（农药学专业论文）多杀菌素高产菌株的诱变育种.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学圣葸论文 舀 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独刨性声明 本人声明所呈爱的论文是我个人在导 | 币指导下进行的研究2 r _ 作及取得的研宠成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其佳人已f 经发 表或撰写过弱磅究成果，也不包舍为获得华中农业大学或其毽教育机构的学位或证书 两使用过豹栳科，撩导教师对比遴行了审定。与寝一同工作鞠闭志对本研究所傲纳任 何贡献均已在论文巾做了明确的说明，并表示了谢意 研究垒签名：徐裱国酵问：砷年歹, t l 愿嚣 学位论文使用授权书 本入完全了躬“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，印学生蘑缳按 照学校要求提交学位论文妁印蒯本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印。缩币或扫描等复钢手段保存，汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不弼方式在不蔺媒体上发表，传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用子本授权书。 撇黼鲐衿辆獬各蒋移 签名日期：7 冬j 月z g 丑 签名爵期： 如7 等，月孑茸 注：请将本袭直接装；r 在学位论文豹扉页莆f 目录之阍 多杀菌素高产菌株的诱变育种 摘要 通过对多杀菌素产生菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) c 0 3 2 9 菌株进行分离 复壮，获得一株遗传性能较为稳定的菌株c 0 3 2 9 2 1 ，以c 0 3 2 9 2 1 为出发菌株 进行紫外线诱变育种，获得比出发菌株c 0 3 2 9 2 1 效价( 2 5 3 ：g m l ) 提高9 7 的 菌株u v l 2 5 ，对u v l 2 5 进行n t g 诱变，获得比u v l 2 5 效价( 2 7 8 # g m l ) 提高 8 6 的菌株n 2 6 3 ，以n 2 6 3 为出发菌株进行了c o - 射线诱变，得到比n 2 6 3 效价( 3 0 弘g m l ) 提高2 1 5 的菌株c 0 3 0 5 。以菌株c 0 3 0 5 为出发菌株，进行原 生质体紫外诱变，得到一株发酵效价提高1 8 7 的菌株p u 4 4 6 ( 4 3 6 ：t g m l ) ，通 过对p u 4 4 6 进行链霉素筛选获得一株发酵效价提高1 1 4 的菌株 s 1 1 9 ( 4 8 5 乒g m l ) 。通过以上育种多杀菌素菌种发酵效价提高了9 1 7 。 以s 1 1 9 、p u l 3 1 ( 试验室筛选，长势较好，发酵效价2 8 6 y g m l ) 为出发菌 株，通过测定生长曲线，探索甘氨酸浓度和溶菌酶的酶解浓度、时间、温度对 原生质体形成的影响，确定制备原生质体的最佳条件为：种子液中加入甘氨酸 浓度0 4 m g m l 、培养4 8 小时，酶解浓度4 m g m l 、酶解温度3 2 、酶解时间 9 0 r a i n 。对4 种再生培养基的比较，确定以改良高氏培养基为较优的再生培养基。 通过原生质体灭活方式融合亲本s 1 1 9 、p u l 3 1 筛选得到一株分别比亲本菌株效 价提高1 2 6 和9 0 9 的融合子r 2 8 7 菌株( 5 4 6 肛g m l ) 。传代试验表明菌株 u v l 2 5 、n 2 6 3 、c 0 3 2 5 、p u 4 4 6 、s 1 1 9 和r 2 8 7 传代均比较稳定。 另外，对菌株r 2 8 7 摇瓶发酵过程中的还原糖、总糖、铵离子及可溶性磷 的测定，为多杀菌素工业发酵提供参考指标。 关键词：多杀菌素、育种、原生质体、制各、融合 注；本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 l 多杀菌素高产菌株的诱变育种 a b s t r a c t as t a b l ea n dh i 曲一y i e l d i n gs t r a i nc 0 3 2 9 - 2 1w a so b t a i n e df r o mc 0 3 2 9s t r a i no f s p i n o s y np r o d u c e rs a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s ab ys t a b l ee x p e r i m e n t a t i o n c 0 3 2 9 2 1 s t r a i nw a sm u t a t e db yf i v em e t h o d su v , n r g ”c o - q , i r r a d i a t i o n ，s t r e p t o m y c i ns u l f a t e a n dp r o t o p l a s t u v t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf 