管电色谱中的轴向扩散和峰展宽，证实电渗流作为推动力的优越性。而 k n o x 【| 7 。9 】则主要对填充柱电色谱的理论进行研究，比较了压力驱动和电渗流驱 动的体系中流动相流型、区带展宽和焦耳热效应的不同，从理论上讨论了填 料粒径大小及电解质浓度与电渗流和柱效的关系。随后，毛细管电色谱进入 快速发展的时期。 1 9 9 2 年，m a y e r 等人【l o j 在管壁键合p 环糊精( d c d ) ，首次实现开管电色 谱柱中的手性分离；1 9 9 3 年，l i 等人【i l 】利用仅酸性糖蛋白作为固定相首次实 现了填充柱电色谱手性分离。1 9 9 4 年，b a y e r 等人【1 2 】利用高压液相色谱泵首 次实现电色谱的梯度洗脱，并用该技术成功地分离了寡聚核苷酸。同年， j a c o b s o n 等人【1 3 】制备出第一个电色谱芯片。1 9 9 5 年，l o r d 等人【1 4 】实现了毛细 管电色谱和质谱仪的联用。同年，g u o 等人【l5 j 首次利用溶胶凝胶技术制备了 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 开管电色谱柱。1 9 9 6 年，闰超等人【1 6 】首次利用双电源实现了流动相的梯度洗 脱。同年，f u j i m o t o 及a j e r t 6 n 等人【1 7 舶1 首次报道有机聚合物毛细管电色谱整 体柱。 在最近二十年时间里，毛细管电色谱在理论、柱技术及应用方面都有了 很大的发展。目前已有大量有关毛细管电色谱的综述和专著发表，商品化的 毛细管电色谱仪( u n i m i c r o t e c h n o l o g i e s ，p l e a s a n t o n ，c a ，u s a ) 也有生产。随着这 一技术的不断成熟和完善，毛细管电色谱必将得到越来越广泛的应用。 1 2 毛细管电色谱的基本理论 1 2 1 电渗流 在毛细管电色谱中，流动相驱动力为电渗流，因此电渗流在毛细管电色 谱中是一个十分重要的参数，它直接影响电色谱分离速度。 在填充电色谱中，电渗流的产生主要是靠填料表面电荷形成的双电层。 电渗流方向取决于毛细管管壁或填料表面的带电性质。固定相表面带负电荷， 则形成有剩余正电荷的双电层，电渗流的方向自正极移向负极；而固定相表 面带正电荷，则相反。目前，在填充电色谱中使用最多的填料是以硅胶为基 质的反相填料，其表面的电荷来自于残余硅羟基的解离，因此填料表面带负 电荷，电渗流的方向自正极移向负极。 电渗流的速度可以用下式来表示： c p # ”= 。e = 型塑( 1 - 1 ) r 式中，l l e o 和“c o 分别为电渗流速度和电渗淌度，8 0 和r 分别为真空介电 常数和相对介电常数，e 为电场强度，毛为z e t a 电势，t 1 为流动相粘度。其中 z e t a 电势可用下式表示： 孝：堕( 1 2 )c = il zj s o r 式中，o 为双电层的电荷密度，6 为双电层厚度。由此可见，电渗淌度主 要取决于流动相的粘度和固定相表面的z e t a 电势，而这两个参数受填料表面 的性质、流动相的组成和温度等条件的影响。如填料表面的电荷密度越大， z e t a 电势越高，则电渗流越大；温度越高，流动相粘度越小，电渗流越大。 2 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 流动相的组成如有机调节剂的浓度、离子强度等对电渗流的影响也越大。从 公式( 1 - 1 ) 、( 1 2 ) 中可以看出，电渗流流速与流动相的通道以及柱子的长度无 关，这是它作为流动相驱动力的优势之一。因此，由于在电色谱中不存在压 力降，可通过进一步降低填料的粒径和增加色谱柱的长度来提高单根色谱柱 的柱效。 电泳是在电场作用下带电样品在溶液中的定向移动，其迁移速度可用下 式表示： e # 甜印= e = 兰e ( 1 - 3 ) 鼍弧l l 式中为流动相的介电常数，岛是粒子的z e t a 电势，1 1 为流动相的粘度， p 。p 为电泳淌度。