（土壤学专业论文）土壤中锰氧化细菌的筛选、特性及其对Mn（Ⅱ）的氧化.pdf

华中农业人学2 0 0 8 届硕：t 学位论文周倩 摘要 锰氧化物是土壤演化和物质循环过程中的产物，是土壤中最具反应活性的氧化 物。有关锰氧化物生物成因及特性的研究主要限于海相锰沉积物，而陆相表生的土 壤环境不同于海洋，其锰氧化物的生物形成过程及机制有别于海洋。本论文以武汉 棕红壤和黄棕壤中的铁锰结核和铁锰胶膜为研究对象，分离和纯化出锰氧化细菌， 探讨了锰氧化细菌的生理学特征及其对m n ( 1 1 ) 的氧化。取得的主要结果有： 1 、从不同来源的土壤样品中，筛选得到了生长较好的1 8 株锰耐受型细菌。摇 瓶复筛得到对锰吸附或氧化能力最强的菌株h n l l 和h n 2 3 ，经生理生化及分子鉴定 分别为玫瑰色微球菌( m i c r o c o c c u sr o s e u s ) 与胶质芽胞杆菌( b a c i l l u sm u c i l a g i n o s u s ) 其中菌株h n l l 来自土壤铁锰结核，菌株h n 2 3 来自土壤铁锰胶膜。 2 、不同的锰氧化菌株在供试l 2 、l b 、2 b y g 培养基中生长曲线表明最适合 锰氧化细菌生长的培养基为l b 培养基。 3 、l b 培养基中m n ( 1 ) 的加入，对锰氧化细菌的对数生长期、平缓期和衰亡期 有延迟作用。 4 、锰氧化细菌对m n ( i i ) 的最大吸附或氧化速率出现在细菌的对数生长期。 5 、在3 0 条件下，随着m n ( i d 不断被氧化，培养液的p h 值升高，且l b ( m n ) 培养基升高明显高于l b 培养基。 6 、四种菌株形成的矿物类型均为弱晶质的8 一m n 0 2 。s e m 下观察菌株h n l l 形 成产物以絮状团聚在一起；菌株h n 2 3 形成的产物为颗粒状物质，大小为o 5 5um ； 菌株w h 4 形成产物以絮状及颗粒状团聚在一起；菌株g y l 6 形成的产物为颗粒状物 质，大小为0 2 。3um 。 率 关键词：土壤；铁锰结核；胶膜；锰氧化物；锰氧化细菌；生长曲线；氧化速 土壤中锰氧化细菌的筛选、特性及其对m n ( i i ) 的氧化 a b s t r a c t m a n g a n e s e ( i v ) o x i d e s ，o n eo ft h em o s ta c t i v eo x i d e sa n ds e d i m e n ti nt h es o i l ，a r e t h ep r o d u c t sd u r i n gt h es o i le v o l u t i o na n ds u b s t a n c ec i r c u l a t i o n s t u d i e so nc a u s eo f f o r m a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i ca b o u tb i o g e n i cm no x i d e sa r em o s t l yf o c u c so ns e af a c i e s m a n g a n e s e ( i v ) s e d i m e n t ，b u tt h es o i le n v i r o n m e n ti nl a n df a c i e sa l ed i f f e r e n tf r o mt h a ti n t h es e a ，e s p e c i a l l yo nt h eb i o l o g yf o r m a t i o np r o c e s sa n dm e c h a n i s mo fm a n g a n e s e ( i v ) o x i d e s i nt h i st h e s i s ，i r o n m a n g a n e s en o d u l e sa n dc u t a n sw h i c he x i s ti nb r o w n - r e ds o i l a n dy e l l o w - b r o w ns o i lo fw u h a nc i t yw e r ec h o s e na st h es t u d yo b j e c t s ，t h e m n ( i d o x i d i z i n g b a c t e r i aw a ss e p a r a t e da n ds u b l i m a t e d ，b e s i d e st h e p h y s i o l o g y c h a r a c t e r i s t i co fm n ( ) - o x i d i z i n gb a c t e r i aa n dt h eo x y g e n a t i o no nm n ( 1 ) w e r ed i s c u s s e d t h em a i na c h i e v e m e n t so ft h i ss t u d ya r el i s t e