如em u t a t i o nm e t h o d sc o u l de n h a n c et h e f e r m e n t a t i o na b i l i t yo ft r a i n s t h ec h e m i c a lt i t e ro ft h ef i v eh i 曲一y i e l d i n gm u t a n ts t r a i n s u v l 2 5 、n 2 6 3 、c 0 3 0 5 、p u 4 4 6 、s 1 1 9w e r ei n c r e a s e db y9 7 ，8 6 ，2 1 5 ，1 8 7 ， 1 1 4 r e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h e i rp a r e n ts t r a i n s b a s e do ns 1 1 9a n dp u l 3 1 ，t h ec u l t i v a t i o nt i m e ，g l y c i n ec o n c e n t r a t i o n , b a c t e r i o l y s i n c o n c e n t r a t i o n , t i m e , t e m p e r a t u r et op r o t o p l a s mr e l e a s e w a se x a m i n e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o no fp r o t o p l a s tr e l e a s ew a sa sf o l l o w s ：蕾y c i n ec o n c e n t r a t i o no 4 m g m li ns e e d f l u i d ，c u l t i v a t e4 8h o u r s ；4 m g m lb a c t e r i o l y s i ni n3 2 c ，9 0m i n u t e s w ea l s os c r e e n e d t h eg - a o sn o 1c u l t u r em e d i u ma s t h e b e s tr e g e n e r a t i o nc u l t u r em e d i u m f i n a l l y , w e o b t a i n e das t r a i nr 2 8 7b yf u s i n gu n a c t i v a t e dp r o t o p l a s to fs t r a i n ss 1 1 9a n dp u l 3 1 s u b c u l t u r et e s ti n d i c a t e dt h a tu v l 2 5 ，n 2 6 3 ，c 0 3 0 5 ，p u 4 4 6 ，s 1 1 9h a dr e l a t i v e l ys t a b l e h e r e d i t a r yc h a r a c t e r i s t i c s l a s t l y , w ec h e c k e dt h ec o n c e n t r a t i o no f # u c o s e ，n h 4 + ，s o l u b l ep h o s p h a t e i n f e r m e n t a t i o nf l u i d t h e yc o u l dp r o v i d et h er e f e r e n c ef o rl a r g e s c a l ef e r m e n t a t i o no f s p i n o s a d s k e yw o r d s ：s p i n o s a d s ，s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a , b r e e d i n g ，p r o t o p l a s t ，p r e p a r a t i o n ， f i l s i o n 注；本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司白选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 2 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 前言 1 1 生物农药 生物农药是具有农药特性的用来防治病、虫、草等有害生物的生物活体及其产 生的生理活性物质和转基因产物。包括微生物农药、农用抗生素、植物源农药、生 物化学农药、转基因生物农药和天敌生物农药。与传统的化学农药相比，生物农药 具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样 性，来源广泛等优点。 “世界环境与发展大会”在1 9 9 2 年就明确要求在全球范围内控制化学农药的销 售和使用，生物农药的用量在近年内要逐步达到6 0 。目前，国际上已商品化的生 物农药有3 0 余种，专家预计，生物农药的销售额将达8 0 亿美元。