因此，溶质的电泳淌度取决于溶质本身的性质如所带电荷的 大小，质量的大小及分子的形状以及流动相的组成和环境的温度，而和填料 的性质、流体通道的大小无关。在电色谱中，除了与固定相有相互作用以外， 电泳机理对带电样品迁移也有一定的影响。因此，电色谱分离离子型化合物 有可能获得不同于液相色谱和毛细管电泳的选择性。 1 2 2 谱带展宽 目前，几乎所有在液相色谱中采用的固定相都已被用于毛细管电色谱的 研究与应用中。对于中性分子的毛细管电色谱分离，一般可以认为与其在液 相色谱中满足相同的分离机理，差别仅在于流动相驱动形式的不同。因此， 在高效液相色谱中影响分离效率的因素在毛细管电色谱中同样对溶质的谱带 展宽产生影响。此外，电驱动引起的热效应、带电溶质的电泳迁移等也会影 响到谱带展宽。 在色谱中塔板高度可以用v a nd e e m t e r 公式表示： 圩：彳+ 旦+ c u ( 1 - 4 ) 甜 式中，a ，b 和c 分别为涡流扩散、轴向扩散和传质阻力项系数。流动相 的流型对涡流扩散的影响比较大，流动相在不同驱动力的作用下，流型也不 相同。 3 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 ( a ) 电色谱中的柱塞式流型( b ) 高效液相色谱中的抛物线流型 图1 - 1 电色谱和高效液相色谱中的流型比较 图l - l 给出了在电渗流和压力驱动下流动相的流型。在电渗流驱动的体系 中，在不发生双电层重叠的情况下，电渗流的流速不受通道大小的影响，整 个流型呈塞子状，涡流扩散对塔板高度的贡献小；而在压力驱动体系中，流 动相的流型呈抛物线型，离通道壁越近流速越小，越远则流速越大，而且流 速与通道的大小有关，通道的直径越大，流速也越大。因此，在液相色谱中 涡流扩散对塔板高度的贡献比较大。在1 9 8 7 年，k n o x 认为涡流扩散项在电 色谱中比在传统的液相色谱中小【7 】，该预测在1 9 9 1 年得到证实。最近，通过 对填充毛细管电色谱和高效液相色谱中v a nd e e m t e r 方程的比较，表明在填充 毛细管电色谱中a 项和c 项明显比在液相色谱中的a 项和c 项小，而b 项 在两种模式下没有显著差别【1 9 也1 1 ，这是毛细管填充电色谱比高效液相色谱柱 效高的主要原因。对于多孔填料，在孔内壁存在可解离基团，并且在孔内径 大于l o 倍双电层厚度时，在电场下孔内会产生电渗流，从而加速溶质在孑l 内 的传质过程，而在高效液相色谱模式下，溶质在孔内的传质仅为扩散，因此 在毛细管电色谱模式下，传质阻力项小，在较高的流速下，毛细管电色谱依 然可保持较高的柱效。 1 2 3 保留机理 在毛细管电色谱中，中性样品的保留与高效液相色谱中的保留机理是一 致的。而带电样品的保留，既取决于它在固液两相中相互作用，又取决于它 本身的电泳淌度。 h o r v a t h 等人【2 2 1 提出了化合物在毛细管电色谱中的容量因子k 的计算公 式为： 4 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 k ：七+ 七丝+ 堕 - l e o e 。 ( 1 5 ) 式中，k 是化合物在纯色谱中的容量因子；p 。p 和p 。o 分别是溶质的电泳淌度和 电渗淌度。 上式反映了样品分子在毛细管电色谱中的两种保留机理，即色谱机理和 电泳机理。当样品是中性样品时， i 。p = 0 ，此时样品的保留与在高效液相色谱 中的保留机理是一致的，表现为纯的色谱机理；当样品带电荷而与固定相没 有相互作用时，k - - - o ，此时样品的保留表现为纯的电泳机理；当样品既带电荷 又与固定相有相互作用时，样品的保留同时包含了电泳过程和色谱过程。 在实际应用中，经常使用保留因子k ，保留因子的定义如下【2 3 】： 七：幽 t o ( 1 6 ) 式中，t ，和t o 分别是溶质和中性化合物在毛细管电色谱中的保留时间，该 表达式比较直观、容易理解。 1 3 毛细管电色谱整体柱 c e c 是一种高效分离技术，而c e c 柱则是此方法的瓶颈技术，在c e c 的发展过程中，始终伴随着c e c 柱的不断改进和发展。研究新型c e c 柱、揭 示其分离机制是当前c e c 领域的研究热点。 