db e l o w ： 1 ) f r o mt h ed i f f e r e n ts o u r c e so fs o i ls a m p l e s ，18s p e c i e sw e l lg r o w nb a c t e r i ao f m a n g a n e s et o l e r a n c et y p eh a v eb e e ni s o l a t e d t h e n ，r e p e a ts c r e e n i n gw a sc a r r i e do u t h nlla n dh n 2 3 w e r eo b t a i n e da st h e s t r o n g e s tm n ( i i ) 一o x i d i z i n gb a c t e r i a t h e p h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o nr e s u l ti n d i c a t e dt h a th n lla n dt h e m i c r o c o c c u sr o s e u sb e l o n g st ot h es a m es p e c i e s ，a n ds oa r et h es a m es i t u a t i o nt oh n 2 3 a n dt h eb a c i l l u sm u c i l a g i n o s u s i na d d i t i o n ，h nl1w a si s o l a t e df r o mi r o n m a n g a n e s e n o d u l e ，h n 2 3w a si s o l a t e df r o mc u t a n ； 2 ) t h ed e t e c t i o no fg r o w t hc u r v ew i t h i nd i f f e r e n tm n ( 1 0 o x i d i z i n gb a c t e r i a si n t h r e ed i f f e r e n tm e d i u m s ( l 2 、l b 、2 x b y g ) ，i n d i c a t e dt h a tt h em o s ts u i t a b l em e d i u mf o r m n ( i d o x i d i z i n gb a c t e r i at oo x i d a t i o n i sl b ； 3 ) t h e l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s e ，s t a t i o n a r yp h a s ea n dd e t e r i o r a t i o ns t a g eo fg r o w t h c u r v eo fm n ( i i ) 一o x i d i z i n gb a c t e r i aw e r ed e l a y e do w i n gt ot h ea d d i t i o no fm n ( i i ) t ol b ； 4 ) t h e s p e e do fo fm n ( 1 ) 一o x i d i z i n gb a c t e r i aa d s o r po ro x i d i z et om n ( i dw i l lb e a c h i e v e dt ot h em a x i m u mw h e nt h eb a c t e r i ai ss t a y i n gi nt h el o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s e ； 5 ) a tt h ec o n d i t i o no f3 0 ，a st h em n ( n 3i sb e i n go x y g e n a t e dc o n s t a n t l y , t h ep h o ft h e l i q u i d m e d i u mi s i n c r e a s i n g a tt h es a m et i m e ，a n dt h ec u l t i v a t eo n l b ( 1 0 m m ) m e d i u mi sm o r eo b v i o u st h a nc u l t i v a t eo nl bm e d i u m ； 华中农业大学2 0 0 8 屈硕士学位论文岗倩 6 ) o n l yo 3 6a mp e a k ，w h i c hi sac h a r a c t e r i s t i cd i f f r a c tp e a ko f6 - m n 0 2 ， a p p e a r e d i nt h ex r dp a t t e r n so fp r o d u c t so fm n “o x i d a t i o nb yf