为鼓励生物农药 的快速发展，我国政府对生物农药的发展采取了相应的支持政策，化学农药残留物 受到严格监控，通过创建“全国无农药残毒放心菜( 果) 活动”，对各地蔬菜、水果 生产和销售进行严格管理，一些地方政府还对生物农药的使用者试行高达价格5 0 的补贴政策。我国在8 6 3 高技术计划和2 0 1 5 年中长期科技规划中，均将生物农药。 列为重点攻关项目。专家预测，我国生物农药在科研、生产和市场方面都将得到迅 猛的发展1 1 1 。 多杀菌素是目前在全球范围内试现了商品化生产销售的最新生物农药品种之 一。它是一种新颖的大环内酯类杀虫剂，具有对害虫高效、对环境安全、对哺乳动 物低毒的优异特点。对鳞翅目害虫而言，多杀菌素是目前已发现的杀虫剂中选择 性最高的化合物之一。 1 2 多杀菌素的研究进展 多杀菌素，又名刺糖菌素( s p i n o s y n ) ，是由放线菌刺糖菌素多孢菌 ( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 发酵产生的一类大环内酯类化合物。这类化合物不仅 具有很高的生物活性，且兼具有生物农药的安全性和化学合成农药的快速效果。曾 因其具有低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快的特点，而获得美国“总统 绿色化学品挑战奖”【2 l 。多杀菌素对烟芽夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、粉 纹夜蛾、小菜蛾和水稻二化螟等鳞翅目幼虫有很高的活性。对鳞翅目幼虫的活性大 于多种有机磷、氨基甲酸酯、环戊二烯类杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀菌素对 许多双翅目害虫、蓟马、飞虱和白蚂蚁等膜翅目昆虫也有较好的效果。 包含有s s p i n o s a 菌株的土样最早是在1 9 8 2 年，由原礼来公司的一位科学家在 加勒比海休假时采集的土壤中意外发现的。1 9 8 5 年，在其发酵产物中被确定确试存 在一种活性物质。1 9 8 6 年该放线菌被确定是放线菌家族中的一个新成员【1 2 1 。直到 注：本课题为武汉天惠生物工程有限责任公司自选课题，由武汉天惠生物工程有限责任公司提供全部经费 3 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 9 9 4 年陶氏益农公司才将该新型农药提交到美国环保局，鉴于该药剂不滞留在环境 中，并且对哺乳动物和水生动物的毒性相当低，故于1 9 9 7 年给予其优先登记注册， 用于棉花和蔬菜。1 9 9 9 年在2 4 个国家超过1 0 0 种作物上登记注册，在我国商品名 为菜喜( 2 5 悬浮剂) 和催杀( 4 8 悬浮剂) 。 1 2 1 多杀菌素的产生菌 刺糖多孢菌f s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 属糖多孢菌属，是一种好氧性革兰氏阳 性的非抗酸性放线菌。它在大多数培养基( 女o y m s 、a t c c l 7 4 等) 上都能生长良好， 形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色到黄褐色，产浅粉黄色孢子， 在某些培养基上则产生自色孢子。孢子链外观为珠状，有孢子壳，孢子壳表面为针 状，故因此得名限口图1 ) 。菌体生长温度为1 5 3 7 ，对溶菌酶敏感，在高盐条 件下( 1 1 n a c l ) n 以生长l 。 图1 刺糖多孢菌多刺的孢子表面及营养菌丝形态 f i g1 s a c e h a r o p o l y s p o r as p i n o s as p i n ys u r f a c eo f t h ea c t i n o m y c e t eo e f t ) a n d t h e v e g e t a t i v es t a g e ( r i g h 0 嘲 1 2 2 多杀菌素的结构 自从1 9 9 0 年，b o e c k 等人首次从刺糖多孢菌n r r l - 1 8 3 9 5 培养液中分离出了刺 糖菌素组份a ，b ，c ，d ，e ，f ，h ，j 和多杀菌素a 拟糖苷配基( p s e u d o a g l y c o n e ) 以来l 韧，陆续发现了其他1 4 种多杀菌素类化合物，包括多杀菌素组份k ，l ，m ， n ，o ，p ，q ，r ，s ，t ，u ，v ，w ，y ，其结构和成分如图2 和表1 所示。多杀菌素a 母核是由一个5 ，6 ，5 顺反顺三环和一个十二元的内酯环粘合 而成。另外分别通过糖苷键连接一个氨基糖( b d - 福乐糖胺) 和一个中性糖( a l - 2 ，3 ， 多杀菌素高产菌株的诱变育种 4 三氧甲基鼠李糖) 到多杀菌素a 的母核上。其中多杀菌素a 组份约占8 5 - 9 0 ， d 组份约占加1 5 ，多杀菌素b ，c ，e ，f ，h ，j 组份和多杀菌素a 拟糖苷配 基均为次要组分。 