目前应用于c e c 的毛细管柱通常有毛细管填充柱、毛细管开管柱及毛细 管整体柱。填充柱近来发展较快，但需制备柱塞，由此带来柱塞效应，可能 导致运行过程中柱子报废。开管柱虽无封口问题，能够获得较高的柱效，但 其相比小、样品容量低、检测困难，亦受到一定的限制。c e c 柱在技术上遇 到的困难促使了其他毛细管柱制备技术的发展，原位制备的整体毛细管柱即 是其中之一。 所谓整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，又称为棒状柱( r o dc o l u m n ) 、连续床层 ( c o n t i n u o u sb e d ) 、无柱塞柱( f r i t l e s sc o l u m n ) ，是一种用有机或无机聚合方法在 色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相，具有制备方法简单，内部结构均匀， 通透性、重现性好，柱效高，固定相表面易于改性，无需制备塞子和可进行 快速分离等优点，近几年发展迅速。 5 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 1 3 1 整体柱的制备方法 毛细管电色谱整体柱按其制备方法可分为三类：主要有二氧化硅整体柱、 以填充柱为基础的整体柱和聚合物整体柱。 1 3 1 1 硅胶整体柱 硅胶整体柱的制备方法通常采用溶胶凝胶法。将四烷氧基硅烷、聚环氧 乙烷及催化剂在柱内水解缩聚成凝胶，经干燥、老化，制成多孔硅聚合物， 可根据需要在柱上进行进一步的衍生化发应，键合上不同的官能团。聚合反 应过程如下： 水解作用：( a ) s i ( o r ) 4 + h 2 0 - - - * s i ( o h ) ( o r ) 3 + r o h 缩聚反应：( b ) s i o h + s i o h _ s i o s i + h 2 0 ( c ) s i - o h + s i o r s i 0 一s i + r o h 该方法制成的色谱填料具有两种孔结构，分别为微米级的通孔 ( t h r o u g h p o r e ) 和纳米级的孑l ( m e s o p o r e ) 。通孔的存在使得硅胶整体柱具有优 异的渗透性。改变反应物组成的比例，可独立控制通孔和中孔的孔径。不同 的反应条件可使硅胶整体柱分别具有颗粒聚集型结构【2 4 。2 5 1 和网络结构【2 6 1 。由 于硅胶为紫外透明体，因此该类柱可以直接采用柱内检测。 最近硅胶类整体柱的制备又有新进展。t o y o o k a 等【2 7 。2 9 1 发展了温和反应条 件下的溶胶凝胶技术，制备了蛋白质包埋的硅胶整体柱。d u l a y 等【3 0 1 在3 6 5n m 紫外线照射下，在毛细管中一步原位合成了多孔硅胶连续床。此柱表现出反 相色谱的特性，可用于低相对分子质量中性化合物的分离分析。e 1 r a s s i 等开 展了大量的相关工作，制备了含有羟基和氰基等键合基团的硅胶整体柱，成 功地分离了中性及带电化合物【3 、核酸等天然极性成分【3 2 】以及蛋白质【3 3 1 。以 硅胶为基质的无机整体柱，虽具有理想的机械强度，比表面积大，孔结构易 控制等优势，但也存在抗溶剂性能差，适用的p h 范围较小等缺点。 1 3 1 2 以填充柱为基础的整体柱 以填充柱为基础的连续床层柱的制备方法：一是先将固体填料填充到毛 细管中，再将聚合反应物注入毛细管柱中，通过溶胶凝胶技术【3 4 。引、聚合【3 9 】 6 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 或高温烧结【4 0 l 形成连续床色谱柱；二是将固体填充料先与制备连续床的反应 物混合均匀，形成悬浮液装入毛细管中，再经热处理形成连续床【4 l 】。 该方法制备得到的整体柱与普通填充柱相比，具有聚合物型整体柱无塞 的优点，且机械强度、稳定性都得到改善，但仍需繁琐的填料装填过程，并 且高温烧结破坏了已键合的c 1 8 固定相，需重新键合固定相，与溶胶凝胶法 相比，这种色谱柱制备相对复杂，因此报道不多。 