o u rb a c t e r i a s ， i n d i c a t i n gt h a tn oo t h e ri m p u r em i n e r a lb u tp o o rc r y s t a lm n 0 2w e r eo b t a i n e d ； 7 )s e mi m a g e so ft h eo x i d a t i o np r o d u c t sa r es h o w ni nt h ef i g u r e s t h ep r o d u c t s o fh nl1h a v eat h i na n dr a n d o ms t a c k e dp l a t ym o r p h o l o g y t h ep r o d u c uo fh n 2 3h a v ea p a r t i c l em o r p h o l o g yw i t has i z eo f0 5 5um t h ew h 4c o n t a i n sb o t hr a n d o ms t a c k e da n d p a r t i c l es h a p e dc r y s t a l l i t e s t h ep r o d u c t so fg y l 6a l ep a r t i c l e sw i t has i z eo f0 2 3l am k e yw o r d s ：s o i l ；i r o n - - m a n g a n e s en o d u l e ；c u t a n ；m n ( 1 ) - o x i d i z i n gb a c t e r i a ；g r o w t h c u r v e ；o x i d a t i o nr a t e 1 1 1 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同- r _ 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：随瀹 时间：刻谜年6 月p 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 糊黼始f 司谲 锄鲐号钐却 签名日期：弦0 3 年6 月f 2 日签名日期：a 舯3 年月，了日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录2 n 华中农业人学2 0 0 8 届硕上学位论文周倩 1 1 国内外研究进展 1 1 1 锰氧化细菌及模式菌株 1 前言 有关锰氧化细菌的筛选开始于海洋铁锰结核。e h r l i c h ( 1 9 6 3 ) 首次从海洋锰结 核中发现了锰还原菌和锰氧化菌，这些细菌的活动有助于结核的形成。锰结核是一 种生物岩，光滑状和瘤状锰结核分别是由纳米级的中华微放线菌( m i n i a c t i n o m y c e s c h i n e s i s ) 和太平洋螺球孢菌( s p i r i s o s p h a e r os po r ap a c i f i c a ) 历经千百万年的世代繁 衍和不断堆积加厚形成的( 陈建林等，1 9 9 7 ) 。在好氧的条件下，锰细菌将可溶性的 m n ( i i ) 氧化为m n ( i v ) ，其氧化速度与环境温度存在密切的关系，锰细菌对铁的氧化 速度较对锰的氧化速度快；在厌氧的培养条件下，锰细菌能将高价铁还原为低价铁， 而且使培养液的p h 值明显降低( 史君贤等，1 9 9 9 ) 。b a n d o p a d h a y ( 1 9 8 9 ) 在印度 元古代锰矿床中发现了具叠层石结构的显微化石，并且鉴定出它们可能是同蓝细菌 具亲缘关系的介壳虫和丝状体。通过对化石的结构的分析表明，这些化石为浮游生 物，而且在原始m n 0 2 沉积中也发现了大量微生物群，表明m n 0 2 沉积是生物成因 的。生物藻类能通过改变水介质条件促进锰淀积( 夏文杰等，1 9 9 4 ) 。 土壤中锰氧化细菌的筛选工作开展较晚。1 9 7 7 年，s u l l i v a n 和k o p p i 观察到澳 大利亚黑土( t y p i cp e l l u s t e r t ) 的锰矿物胶膜上有微生物细胞和菌丝体状物质。同年， d o u k a 从希腊一个淋溶土中鉴定和分离出了假单胞菌( p s e u d o m o n a ss pn o v ) 和弗氏 柠檬酸杆菌( c i t r o b a c t e rf r e u n d i i ) 2 种锰氧化细菌，这些细菌的细胞和细胞提取液 可使m n ( i i ) 形成沉淀，且锰氧化沉淀的多少与分别加入的细胞和细胞提取液的浓度 呈正相关。土壤中的节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) 在有氧情况下能氧化m n “，在无氧条 件下还原已形成的氧化物( b r o m f i e l da n dd a v i d ，1 9 7 6 ) 。