叠 图2 多杀菌素的化学结构式 f i g 2s t r u c t u r e so fn a t u r a ls p i n o s y n s 注：本图摘自农药学学报2 0 0 3 年6 月第5 卷第2 期 表1 多杀菌素的各组分结构嘲 t a b l e1s t r u c t u r e so fs p i n o s y nc o m p o u n d s 注：本表摘自 p e s tm a n a g e m e n ts c i e n c e ： 2 0 0 1 年第5 7 卷第1 0 期 5 多杀菌素高产菌株的诱变育种 从结构上来说，多杀菌素属大环内酯类化合物，但和一般的大环内酯类化合物 相反，多杀菌素没有抑菌活性，与阿维菌素相似有杀虫活性。 1 2 3 多杀菌素的理化性质 发酵提取纯化后的多杀菌素为灰白色的固体结晶，主要是a 和d 的混合物， 称为s p i n o s a d ，其中8 5 8 8 的多杀菌素a 组分和1 2 1 5 的多杀菌素d 组 分，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味，在水溶液中的p h 值为7 7 4 ，对金属和 金属离子在2 8 天内相对稳定，属于非挥发性物质，其蒸汽压在1 3 x 1 0 “。p a 左右。 表2 概括了多杀菌素a 和d 的其他一些物理、化学性质。 多杀菌素在环境中的降解可通过多种途径组合的方式进行，主要为光降解和微 生物降解，最终变成碳、氢、氧、氮等自然组分。由土壤光解作用降解多杀菌素半 衰期为9 1 0 天，叶面光降解的半衰期是1 - 1 6 天，在无光照条件下多杀菌素经有氧 土壤代谢的半衰期为9 1 7 天。水解作用于多杀菌素的降解关系不大，因为在p i - l s - 7 范围内多杀菌素在水中是相对稳定的，p h 9 时其半衰期至少要2 0 0 天。另外考虑到 它的中等土壤传质系数k d ( 4 3 3 2 2 m i g ) 、低于中等程度的水溶解度和在环境中的 较短持久性，可见多杀菌素的沥滤性非常低。由此可见，多杀菌素不易残留于环境 中，因此，只要合理地使用它就不会对环境构成威胁。根据美国环保局( e p a ) 的 规定，不需要设置任何缓冲斟6 1 1 。 表2 多杀菌素a 和d 的物理化学特性( g a r ydt h o m p s o n ，2 0 0 0 ) t a b l e2 p h y s i c a la n d c h e m i c a lp r o p e r t i e so f s p i n o s y n sa a n d d 项目多杀菌素a多杀菌素d ! 塑堡曼足i 望! ! 理垒 墨巳i 望q ! z 坠旦 分子量7 3 1 9 87 4 6 0 0 结构式c 4 2 h 6 7 n 0 1 6c 4 , h 6 5 n o ：6 熔点( 。c )8 4 9 9 51 6 1 5 1 7 0 蒸汽压( p a )2 4 x1 0 1 01 6 x1 0 1 0 溶解度( m g m l ) p h 5 0 水 2 9 0 p h 7 0 水 2 3 5 p h 9 0 水 1 6 正辛醇水分配系数( 1 0 9 p ) 2 9 0 3 3 2 0 0 5 3 p h 5 0 2 83 2 p h 7 0 4 0 4 5 也! ：qi ：兰i ：兰 6 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 2 4 多杀菌素的生物合成 1 2 4 1 多杀菌素的生物合成基因 道农业科学公司的w a l d r o nc 等克隆到多杀菌素的生物合成基因簇，主要合成基 因排列在长约8 0 k b 的基因簇中( 图3 ) ，但也有个别基因( n d p 鼠李糖合成基因) 例外 不在这一基因簇中【7 9 】。 多杀菌素生物合成共涉及到2 3 个基因凹，j 2 ) ，其中，5 个聚酮合成酶基因( p k s ) 合成大环内酯结构，4 个基因将大环内酯修饰为糖苷配基。该生物合成基因簇中的各 主要基因的功能见表( 表3 ) ： 0 f ：竺匕坐：鲨!竺芝竺芷坐：! ：! f b l 1 6sq 0 mkig acer 2 峨势一一十 _ _ 啼_ _ _ _ - _ l 1 5r pnljh f bd r 1 图3 多杀菌素生物合成基因簇( c a r s o nw ，1 9 9 8 ) n 9 3t h eb i o s y n t h e s i sg e n ec l u s t e ro fs p i n o s y n s 表3多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能( c a r s o nw ，1 9 9 8 ) ! ! 垒! ! ! 墅p 竺! ! 垒! 望翌! 婪! 翌! 旦! g ! 翌! ! i 翌! 塾! ! p i 望q ! z 望坠! ! ! z 望! 塾! ! i ! ! ! 坚! ! 盟 基因 大小( 氨基酸) 推测功能同源性最高基因 相同相似 7 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 同源性最高的基因( 除s p n r 同源性最高的不是放线菌的基因) 2 编码的蛋白氨基酸序列的相同( i d e n t i t i e s ，m ) 或者相似( s i m i l a r i t i e s ) 性 毛生s p n s 基因的左侧克隆到了2 个基i 园( o r f 2l 1 5 和o r f 2l 1 6 ) ，这2 个基因 产物分别与氧化还原酶和l y s r 调控因子有较高相似性，但对这2 个基因的突变均未 见对多杀菌素生物合成有明显的影响。