1 3 1 3 聚合物整体柱 聚合物整体柱由于选材范围广，适用的p h 范围宽，在近几年得到了迅速 地发展。聚合物整体柱的制备通常将单体混合物及致孔剂注入到空柱管中， 经过热引发、紫外光引发或丫射线引发在柱体内聚合，然后再用合适的溶剂 并由手动泵、机械泵或电渗流驱动除去柱内的致孔剂和残余单体。毛细管聚 合物整体柱制备过程见图1 2 。 裸露的毛细管 1r 烷基化的毛细管 上 l 单体，交联剂，致孔剂及引发剂等充满毛细管 l u v 或热引发 1 r 完成聚合反应 上 泵或电渗流冲洗 1 r 整体式毛细管柱 图1 2 制备整体式毛细管的示意图 7 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 聚合物整体柱根据材料和功能分类，主要包括聚丙烯酰胺整体柱、聚苯 乙烯类整体柱、聚甲基丙烯酸酯类整体柱和分子印迹整体柱等。 1 3 1 3 1 聚丙烯酰胺类整体柱 该类整体柱采用的功能单体有丙烯酰胺、n 异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯 酰胺、甲基丙烯酸丁酯、n 烯丙基二甲胺，交联剂则为二丙烯酰哌嗪、亚甲 基二丙烯酰胺( b i s ) 【4 2 5 3 1 。 1 9 9 5 年f u j i m o t o 等【1 7 , 4 3 , 4 7 】开始聚丙烯酰胺整体毛细管电色谱柱的研究。 他们使用丙烯酰胺、亚甲基丙烯酰胺和2 丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸混合物在 毛细管柱内进行聚合。虽然和管壁没有键合，但具有很好的稳定性。这种色 谱柱的柱效达1 5 0 0 0 0 理论塔板数每米，但是保留时间太长，要比一般毛细管 电色谱柱高1 0 倍。这种色谱柱的分离机理被认为是筛分作用【1 7 l 。此后f u j i m o t o 用疏水性强的n 异丙基丙烯酰胺代替亲水性的丙烯酰胺，并且把毛细管壁用 双官能团试剂3 ( 三甲氧基硅烷基) 甲基丙烯酸酯处理，其官能团与管壁以共 价键相结合。该化合物的可聚合基团与交联剂聚合，从而使凝胶结合到管壁 上，用水性缓冲溶液乙腈做流动相可以分离疏水性混合物，这种色谱柱柱效 高、保留时间也短，具有反相色谱的特点，对类固醇的分离柱效达1 6 0 0 0 0 理 论塔板数每米。 1 9 9 6 年h j e r t 6 n 研究组 4 4 1 进行了水溶性丙烯酰胺制备高交联度的整体色 谱柱的研究，其聚合体系包括：丙烯酰胺水溶液、哌嗪二丙烯酰胺、乙烯基 磺酸。为了使生成的整体色谱柱具有疏水性，往聚合混合物中加入甲基丙烯 酸十八烷基酯或甲基丙烯酸正丁酯。由于后者是疏水性物质，和前者的水溶 性混合物成两相，所以要加入表面活性剂进行超声处理，形成乳浊液，在加 入引发剂之后注入毛细管柱中进行聚合反应。得到的整体色谱柱在仔细调节 流动相成分后可以把5 个多环芳烃很好地分离开。利用这一整体色谱柱进行 分阶段的梯度洗脱，可以大大改善分离情况。例如把要分离的样品溶于5 0 ：5 0 的乙腈和水的混合物中，进样到c e c 系统中进行分离，稍待片刻，把洗脱流 动相换成7 0 ：3 0 的乙腈和水的混合物再进行分离。作者解释这一现象时认为， 这是由于溶质扩散跨越过强溶剂弱溶剂的界面时使“峰聚焦 ，从而使峰变窄。 近期的研究证明了h j e r t 6 n 的解释。 8 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 k o i d e 和u e n o 5 4 - 5 7 】在制备以聚酰胺为基质的手性整体柱的方面做了大量 的工作。他们以聚d 环糊精或羟甲基取代的p 环糊精聚合物作为手性选择剂， 将其与功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的混合物引入毛细管进行5h 的反 应。携负电荷的凝胶手性柱能分离中性及阳离子型手性物质，携正电荷的凝 胶手性柱能分离阴离子型手性物质。