郝瑞霞( 1 9 9 5 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 通过总结生物与锰的关系，重点评述了细菌对锰的氧化和聚集作用，并探讨了锰的 微生物氧化机制，同时分析和总结了锰结核和锰的生物沉积特征，最后得出细菌在 锰的地球化学循环中起着重要作用。贺纪正等( 2 0 0 7 ) 应用现代分子生物技术从土 壤铁锰结核中直接提取微生物d n a ，通过聚合酶链反应( p c r ) 、克隆、扩增r d n a 十壤中锰氰化细菌的筛选、特性及其对m n ( 1 1 ) 的氧化 限制分析( a r d r a ) 和d n a 序列分析，首次获得了我国红壤和黄棕壤中铁锰结核 中微生物群落组成的信息。 通过对锰氧化细菌的筛选及生物学方面特性的分析，目前研究最多的锰氧化菌 主要包括三种模式菌：生盘纤发菌s s 1 和s p 6 ( l e p t o t h r i xd i s c o p h o r as s 1 和s p 6 ) ； 恶臭假单胞菌m n b l 和g b 1 ( p s e u d o m o n a s p u t i d am n b l 和g b 1 ) ：芽孢杆菌s g 1 ( b a c i l l u ss ps g - 1 ) ( l e ee ta l ，1 9 9 4 ：m u r r a ye ta l ，2 0 0 7 a b ；n e l s o ne ta l ，1 9 9 9 ) 。 通过1 6 s r r n a 基因序列分析表明，这三种模式锰氧化菌在分类上有较大差异： l e p t o t h r i xd i s c o p h o r as s 一1 、p s e u d o m o n a sp u t i d am n b1 和g b - 1 、b a c i l l u ss ps g - 1 分 别属于p 一变形菌、丫变形菌和低g c 革兰氏阳性菌。其中l e p t o t h r i xd i s c o p h o r as s 1 ， 只在淡水中存在，产生的锰氧化物沉积在细胞壳外( l a r s e ne t a l ，1 9 9 9 ；b r o u w e r se t 口z ，2 0 0 0 ) ；p s e u d o m o n a s p u t i d am n b l 和g b 1 ，在淡水和土壤中均普遍存在，在细 胞表面形成锰氧化物；b a c i l l u ss ps g 一1 ，这是一株从海洋中发现的锰氧化菌，主要 通过产生的芽孢来氧化m n ( i i ) 。这三种菌都是在细胞外部分泌某种酶来氧化 m n ( i i ) ，这三种酶都与多铜氧化酶( m u l t i c o p p e ro x i d a s e s ，m c o s ) 类似，分别为 m o f a 、c u m a 和m n x g ( b r o u w e r se ta l ，2 0 0 0 ；f r a n c i s ，2 0 0 1 ；c a s p i ，1 9 9 6 ，1 9 9 8 ； m a n d e m a c k ，1 9 9 5 ；b r a d l e y e ta l ，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 微生物氧化m n ( i i ) 的机理 有关微生物对m n ( i i ) 的氧化机理还没有定论。t e b oe ta l ( 2 0 0 4 ) 认为微生物先 将m n ( i i ) 催化氧化成m n ( 1 1 1 ) ，m n ( i i i ) 与m n ( i i ) 氧化酶形成溶解态中间产物，通过 进一步的氧化，酶一m n ( ) 复合物最终形成m n ( i v ) 产物。形成的氧化物又成为新的 金属氧化剂，可促进低价态锰歧化生成m n ( ) ，此反应消耗0 2 ，产生矿。 有关微生物氧化锰矿物已开展了较多的研究，研究者通过对结核的构造、矿物 组成、化学成分及生成环境的研究，结合人工模拟实验，先后提出了锰矿物的化学 成因、生物成因、及生物化学二元成矿机制。海洋中生物成矿作用可以概括为以下 几个方面：1 ) 生物体对元素的聚集和成矿作用；2 ) 生物作用引起的介质e h 值变化； 3 ) 生物作用改变介质p h 值；4 ) 有机质胶体对金属的物理吸附作用；5 ) 有机络合 物的搬运形式( b r a d l e ye ta l ，1 9 9 7 ) 。 三种不同的锰氧化模式菌株( 生盘纤发菌s s 1 和s p 6 ；芽孢杆菌s g 1 ；恶臭 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕l 学位论文周倩 假单胞菌m n b l 和g b 1 ) 均是在胞外聚合物基质中以酶催化m n ( i i ) 进行氧化反应， 都含有与锰氧化有关的基因，且该基因与多铜氧化酶基因的序列相似性高。多铜氧 化酶被推断为“锰氧化因子”，是一个种类多样的酶家族，能够利用铜离子作为辅酶 氧化各种有机和无机底物，通过单电子传递步骤氧化基质并将其还原成水分子 ( v a n w a a s b e r g e ne ta l ，1 9 9 6 ；s o l o m o n ，1 9 9 6 ) 。