在p k s 基因右侧也有2 个开放阅读框， o r f 2 r 1 编码1 9 9 个氨基酸的小蛋白质，其功能未知，该基因对多杀菌素的合成有 何影响还未明确。o r f 2 r 2 基因产物则与外切脱氧核糖核酸酶有较高的相似性，对 该基因的突变也并未影响多杀菌素的合成。所以可能这四个基因与多杀菌素的生物 合成无关。 多杀菌素的编码聚酮合成酶( p k s ) i 均基因包含1 个装载模件( 1 0 a d i n gm o d u l e ) 和1 0 个延伸模件( e x t e n d i n gm o d u l e ) ，这些模件的基因按顺序头尾相连，分属5 个 同一转录方向的开放阅读框( 图4 ) 。s p n a 编码装载模件和模件2 ，这个延伸模件编 码的功能域有：k s 、a t 、a c p ；s p n b 编码模件2 ( k s ，a t ，d h ， e r ，k r 和 a c p ) ；s p n c 编码模件3 和模件4 ：k s ，a t ，k r 和a c t 功能域；s p n d 编码延伸 模件5 ( k s ，a t ，d h ，k r 和a c p ) 、模件6 ( k s ，a t ，k r 和a c p ) 及模件7 ( k s ， a t ，k r 和a c p ) ；s p n e 编码延伸模件8 、9 、1 0 ，这3 个模件均具有k s ，a t ，d h ， k r 和a c p ，s p n e 还编码t e 。刺糖多孢菌的大多数酰基转移酶( 卸结构域都只掺 入乙酸，但起始装载模件和延伸模件3 的a t 序列中具有丙酸掺入结构域，模件8 的a t 结构域也类似于丙酸掺入结构域，当模件8 掺入乙酸时则产生组分a ，掺入 丙酸时的产品为组分d ，在这一系列的聚酮基因的作用下，形成多杀菌素糖苷配基 图4多杀菌素模件化聚酮合成酶( p k s ) 基因簇。( 箭头：示s p n 基因转录的方向， k s 聚酮合成酶，a ：i 二酰基转移酶，a c p 酰基载体蛋白，d h - 脱氢酶，e r - 烯酰还原 酶，k r 酮还原酶，t b 硫酯酶) 嗍 f i g4 m o d u l a ro r g a n i z a t i o no ft h es p i n o s y np k sg e n ed u s t e r f r h ed i r e c t i o no f 8 多杀菌素高产茁株的诱变育种 t r a n s c r i p t i o no f t h es p ng e n e s i si n d i c a t e db ya r r o w s t h em u l t l f u n c t i o n a lp r o t e i n s a n dt h e i rf u n c t i o n si np o l y k e t i d ea s s e m b l ya r ei l l u s t r a t e db e l o wt h eg e n e s k s ， k e t o s y n t h a s e ；a t ，a c y l t r a n s f e r a s e ：a c p ，a c y lc a r r i e rp r o t e i n ；d h ，d e h y d r a t a s e ； e r ， e n o y lr e d u c t a s e ；k r ，k e t o r e d u c t a s e ；t e ，t h i o e s t e r a s e ) 基因簇中的4 个基因( 印f 、s p n 厂，s p n 工和聊岣在多杀菌素聚酮链形成交联桥 时起作用，最终形成多杀菌素的四环母核结构。 从n d p 4 酮6 脱氧葡萄糖合成n d p 二甲基福乐糖胺的过程，由2 ，3 脱氢酶 如印d ) 、3 - 酮还原酶( s p r y ) 、3 ，4 - 且觉氢酶( s p n q ) ，转氨酶( s p n l o ，二甲基转移酶( s p n s ) 催化7 。s p n p 编码福乐糖胺转移酶的基因。 n d p 鼠李糖与糖苷配基的连接则由鼠李糖转移酶( s p n g ) 催化，鼠李糖连接上 后，再由3 个甲基转移酶( s p n h ，s p n l 、s p n k ) 按顺序将3 个甲基转移到鼠李糖的2 - ， 3 和4 - o h 基上。以上的生物合成基因都包括在多杀菌素的大约8 0 k b 的合成基因 簇内。 负责鼠李糖合成的基因主要有4 种：n d p 葡萄糖合成酶基因q f f ) 、葡萄糖脱氢 酶基因圆砌) 、3 ，5 异构酶基因( e p 0 和酮还原酶基因( ) ，将葡萄糖- 1 - 磷酸转换为 n d p 鼠李糖。编码这4 个酶的基因同时还负责作为细胞壁成分的鼠李糖合成。这4 个酶的基因与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起【吲。 1 2 4 2 聚酮链的生物合成途径 多杀菌素的聚酮是通过在起始单位丙酸上按a a p a a a a a a a ( a 乙酰，p 丙酰) 的顺序添加1 0 个酰基缩合而成的，这1 0 个延伸单位的顺序缩合及 其还原修饰过程分别由装配成1 0 个模件的一系列酶所催化。