对丹酰氨基酸的手性分离的柱效更是达 到了2 4 0 0 0 0 理论塔板数每米。在其后的工作中，为了解决p 环糊精单体无手 性分离能力的问题，他们又以甲基丙烯酰胺取代的d 环糊精与聚酰胺凝胶共价 键合的方法制备了整体手性柱，对中性及阳离子型手性物质进行了手性分离。 近来他们又制备了嫁接了冠醚的聚酰胺整体柱，1 2 种基本氨基酸在该柱上得 到了手性分离，其柱效超过了1 3 5 0 0 0 理论塔板数每米。 近来，v e g v a r i 等人【5 8 】以2 羟基丙烯氧丙基取代的d 环糊精作为手性选择 剂，用聚酰胺为基质制备了整体手性柱，对环己烯巴比妥酸对映体的分离柱 效达到了5 7 0 0 0 0 理论塔板数每米。 1 3 1 3 2 聚苯乙烯类整体柱 该类整体柱可供使用的单体种类较少，目前所使用的单体仅为苯乙烯、 氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯【5 9 击2 1 。采用氯甲基苯乙烯作为反应单体聚合后， 氯甲基与十八烷基二甲基胺反应，进而实现在固定相中引入季胺基团，可在 离子交换模式下使用。 h o r w i t h 等【6 3 】尝试在该类柱上分离多肽，其分离机理是基于电渗流、色谱 保留、肽在电场中的迁移这三者的共同作用。x i o n g 等m 】以苯乙烯、二乙烯基 苯、甲基丙烯酸为单体和交联剂，以甲苯为致孔剂一步合成制备了苯乙烯二 乙烯基苯整体柱。j i n 等【6 5 】在此基础上选用甲苯异辛烷为致孔剂，发展了快 速合成这类柱的新方法。 1 3 1 3 3 聚甲基丙烯酸酯类整体柱 该类柱可采用多种功能材料作单体以增加色谱固定相的选择性，常采用 的功能单体有甲基丙烯酸酯、a m p s 、甲基丙烯酸缩水甘油酯、n 烯丙基二甲 基胺，交联剂为乙叉二甲基丙烯酸酯6 6 m 】。该类柱在p h2 1 2 范围内均具有良 好的稳定性。 9 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 s v e c 等人是制备这一类整体色谱柱的代表人物，他们将9 0 年代初研究 h p l c 用的整体色谱柱的经验 7 3 - 7 4 1 用于c e c 。对制备出来的色谱柱可以很快 地评价其形态、组成以及对c e c 分离过程的影响。 p e t e r s 等【6 9 】用2 羟基乙基异丁烯酸( n l 缬氨酸3 ，5 二甲基苯胺) 氨基甲酸 酯为手性单体及甲基丙烯酸缩水甘油酯等物质制成“膜塑”刚性整体毛细管 刷型手性固定相实现了对n 一( 3 ，5 - 二硝基苯甲酰基) 亮氨酸二烯丙基酰胺对映 体的拆分，塔板数达6 1 0 0 0 理论塔板数每米，分离度为2 0 ，显示了其独特的 高效性和选择性。该法的特点是引入手性单体，无需事先对毛细管进行处理， 还可通过选择合适的聚合溶剂精确控制聚合成分的组成以调节渗透性。 近来该小组又制备了一种具备进行离子交换和正相模式的整体柱【7 5 】。该 法以2 - n ，n 一二甲基胺乙基甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酸2 羟基乙酯为聚合单 体，d m a 为交联剂，十二醇和环己醇为致孔剂，分别以热引发和光引发进行 聚合。得到的整体柱用硫酸二甲酯处理，使聚合物床层带正电荷，柱效高达 2 3 1 0 0 0 理论塔板数每米。 吴仁安等人r 7 6 j 合成了带有c 4 、c 8 和苯基的聚丙烯酸酯的非电荷型毛细管 整体柱并用表面活性剂对其进行了动态改性。这种方法不仅可以引入产生电 渗流的基团还可以通过改变表面活性剂的种类和用量来改变电渗流的方向和 大小。 c h i r i c a 等人【_ 7 7 j 提出了一种控制整体柱多孔性的新方法。他们的思路是利 用二氧化硅小球作为占位材料，形成多孔模板来定制整体柱的多孔性。他们 先采用双官能团试剂二甲氧硅丙基甲基丙烯酸对毛细管壁进行预处理。然后 以聚乙二醇为匀浆液，在毛细管中以匀浆法填充o d s 填料，用氮气流吹干得 到的填充柱中的液体。以甲基丙烯酸丁酯或苯乙烯为聚合单体，以e d m a 或 d v b 为交联剂，热引发聚合得到连续床层。