以多铜氧化酶为氧化基础的其他生 物氧化m n ( i i ) 的过程可能具有相似的机制，特别是有键合m n ( i i ) 的可溶性酶中间体 的产生。在l e p t o t h r i x d i s c o p h o r a 菌中锰氧化酶可能与一种m c o s 基因有潜在的联系 ( c o r s t j e n se ta l ，1 9 9 7 ) ，而真菌a c r e m o n i u ms pk r 21 2 中的真菌m c o s 也可以将 m n ( i i ) 氧化为m n ( i v ) ( m i y a t a e ta l ，2 0 0 4 ，2 0 0 6 a b ，2 0 0 7 ) 。这与t e b o 关于细菌和 真菌在酶氧化m n ( i i ) 上可能存在相似性的推测一致。d i c k 等( 2 0 0 7 ) 用串联质谱检 测方法分析海洋中芽孢杆菌孢子中的m n ( i i ) 氧化酶，根据从两种芽孢杆菌锰氧化条 带中得到的9 个缩氨酸可以确定其为m c o m n x g ，且在锰氧化条带上没有发现其他 的蛋白质，这表明m n x g ( 或m n x f g 复合体) 可以直接催化形成生物锰氧化物。 这些结果证明了细菌产生的酶对m n ( i i ) 氧化的催化作用( t e b oe t a l ，2 0 0 4 ) 。 1 1 3 生物形成的锰矿物特性 微生物作用形成的锰矿物，往往与细胞分泌物( 蛋白质，核酸等) 结合在一起， 而这对矿物形态有很大影响，从而使矿物呈现出一种弱晶质或非晶质的图像。 v i l l a l o b o s 等( 2 0 0 3 a ，2 0 0 6 ) 通过散射和光谱分析，表明生物锰氧化物有着相 当高的均氧化态( 例如四价的结构锰氧化物) 的层状氧化物具有很大的表面积和很 差的结晶度，类似6 m n 0 2 或者酸性水钠锰矿，再以此为前驱物转化形成其他矿物。 在中性p h 条件下进行化学合成的锰氧化物的锰氧化态很低，为3 1 ( h e me ta l ， 1 9 8 1 ) ，而在大部分自然状态下水中由微生物活动所形成的锰氧化物的锰氧化态往往 高于3 4 ( e m e r s o ne ta l ，1 9 8 2 ；t e b oe ta l ，1 9 9 1 ) 。 生盘纤发菌( l e p t o t h r i xd i s c o p h o r a ) s p 一6 菌株氧化低价态锰产生的m n 0 2 矿物， 其结构类似于m n 0 2 矿物的3 3 隧道钡镁锰矿，这种矿物可以更进一步的用来进行 生物合成非晶质的多孔锰氧化物( k i me ta l ，2 0 0 3 ) 。m a n n 等( 1 9 8 8 ) 通过提纯s g 1 芽孢外壁，发现氧化产物属于黑锰矿；h a s t i n g s 和e m e r s o n ( 1 9 8 6 ) 观察其在海水 ( p h 7 5 ) 、中等m n ( i i ) 浓度( 2 p m ) 条件下生成m n ( i v ) 矿物的过程，发现初始沉淀 3 土壤中锰氧化细菌的筛选、特性及其对m n ( 1 i ) 的氧化 物为黑锰矿( m n 3 0 4 ) ；由淡水细菌( 生盘纤发菌l e p t o t h r i xd i s c o p h o r as p 一6 ) 产生的 锰氧化物( s p 6 m n o x ) ，非常类似于3 3 隧道钡镁锰矿( k i m e t a l ，2 0 0 3 ) 。 与化学合成氧化锰矿物相比，生物成因的锰氧化物( 称为生物氧化锰) 结晶弱， 粒径小，m n 价态高，结构中八面体空穴多。过去几年的研究表明，微生物氧化 m n ( ) 的产物主要是层状的( 似) 水钠锰矿结构的m n 3 撕o 。( v i l l a l o b o se ta l ，2 0 0 3 a b ， 2 0 0 5 ；j u e r g e n s e ne ta l ，2 1 3 0 4 ；b a r g a re ta l ，2 0 0 0 ，2 0 0 5 a b ；w 色b b 甜a l ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ； s a r a t o v s k y e ta l ，2 0 0 6 ) 。e x a f s 分析表明l e p t o t h r i x d i s c o p h o r as p 6 氧化m n 2 + 后形 成层状的m n o x ，其m i ，0 6 八面体链中有1 2 4 的点位为八面体空穴，而m n 3 + 以水合离子形式占据这些点位的上方或下方( s a r a t o v s k ye ta l ，2 0 0 6 ) 。f r i e d l 等( 1 9 9 7 ) 通过e - x a f s 对瑞士富营养化的s e m p a c h 湖底沉积物中固态氧化锰的形态和结构进 行了研究，结果表明氧化锰主要是类似c 轴无序的h 水钠锰矿，大量八面体空穴 存在于【m n 0 6 】八面体链中，并被吸附态的金属离子所占据。