聚酮链延伸完成后， 在模件1 0 中硫酯酶的催化下环化，接着在s p n 尸、s p n ，、s p n 工和s p n f 基因所编 码酶的催化下，在大环内酯核分子内c 3 c 1 4 、c a - c 1 2 及c 7 c l l 之间形成交联桥。 鼠李糖接到糖苷配基上是糖苷配基转换为多杀菌素必需的第一步，3 个甲基是 鼠李糖接好后才加上去的，并且连接顺序为2 ，3 和4 - o h 基。这3 个甲基来源 于s 腺苷甲硫氨酸，鼠李糖则是由葡萄糖1 磷酸经n d p 4 - 酮6 脱氧d 葡萄糖合成 【伸6 5 】。 福乐糖胺由n d p 4 酮6 脱氧d 葡萄糖( 是上述合成三甲氧基鼠李糖的共同中 间物) 经一系列酶( 1 扫s p n n 、s p n0 、s i n q 、s p nr 、s p ns 基因编码) 催化生成n d p 一福 乐糖胺，再由福乐糖胺转移酶催化将n d p 福乐糖胺连接到糖苷配基上合成多杀菌素 【删。 1 2 5 多杀菌素的生物活性 从1 9 9 0 年开始，在全球范围内广泛开展了多杀菌素的各项试验。据中国农科 院棉花研究所的潘登明等的试验证明4 8 s p i n o s a d 悬浮剂( 催杀) 防治抗性棉铃虫， 9 多杀菌素高产菌株的诱变育种 特别是大龄幼虫效果显著，见效快、持效长( 有效控制期8 i o d ) 、保顶保蕾效果好， 且对棉田主要捕食天敌较安全。在有效使用范围内对作物和人畜安全，是综合治理 抗性棉铃虫的理想替换农药新品种 删。试验证明多杀菌素能有效地控制鳞翅目、双 翅目和缨翅目害虫。另外它还能很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的 害虫种类【5 7 “3 1 。表4 列出了多杀菌素的注册的部分作物以及防治对象嘲。 多杀菌素具有高杀虫活性和高选择性，对于鳞翅目害虫而言，多杀菌素就是已 发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一，而对捕食性昆虫、哺乳动物和鸟类却表 现出较低的毒性，对于水生动物也只是轻微的中等毒性。此外，哺乳动物的慢性毒 性试验表明，多杀菌素无致癌、致畸、致突变或神经毒性【6 1 l 。表5 总结了多杀菌素 对哺乳动物、水生动物和鸟类的急性毒性数据f 8 j 。 表4多杀菌素的主要防治对象表【8 j ! ! 墅坦! ! 墅12 塑磐! 理! ! 曼! 翌! 绝避垒! ! 些! 趔里竺婴 作物主要防治对象 c r o p sp r i m a r yt a r g i h s 棉花 十字花科植物 叶用蔬菜 柑橘 苹果和梨 核果 烟草 杏仁 玉米 小麦和谷类 土豆 番茄 胡椒 热带果树 草皮和花卉 豆类菜 葡萄 鳞翅目和缨翅目 所有鳞翅目包括小菜蛾( p l u t e l l ax y l o s t e l l a ) 潜叶蝇和鳞翅目 缨翅目，鳞翅目和地中海试蝇( m 鼢c a p i t a t a ) 柑桔卷叶蛾，潜叶蝇，幼果娥( c 廊p o m o n e l l a ) f f 日苹蛆( r h a g o l e t i s p o m o n e l l a ) 桃芽蛾( a n a r s i al i n e a t e l l a ) 和脐橙螟( a m y e l o i st r a n s i t e l l a l 烟青虫( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 和烟草天蛾幼虫( m a n d u c as e x t a ) 桃芽蛾( a n a r s l al i n e a t e l l a l 和脐橙螟( a m y e l o i st r a n s i t e l l a ) 欧洲玉米螟( o s t r i n i an u b i l a 豇曲，玉米夜蛾( h e l i c o v e r p az e a ) 和秋天行军 虫( s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a ) 夜蛾和黑角负泥虫( o u l e m am e l a n o p u s ) 科罗拉多马铃薯叶甲( l e p t i n o t a r s ad e c e m l i n e a t a ) ，夜蛾和潜叶蝇 鳞翅目，缨翅目和双翅目 鳞翅目，缨翅目和双翅目 缨翅目和果蝇 鳞翅目。缨翅目和潜叶蝇 鳞翅目，缨翅目和潜叶蝇 鳞翅目 1 0 表5 多杀菌素对哺乳动物、鸟类和水生动物的急性毒性 s 脚c 构酬蚴裂鬟；凝哥 注：本表摘自( w o r l dp e s t i c i d e s 2 0 0 1 年第2 3 卷第1 期 1 2 6 多杀菌素的构效关系 自e v a n s 等人在1 9 9 3 年报道了多杀菌素类化合物( + ) - a 8 3 5 4 3 a 的全合成，通过 分子内d i e l s - a l d e r 反应制取多杀菌素类似化合物的四核环系统以来，国内外对于多 杀菌素类似物的合成进行了很多的研究。但由于多杀菌素结构的复杂，合成的化合 物难以工业化生产，所以人们将目光转向多杀菌素的结构改造。改变分子结构上的 取代基，是对天然产物进行改进的一个重要方向，对阿维菌素的成功改造，为对多 杀菌素的改造提供了一定的参考依据。在目前的研究中，对多杀菌素的结构改造主 1 1 多杀菌素高产菌株的诱变育种 要是对两个糖基的修改。