用n a o h 溶液冲洗此床层，4 8h 后将o d s 小球溶解即得到整体柱。电镜照片显示该整体柱具有均匀的多孔性， 并在c e c 模式下分离了多环芳烃，并用p h p l c 系统分离多肽和蛋白质混合 物，均取得满意的结果。 1 3 1 3 4 分子印迹整体柱 分子印迹是合成对印迹分子具有预定分子识别能力的聚合物的一种方 1 0 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 法，近年来受到了越来越多的关注，其有望在外消旋体的拆分、基底选择性 催化、人工抗体合成等方面获得应用。其印迹聚合物的制备过程如图1 3 ：( 1 ) 使印迹分子和功能单体间产生互补相互作用( 非共价作用、共价作用、鳌合作 用) 形成复合物；( 2 ) 在交联剂的作用下，在模板单体复合物周围产生聚合反应， 形成高分子聚合物；( 3 ) 用溶剂将印迹分子洗下来，得到分子印迹聚合物。 印迹分子 功能单体兰盟瘗 。l 1 交联剂 堰 翌 图1 3 制备分子印迹整体柱示意图 1 9 9 7 年，s c h w c i t z 等【_ 7 8 】首先报导了分子印迹聚合物整体柱在电色谱中的 应用，并用r 心得安及s 美托洛尔为模板分子，在紫外线照射下聚合形成了 大孔结构的分子印迹聚合物，手性拆分了心得安吲哚心安、对羟苯心安及氨 酰心安四种化合物【7 9 - 8 0 1 。特别是1 9 9 7 年大孔印迹整体柱的出现【8 0 撒】，使得该 技术得以应用于毛细管电色谱。分子印迹整体柱的柱效一般不高，因而寻找 新型交联剂，提高分子印迹聚合物孔径的均匀性，以获得较高的柱效将是其 今后研究的主要方向。 1 3 2 整体柱的评价 1 3 2 1 整体柱的多孔性 整体柱不能像填充柱一样以颗粒大小来表征其物理性质，而是用孔隙率 来表征。贯穿整体柱的孔隙不仅可以允许流体通过，而且已有初步研究表明， 孔隙结构影响柱效等整体柱的色谱性能【7 5 ，8 3 1 。因此对整体柱孔隙结构的测定 非常重要。 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 整体色谱柱结构的表征主要有扫描电子显微镜( s e m ) 、压汞法和氮吸附法 ( b e t ) 等。s e m 可直观给出所观察整体柱床层截面的形貌及孔径情况，其缺点 为只能给出断面的局部结构信息，无法对整根柱子作出全面、综合的评价。 测量孔径及其分布的标准方法为压汞法和氮吸附法。但都是在毛细管干燥的 条件下测定的，而c e c 操作一般均是在毛细管溶剂化状态下进行的。尽管如 此，由于干燥状态下测定的毛细管的孔隙性质数据与色谱性能有相关性，所 以这些方法仍在使用。 对充满流动相的整体柱中填料的孔隙结构进行评价的方法共有三种：其 一为流动法( 采用p - h p l c 系统) ，其二为电导率测定法( c e c 操作条件下) ，最 后一种为重量分析法。流动法采用一种示踪物去探测固定相的颗粒内部以及 缝隙间的空间。具体过程为：流动相流速由肛h p l c 系统利用示踪物来测定， 同时测定体积流速，总孔径，按文献【8 4 】方法计算可得。当多孔固定相不导电 时，可采用测定电导率的方法对整体柱总孔径进行估算。该法的具体过程为： 分别将整体柱和空管充满合适的电解质溶液，测定各自的电导率，然后通过 计算得到电导率比率的值【6 引。最后一种方法为重量分析法，由干燥状态下和 充满丙酮时色谱柱的重量差计算孔径。 1 3 2 2 孔径的控制 美国加里福尼亚大学伯克利( b e r k e l e y ) 分校的f r 6 c h e t 研究组【7 5 , 8 3 】自9 0 年 代以来一直从事各种模式的整体柱的研究，他们对聚甲基丙烯酸酯类的毛细 管整体柱的孔结构和孔径大小进行了比较深入的研究，并在整体柱多孔性的 控制方法上取得了很大进展。他们开发的三元致孔剂只须调节致孔剂中正丙 醇与l ，4 丁二醇的相对含量，就可以在很宽的范围内( 2 5 0 1 3 0 0n m ) 控制该类整 体柱的多孔性能。 c h i r i c a 等人提出了一种控制孔径的新方法【_ 7 7 1 。