p s e u d o r n o n a sp u t i d a m n b l 氧化m n ( 1 i ) 形成的弱结晶的六方水钠锰矿结构中含有约1 7 八面体空穴，x r d 结合e x a f s 分析表明此类矿物八面体层中不含m n 3 + 0 6 八面体，八面体空穴产生 的负电荷由层间的质子、碱金属离子及m n “或m n 3 + 平衡( v d l a l o b o se ta l ，2 0 0 3 b ， 2 0 0 6 a ) 。 1 1 4 微生物形成锰矿过程中的生理学功能 微生物氧化m n ( i i ) 的生理学功能还不清楚，可能包括对反应产生能量的利用和 抵抗侵害两方面。微生物将m n ( i i ) 氧化为m n ( 1 t i 、i v ) 是能量释放的过程，尽管有现 象显示微生物可以控制并可能利用该反应的能量，但对此还缺乏明确的证据。m n ( i i ) 氧化机制可能是微生物把可溶的、有毒的m n ( i i ) 转变成胞外粒子m n o 。，或m n ( i i ) 的氧化可能可保护细胞不受有毒氧化物的伤害( g h i o r s e ，1 9 8 4 ) 。m n ( i i ) 的氧化细 菌的金属覆盖表面可以使细菌抵抗紫外辐射，捕食行为，抗毒菌攻击的能力增强 ( e m e r s o n ，1 9 9 2 ) 。由于m n ( i i i ) 的存在，使得m n ( i i i ) m n ( i i ) 、m n ( i v ) m n ( i i ) 的 结合具有很高的氧化还原电位，使m n ( i i i ) 和m n ( i v ) 在环境中形成一些很强的氧化 物。例如，m n 氧化物可与其他一些还原态金属反应，如s e ，a s ，c r ，从而通过氧 化还原作用或溶解作用影响有毒金属的毒性( n i c o ，2 0 0 0 ；m u r r a y ，2 0 0 7 ；t e b oe ta l ， 2 0 0 4 ) 。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文周倩 t e b o 等( 1 9 9 7 ，2 0 0 4 ，2 0 0 5 ) 微生物氧化m n ( i i ) 的其它可能生理学功能：a ) 保护微生物体免受活性氧、紫外线、被捕食或者病毒的侵害；b ) 储存电子受体以备 在厌氧呼吸时使用；c ) 将复杂的有机物分解为可利用的底物，如锰氧化物可以将 有机酸降解为低分子量的化合物；d ) 清除痕量重金属元素。但这些假设也缺乏直接 的证据。另外，锰氧化酶的特异性也需要进一步的研究，这对微生物氧化m n ( i i ) 功 能的重要性的阐明具有重要意义( n e l s o n ，1 9 9 9 ，2 0 0 2 ；t a n i ，2 0 0 4 ：t o n e r ，2 0 0 6 ) 。 1 2 研究内容及意义 锰在地壳中含量丰富( 居第1 0 位) ，是地球上第二丰富的过渡金属，仅次于铁， 且其地球化学性质在很多方面与铁类似。在土壤环境中，锰元素在自然界中通常以 m n 2 + 、m n 3 + 和m n “氧化物及氢氧化物存在。锰氧化物既是土壤锰素的重要来源，也 是与环境质量密切相关的土壤活性组分( 谭文峰等，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 a b ) 。作为土 壤中重要的吸附载体、化学反应的催化剂和氧化还原反应的主体，锰氧化物控制着 微量营养元素、重金属等在土壤中的浓度、形态和转化，决定着这些元素的生物有 效性和环境毒性( 陈英旭等，1 9 9 3 ：鲁安怀等，2 0 0 0 ；p o s t ，1 9 9 9 ) 。 锰氧化物具有很强的吸附性能，控制着土壤和水体中有毒物质和主要元素的分 配和生物可利用性( t e b o 等，2 0 0 4 ) 。锰氧化物可通过多种化学机制包括释放氧化 基，对苯锟的基质亲核加成，无有机中间体的氧化物和c 0 2 的释放，锰氧化物表面 的脱烷作用等促进腐殖质，p c b s ，苯酚和氯化苯酚，氯苯胺和莠去津等污染物的 降解( s t o n e & m o r g a n1 9 8 4 a ，b ；s t o n e l 9 8 7 ：u l r i c h s t o n e1 9 8 9 ) 。锰绿砂( 海绿 石与不同锰价态氧化锰的结合体) 被广泛的应用为饮用水的过滤介质，可专门去除 m n ( 1 ) 、f e ( ) 、氢硫化物和砷( t o u m a s s a te ta l ，2 0 0 2 ) 。对生长在受c d 、p b 或 c d p b 共同污染的土壤中的稞麦草生长状况进行研究表明，增加具有锰氧化物的土 壤比增加石灰、碱性磷酸盐矿渣、氧化铁或改良的铝硅酸盐更能防止植物对金属的 大量吸收( m e n c he ta l ，1 9 9 4 ) 。同样，锰氧化物与磷酸盐、复合肥料、铁氧化物 相比，在减少小麦对p b 、c d 的吸收上效果更加明显( c h e ne t a l ，2 0 0 0 ) 。 自然形成的水钠锰矿结晶弱，且常与其它多种氧化锰、氧化铁及粘土矿物等赋 存于环境中，分离鉴定困难，因此人工合成水钠锰矿是人们研究其成因、结构和性 质的主要途径。