由于对糖基的改造缺乏选择性，类似物的合成只能是同时 改造或同时去掉两个糖基。但当微量的多杀菌素h 、j 和k 被发现和分离以后，一 个更为可行的改造多杀菌素的方法出现了，即改造糖基上醚的部分。第一个类似物 是多杀菌素j 的一个衍生物，在鼠李糖基的3 ”位由天然的甲基醚转变为乙基醚。仅 仅是多加了一个亚甲基，其活性就提高了1 0 倍【叫。具体结果见表6 。 表6 多杀菌素及其类似物对烟芽夜蛾的构效关系【5 8 】 t a b l e6 s t r u c t u r e sa n dn e o n a t eh e l i o t h i sv i r e s c e n sl a r v a lt o x i c i t yf o rt h es p i n o s y n s a n ds e l e c t e ds p i n o s o i d s n 蝴c 糊d 剐l 隰r 2 1r 1 8 璐r 2黜 r 4 1 l c 0 s p i n o s y n s 1 s 翻n o g a 2 s p i n o s y r tb 3 s p i n o s , p c 4 s p i n d 3 妒d 5 s p i n o s 柙e 6 s p i n o s y nf 7 s p i n o s y n h 8 s p j n o s y j 9 s p i n o s 钟k 0 s p j n 。s 卅l 1 1 s 西n o s y n m 1 2 剐n c ，s y n n 1 3 s p i n o s y no 1 4 s p i n o s y np 5 s p i n o s 妒q 1 6 s p i n o s 帅r 1 7 s p i o s y ns 1 8 s p i n o s 朔t 9 s 秭n a e y n u 2 0 剐n o g 帅v 2 1 s 1 ) i n o s m w 丝s 9 i 唧y n 怕h 镕删d n - d e m e t h y lk n , n - d i d e m e t 时ik n - d e m e t h y lp 2 h a 2 二h d 2 0 l e 呐y i a 3 - h a 争o e 口_ i y i a 3 - o - n 斜o p , aa 3 o n - b u t y l a 3 - o - a l ma 3 o - c l i f f 3 a 掣- h a 乒o _ e 晰v | a 2 。3 “4 - i r i c l e 呐1a c y p e r m e t h r i n m em ee tm eh o m eo m e h j 一一一一一 hh 一 一一一 一 一一 一m e 一 一 一一 m e 一一 一一一 h 一一 一 一一一一一 o h 一 一一一一一一 o h m e o h h 一一一一一 o h h 一一一 m e o h 一一一 一m e 一 一一一一 一 一 o h 一一一一 m e o h h 一一一 一 o h 一 一 一 m e 一一 o h 一 一一一 一一o h o h 一一一 一一 o h 一 一 m e l o h 一 m e o h 一一 m e 一一 一 一 h 一一一 m e h 一一 hh 一一一一 h 一一 一一一一一 h m eh 一一一一一 o 日 一 一 一一一 o e t o a l h a o a _ 2 c f a o m e o h 一 o h o h o h o h o h o h 0 1 3 0 4 0 1 8 0 8 4 6 4 ，5 7 8 0 3 y 5 2 6 2 2 8 4 0 1 4 6 4 14 5 5 3 6 4 2 2 1 7 6 4 2 0 5 b 9 _ 9 7 4 e 4 0 r 2 3 o _ 2 3 n 3 0 o - 3 8 o _ 0 3 o - 0 5 o ，3 8 q 0 6 q 4 3 0 - 4 1 o 2 4 0 0 2 a 1 8 当然这种活性的提高可能跟鼠李糖上的修饰基团的极性有关，c r e e m e r 等的研 究表明鼠李糖上不同位置的甲氧基的替换，会呈现出不同的活性的变化【5 叼。 一洲洲洲一一一一一一一一一h睚旺 二|工二|工器 嚣m笛怂汀勰糟引毅孔汀镐 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 2 7 多杀菌素的作用机理 徐志红等【卅研究发现，与传统的有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用机理不 同，多杀菌素具有全新的作用机理，它并不作用于乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 和n a + 通道而是作用于烟碱型乙酰胆碱受体( i a c h r ) 虽然吡虫啉等烟碱类杀虫剂也作 用于n a c h r ，但是两者还是有差异的，多杀菌素在n a c h r 上的作用位点并不是吡 虫啉在n a c h r 上的作用位点。另外，也有研究表明多杀菌素作用于t 氨基丁酸 ( g a b a ) 受体，但是同样发现多杀菌素在g a b a 受体上的作用位点与已知的阿维 菌素在g a b a 受体上的作用位点不同。 s p i n o s y na 处理试虫的早期症状是由非功能性肌肉收缩引起的姿态变化。