他们的思路是利用二氧化 硅小球作为牺牲材料，形成多孔模板来定制多孔性。这一概念是由j o h n s o n 等人提出来的【8 5 1 。具体的操作可分为四步：( 1 ) 毛细管壁的硅烷化；( 2 ) 匀浆法 填充硅胶球；( 3 ) 向毛细管内灌注聚合物混合液，原位合成有机基质聚合物； ( 4 ) 聚合反应完成后，将整体柱与注射泵连接，加压至2 0 0p s i 以5 0c m h 的流 速驱动n a o h 溶液冲洗2 4 4 8h ，慢慢将二氧化硅小球溶解。电镜照片显示该 1 2 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 整体柱具有均匀的多孔性，并在c e c 模式下分离了多环芳烃，用l _ t - h p l c 系 统分离多肽和蛋白质混合物，均取得满意的结果。 1 3 2 3 聚合物整体柱表面化学的控制 1 3 2 3 1 带电荷基团的影响 电渗流的速率与z e t a 电势成正比，因而也与表面电荷有关。与硅胶基质 的c e c 填料不同的是，有机聚合物整体柱中提供电渗流的带电基团的多少和 电性是易于控制的。具体地说，表面电荷密度和组成可通过改变聚合混合物 中带电单体的比例来控制，这也是聚合物毛细管整体柱的一个主要的优势， 可根据需要，通过添加带电单体来控制整体柱基质表面的电荷数量和种类。 f u j i m o t o 在研究交联聚丙烯酰胺凝胶和交联聚n 异丙基丙烯酰胺中均观 察到：随a m p s 单体含量的增加，电渗流速度线性增加。与此相似的是，甲 基丙烯酸酯型整体柱中，增加磺酸基的含量能显著增加流速，减少分析时间。 目前，通常用作产生负电荷的带电单体有：a m p s 、乙烯基磺酸、甲基丙烯酸 ( m a a ) ，c e c 分离时产生向阴极的电渗流；可产生正电荷的带电单体有： a e t m s 、d a m a 等，c e c 分离时产生向阳极的电渗流。另外，也可以通过柱 上衍生来改变聚合物的表面化学，如疏水性、电性等。 1 3 2 3 2 保留与选择性 大部分报道的c e c 操作采用反相模式，因而固定相的疏水性决定了分离 的选择性，保留也可以通过调整流动相的比例，或是通过改变固定相表面的 疏水性来控制。改变流动相比例的方法很容易实现，但是与h p l c 中所使用 的丰富的溶剂种类相比，由于乙睛的高介电常数及低粘度，大多数c e c 中常 使用乙腈为基础的溶剂系统。到目前为止，预制固定相的表面化学的工作开 展的还很少。p a l m 和n o v o t n y 制备了一系列单体由不同链长烷基构成的整体 柱，但是在比较实验中无法证明何种链长的单体具有更高的柱效【5 l 】。 n g o l a 和s h e d i a c 等人通过改变聚合物中的丙烯酸酯的酯基碳链的长度来 调节整体柱的疏水性，同时添加a m p s 或a e t m s 使整体柱带有负电或正电， 致使c e c 分离时产生不同方向的电渗流【8 6 , 8 7 】。 1 3 含氟有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用研究 1 3 3 整体柱的应用 1 3 3 1 快速分析 整体柱的整体填充床相当于一粒灌注色谱填料，因而其具有极好的通透 性。塔板高度和柱压降对流速曲线表明塔板高度与柱压降随流速的增加而增 幅不明显，说明在较大的流速下整体柱依然具有较高的柱效和较低的柱压降。 普通填充柱则无法实现这一点，普通填充柱的柱效随流速的增加而明显地降 低，且其柱压降较高，只能在相对较低的流速下使用。l u b d a 韶】利用l o o x 4 6 m i l l 硅胶整体柱，流速为9m l m i n ，在0 6m i n 内基线分离了5 种d b l o c k i n g 药物。 1 3 3 2 流速梯度 由于柱压降的限制，在普通填充柱上进行流速梯度洗脱不具有实际意义， 并且柱效随流速的增加而损失较大，而整体柱由于具有优异的渗透性，在较 高的流速下仍能保持较高的柱效，适于流速梯度。溶剂的洗脱能力随着有机 组分含量的增加而发生变化，采用溶剂梯度洗脱可以使吸附能力差别较大的 组分在合理的