化学方法合成水钠锰矿操作简单，易得到大量结晶度较高的纯水钠 5 十壤中锰氧化细菌的筛选、特性及其对m n ( 1 1 ) 的氧化 锰矿。c o l e 等早在1 9 7 4 年，通过向煮沸的k m n 0 4 溶液中滴加浓盐酸的方法就合成 水钠锰矿。后来又有许多学者研究发现，许多锰氧化矿物的形成与水钠锰矿关系密 切，不少锰氧化矿物由水钠锰矿直接或间接转变而成( g o l d e ne t a l ，1 9 8 7 ；t ue t a l ， 1 9 9 4 ) 。但其在土壤实际环境中的转化还存在生物过程的参与。 部分微生物，主要是细菌也有少量真菌，能催化m n ( i i ) 的氧化形成m n ( i u ，i v ) 氧化物。微生物对m n ( i i ) 氧化速率可比在无生物参与的条件下的m n ( i i ) 氧化高五个 数量级以上，所以在自然界中发现的m n ( i i ) 氧化多数都是微生物成因的( n e a l s o n ， 1 9 8 8 1h a s t i n g sd ，e m e r s o ns ，1 9 8 6 ；t e b oe ta l ，2 0 0 4 ) 。d i e t e r 等的研究表明，仅 有0 2 存在而没有锰氧化菌或者某些特殊矿物存在时，m n ( i i ) 在数年内都很难被氧 化。大量特殊位点的调查显示，m n ( i i ) 氧化作用的生物过程发生在这些位点。因此， 环境中主要的自然锰氧化物来自直接的生物m n ( i i ) 氧化作用和随后的生物成氧化 物的变异( t e b oe ta l ，2 0 0 4 ) 。细菌在海洋铁锰结核形成中起主导作用，但它在土壤 铁锰结核和形成中的作用研究甚少，尚无定论。 在锰的成矿作用方面，化学成矿方面研究较多，而生物成矿方面涉及较少；表 生环境中锰矿物是在常温、常压条件下形成，实验室中有关锰矿物的研究多是通过 热液条件下的高温、高压的合成，显然不符合表生环境的实际情况，且微生物对 m n ( i i ) 氧化速率可比在无生物参与的条件下高五个数量级以上( n e a l s o ne ta l ，1 9 8 8 ， 1 9 9 9 ) ，所以微生物在锰矿物的形成过程中起了主导作用；已有相关实验证明细菌 在海洋铁锰结核形成中起主导作用，但它在土壤铁锰结核和形成中的作用研究甚少， 尚无定论，铁锰结核中有关锰氧化微生物的研究，多集中在矿物形成机理和成矿基 因研究方面。 土壤锰氧化物的形成应是多种条件综合作用的结果。有关锰氧化物的化学与生 物成因主要以海相锰矿物为对象，分离纯化用于形成锰氧化物研究的微生物菌株也 多来自于海洋。土壤是复杂的多组分动态体系，不同土壤的微生物区系与锰氧化物 的成因不同，且有别于海洋；所以应用土壤学、矿物学和微生物学等手段，深入开 展土壤中锰氧化物的生物对m n ( i i ) 物质形态与转化的研究，为揭示土壤等陆地表生 系统中锰氧化物的特点和行为，阐明其在元素地球化学循环中的作用提供理论依据。 本论文以土壤铁锰结核和铁锰胶膜为材料，分离纯化与锰氧化有关的细菌；对 不同培养基、不同培养方式条件下锰氧化细菌的生长特点进行分析，初步确定锰氧 化细菌的生长特征，以得到最适合锰氧化细菌生长的培养基和培养条件；利用分光 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文周倩 光度计测定不同阶段锰细菌的生长状况，来确定其相应生长曲线，以利用生长曲线 的规律来对细菌的锰氧化进行研究；用原子吸收的方法对锰氧化细菌的锰氧化速率 进行测定，研究细菌不同的生长阶段锰氧化速率的高低，氧化速率最高时期产生的 阶段，并分析其产生的原因；锰氧化细菌的氧化产物通过纯化后，对其进行表征分 析，x 射线衍射x r d 用来观察其产物类型及结晶程度，扫描电镜s e m 用来观察产 物的形态。这些研究对今后实际应用中更合理地利用其生长规律，进行微生物形成 锰矿物的中试实验有重要意义。 7 土壤中锰氧化细菌的筛选、特性及j 对m n ( 1 1 ) 的氧化 2 锰氧化细菌的分离筛选及鉴定 土壤中参与m n ( i i ) 氧化的微生物在环境中广泛存在，包括细菌和真菌。已知典 型锰氧化细菌分布在变形菌门、放线菌门或厚壁菌门，它们均通过胞外聚合物中的 多铜氧化酶来催化氧化m n ( 1 ) 。因此，作为土壤环境中锰氧化的主导因素的生物一 锰氧化细菌的筛选，是研究锰的生物成矿的基础和前提。 2 1 材料与方法 2 1 ：1 样品的采集 土壤样品的采集：时间，2 0 0 5 年1 2 月5 日；天气，晴；温度：1 5 c 。采集了 土壤铁锰结核和铁锰胶模两个土样，采集状况见下表： 采集的土样放置在4 冰箱中。 锰氧化相关菌株来源：从中国科学院生态环境研究中心获得两株菌株分别为菌 株g y l 6 和菌株w h 4 2 1 2 土壤样品的制备 土壤铁锰结核样品的制备：用去离子水擦洗铁锰结核的表面并风干，用洗净的 玛瑙研钵在超净工作台内磨细，现用现制。 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕，i 二学位论文周倩 土壤胶膜样品的制备：土壤经自然风干后，在超净工作台上用无菌不锈钢刀片 将土块上的胶膜轻轻刮下，控制厚度小于1m m ，用洗净的玛瑙研钵在超净工作台 内磨细，现用现制( 黄丽，2 0 0 0 ) 。 