症状 之一是由足伸直引起的身体上升。在处理后的第二阶段试虫姿态改变严重而倒下且 不能恢复原态。这时出现广泛的震颤，最终震颤停止，试虫瘫痪。对昆虫腿部肌肉 运动神经元的记录显示昆虫出现这种症状的原因，s p i n o s y na 诱导大量运动神经元 持续活化，而导致身体内大部分肌肉收缩，在腿部，支撑身体重量的肌肉比反方向 的肌肉要强有力，所以身体会上升。而且，人们发现瘫痪试虫的神经活性维持在高 水平，这个事试表明瘫痪要么是由于没有神经肌的传递，要么是由于没有兴奋收缩 偶联。所以s p i n o s y n a 最初通过激活中央神经系统的神经细胞而引起非功能性的肌 肉收缩和震颤。而且，当以亚微升( s u b m i c r o m o l a r ) 浓度应用到分离的神经节上时， s p i n o s y na 能直接激活中央神经系统，在s p i n o s y na 诱导的延长的超兴奋之后，昆 虫出现瘫痪症状，这显然是神经过度运动后的疲劳而不是对神经肌系统的直接作 用。迄今为止，尚未发现某类产品以与此相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而 且尚无有关多杀菌素交叉抗性的报道。 1 2 8 多杀菌素的剂型 多杀菌素通过近几年的广泛应用，目前道农业化学公司开发的并推广应用的多 杀菌素主要有以下几剂型( 参见网站：h t t p ：w w w d o w a g r o c o m ) ： a 悬浮剂( s u s p e n s i o nc o n c e n t r a t e ) ：多杀菌素的水悬浮剂，有效成分的浓度 为2 5 - 4 8 。为多杀菌素产品系列的主要剂型，面向全球市场。 b 水分散粒剂( w e t t a b l e - g r a a u l e s ) ：有效成分浓度为2 5 的水分散粒剂，主要 面向日本市场。 c 火红蚁引诱剂( f i r ea n tb a i t ) ：有效成分含量0 0 1 5 ，主要用于在美国用来 防治输入性红火蚁( s o l e n o p s i si n v i c t a ) d 试蝇引诱剂( f r u i tf l yb a i t ) ：有效成分含量0 2 用来防止各种试蝇，包 括地中海试蝇( c e r a t i t i sc a p i t a t a ) 多杀菌素高产菌株的诱变育种 1 3 多杀菌素产生菌育种的研究 1 3 1 常规诱变育种 一般来说，改良发酵条件只能在较低水平上提高目的菌株的产素水平，生产上 多从抗生菌的遗传因素入手，通过高产菌株育种技术改变菌株的部分遗传信息，可 以从根本上提高菌株的产素水平【侧。 国内近年来开展了对s p i n o s a d 产生菌的研究，杭州华东医药集团有限公司生物 工程研究所的陈晓霞等通过u v 、6 0 c o i 丫射线等诱变剂处理，结合培养基配方的改良， 将产生菌的产素能力提高t 1 5 0 1 通常来说，在试际生产中，无论化学诱变剂还 是物理诱变剂，单独使用很少能收到预期的效果。所以生产中多采用几种诱变剂复 合处理、交叉使用的方法。据北京生物医药研究所的研究，对s p i n o s a d 产生菌进行 两次离子束诱变，其中穿插一次亚硝基胍( n t g ) 诱变，通过筛选得到比出发菌株 提高了1 4 0 的菌株【1 1 】。武汉天惠生物工程有限公司研究所，通过常规的诱变选育技 术目前多杀菌素的摇瓶产量达到约比出发菌株提高了将近5 倍。目前正积极的开展多 杀菌素产生菌的分子改造的研究，目前已经克隆到多杀菌素产生菌种的一个多效型 调控的负调控基因，有望获得应用。 1 3 2 原生质体融合育种 原生质体技术是指原生质体形成、再生和融合的一系列技术。它的优点是将两 亲本的整个基因强追性地混杂在一起，为异源d n a 片断交叉互换创造一个优良的 环境。原生质体技术包括原生质体的制备、培养、融合、再生和原生质体转化等等。 从1 9 5 3 年w e i b u l l 首次用溶菌酶酶解分离b a c i l l u sm e g a t e r i u m 得到原生质体以 来，微生物原生质体的研究得到了飞速的发展。1 9 7 4 年，f e r c n c z y 等1 4 3 】首先报道了 采用离心力诱导的方法促使白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d a m ) 营养缺陷型突变株的原 生质体融合，但融合率极低。同年，高国楠等1 6 2 】人在研究植物原生质体融合时发现 聚乙二醇( p e g ) 能有效地诱导融合，融合频率得到显著提高，并且证明p e g 诱导 融合的作用同样适用于动物细胞和微生物原生质体。1 9 7 8 年，z i m m e r m a n n “j 报道 了电融合技术，在短时间强电流的作用下，可逆性地击穿细胞膜，使相邻细胞的膜 相互融合，从而导致细胞融合。1 9 8 7 年开始，利用激光诱导融合的技术迅速发展起 来。该技术具有高度的选择性，但由于需要昂贵复杂的设备，操作技术难度大，难 以推广应用，还有待于进一步完善【2 1 】 近几十年来，由于研究方法的改进、研究手段的不断更新，围绕着原生质体的 研究，已经形成了一整套的原生质体技术，国内外利用这项技术培育微生物良种比 较活跃，应用范围日渐扩大，使这项技术不仅作为研究微生物遗传和育种的一种有 效手段，而且已形成为d n a