2 1 3 培养基 以下培养基和营养液除特殊说明外，配制时均用蒸馏水定容至1 0 0 0m l ，并在 1 2 1 下高温灭菌2 0m i n ，固体培养基在此基础上另补加1 8 ( w v ) 的琼脂粉。 1 、富集培养基： 根据锰氧化细菌的高锰生长环境，选择的是l b ( m n ) 培养基，成分为：酵母 膏：2 9 ：蛋白胨：4 9 ；n a c i ：2 9 gm n c l 2 ：2 9 ( 约1 0i i 蝴) ；蒸馏水1 0 0 0m lgp h 为7 2 。 2 、选择性培养基： 1 ) 异养细菌培养基蛋白胨5g ；酵母膏1g ；柠檬酸铁o 1g ；琼脂2 0g ；土 壤浸液1 0 0 0i i 儿；p h 为7 2 。 2 ) 锰细菌培养基m n s 0 4 4 h 2 0 ：0 2g gf e s 0 4 7 h 2 0 ：0 0 0 1g ；蛋白胨：2g ； 酵母膏：0 5g ；琼脂2 0g ；土壤浸液：1 0 0 0m e gp h 为7 0 - 7 2 。 3 ) 铁细菌培养基柠檬酸铁铵：1 0g gm g s 0 4 7 h 2 0 ：o 5g ；( n h 4 ) 2 8 0 4 ：0 5 g gk 2 h p 0 4 ：0 5g ；c a c l 2 ：0 2g ；n a n 0 3 ：0 5gg 土壤浸液：1 0 0 0m l ：p h 为7 0 。 4 ) 硫酸盐还原菌乳酸钠：5 9 ；天门冬素：2 9 ；f e s 0 4 7 h 2 0 ：0 0 1 9 ； m g s 0 4 7 h 2 0 ：1g ；k 2 h p 0 4 ：l g ；土壤浸液：1 0 0 0m l 。 5 ) 高铁还原细菌蔗糖：3g gk z h p 0 4 ：0 5gg m g s 0 4 7 h 2 0 ：0 2g ：( n h 4 ) 2 8 0 4 ：lg ；c a c 0 3 ：5gg 酵母膏：o 5g ；f e ( o h ) 3 ：0 5gg 土壤浸液：1 0 0 0m l ， 在1 1 5 下高温灭菌2 0m i n 。 6 ) 共生金菌培养基阿拉伯树胶：2 0 0g ；m n c 0 3 ：1g ；蒸馏水：1 0 0 0m l ； 琼脂：2 0 0g ；p h 为6 5 。 7 ) 普通生丝微菌乙酸钠：1g ；n h 4 c h 1g gm g s 0 4 7 h 2 0 ：0 5g ；m n c 0 3 ： o 5g ；蒸馏水：1 0 0 0m l ；琼脂：2 0 0g ；p h 为7 o 。 3 、优化生长曲线培养基： 1 ) b p y 培养基牛肉膏：2g ；蛋白胨：4g ；n a c h2g ；酵母浸粉：2gg 葡萄 9 土壤中锰氧化细菌的筛选、特性及其对m n ( 1 1 ) 的氧化 糖：2g ；p h 为7 o 。 2 ) l b 培养基酵母膏：2g ；蛋白胨：4g ；n a c l - 4g ；p h 为7 o 。 3 ) 2 x p y g 培养基酵母浸粉：0 5g t 葡萄糖：o 5g ；m g s 0 4 7 h 2 0 0 3g ； c a c l 2 2 h 2 0 ：o 0 7g ；在11 5 下高温灭菌3 0m i n th e p e s ：3 5 7g ；p h 为7 o 。 4 ) l 2 培养基蛋白胨：2g ；酵母浸粉：o 5g ；蒸馏水：o 5l ；a s w ( 人工海 水) ：o 5l ：微量元素溶液：1m l ；p h 为7 5 ；在1 1 5 下高温灭菌3 0m i n ，冷却 后加入过滤灭菌的h e p e s ( 终浓度0 0 2 m ) 。 【a s w ( g l ) n a c i ：0 3m ；k c i ：0 0 1 m , m g s 0 4 ：o 0 5m ：c a c l 2 o 0 1m ； h 2 0 ll ；微量元素溶液c u s 0 4 5 h 2 0 ：0 0 1m ；z n s 0 4 7 h 2 0 ：0 0 4 4m ； c o c l 2 6 1 - 1 1 0 o 0 2m ；n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 - 0 0 13m 】 2 1 4 试剂 胶回收试剂盒购自o m e g a 公司。所用的限制性内切酶、p c r 试剂盒、p g e m t e a s y v e c t o r 试剂盒以及其它相关分子生物学常用试剂均购自t a k a r a 生物工程( 大连) 公司。 2 1 5 锰氧化细菌的分离方法 无菌条件下，称取1g 制备好的样品( 土壤铁锰结核或土壤铁锰胶膜) ，加入9i i 儿 无菌水的三角瓶中，制成菌悬液使其稀释度为1 0 - 1 ，在1 8 0r m i n ，3 0 条件下往复 震荡3 0m i n ，摇散菌体，静置1 0m i n 后取上清液梯度稀释得到如下五个稀释度： 1 0 、1 0 一、1 0 4 、l o 一、1 0 击，将上述稀释度的试管分别取1m l 于液体富集培养基中， 于3 0 恒摇床中培养2 5d ，以保证生存下来的