（外科学专业论文）氧化镁涂层az31b镁合金材料生物相容性研究.pdf

英文缩略语 5 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：! 壶兰! 垒日期：竺望：! ：兰 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：! 垫兰翌 指导教师签名：猛 日 期：兰旦：壁：支：塑 中文论著摘要 氧化镁涂层a z 3 1b 镁合金材料生物相容性研究 目的 探讨镁及其合金的生物相容性、细胞毒性，解决其在活体内耐腐蚀性差这一 关键问题。 方法 本研究采用粉末冶金方法和恒电流阳极氧化技术制备氧化镁( m g o ) 表面涂层 的a z 3 1 b 镁合金材料，确定镁合金表面性状改变的工艺方法，使工艺更易于控制、 材料性能更加稳定，并用电镜对其表面及其断面进行扫描，观察生理盐水对生物 材料的表面及截面微观结构的影响。同时进行小鼠体内的细胞毒性实验、微核实 验及溶血实验，研究其生物相容性。 结果 通过表面扫描对比发现，氧化膜明显地减少了a z 3 1 b 颗粒堆积及不规则大结 节的生成，而且表面沉积的晶粒界限清晰，生长更完全，更均匀。急性及亚急性 毒性实验中，各组小鼠均未出现不良反应，体重及体长无显著性差别。小鼠肝脏 病理学检查可见肝细胞形态排列正常，肝小叶清晰规则，细胞质均匀，微核实验 亦证实了氧化膜能够有效地抑制a z 3 1 b 材料的致突变反应。溶血实验发现，未经 处理的a z 3 1 b 材料发生了较为严重的溶血现象( 6 9 ) ，而经过表面氧化膜涂层处 理后的试样则表现出优良的血液相容性( 2 5 ) 。 结论 1 、经过氧化涂层的a z 3 1 b 材料具有良好的耐腐蚀性，可以较好的控制镁及其 合金的降解速度。 2 、a z 3 1 b 材料经过表面氧化膜涂层处理后，明显降低了a z 3 1 b 材料的溶血率， 具有良好的生物相容性，符合生物材料溶血性的要求。微核实验亦证实了氧化膜 层能够有效地抑制a z 3 1 b 材料的致突变反应。 关键词 镁合金：氧化镁；细胞毒性；生物相容性 2 英文论著摘要 s t u d yo fb i o c o m p a t i b i l i t yo fm a g n e s i u mo x i d ec o a t i n g a z 31 bm a g n e s i u ma l l o y o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n dc y t o t o x i c i t yo fm a g n e s i u ma n di t s a l l o y , i no r d e rt os o l v et h ek e yp r o b l e mo fp o o rc o r r o s i v er e s i s t a n c ei nv i v o m e t h o d t h i ss t u d yp r e p a r e i n gm a g n e s i u ma l l o y ( a z 31b ) 丽t l lm g oc o a t i n gb yt h e t e c h n o l o g yo fp o w d e rm e t a l l u r g ya n dc o n s t a n tc u r r e n ta n o d i co x i d a t i o nt od e f i n i t et h e c r a f to fm o d i f i n gt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h em a g n e s i u ma l l o ys u r f a c e m a k et h ec r a f t m o r ee a s i l yc o n t r o l l e da n dt h ep r o p e r t i e so ft h em a t e r i a lm o r es t a b l e s c a n n i n gt h e s u r f a c ea n dt h ec r o s s s e c t i o nt oo b s e r v et h ee f f e c to fs o d i u mc h l o r i d eo nt h es u r f a c e a n di t sc r o s s - s e c t i o nm i c r o s t r u c t u r e t os t u d yt h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fm a g n e s i u mo x i d e c o a t i n ga z 3 1bm a g n e s i u ma l l o y , w eh a v ed o n e c y t o t o x i c i t yt e s t s ，m i c r o n u c l e u s t e s t s a n dh a e m o l y s i st e s t si nv i v oo nm i c e r e s u l t s t h r o u g ht h es u r f a c ea n a l y s i sa n dc o m p a r i s o n 谢t hc o n t r o l s ，w ef o u n dt h a to x i d e f i l mc a ns i g n i f i c a n t l yr e d u c ea z 31bp a r t i c l e sa c c u m u l a t i o na n dt h ef o r m a t i o no f i r r e g u l a rn o d u l e s ，t h eo u t e rl i m i t so ft h ed e p o s i t i v eg r a i n sw a sc l e a r , d i s t r i b u t e i n gi na u n i f o r mw a y i na c u t ea n ds u b a c u t et e s t s ，t h em i c ei ne a c hg r o u pd i dn o tr e p r e s e n t a d v e r s er e a c t i o n t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nw e i g h ta n dl e n g t hb e t w e e n e a c hg r o u p i nt h ep a t h o l o g i c a li n s p e c t i o no ft h em i c el i v e r , w eh a df o u n dt h a t h e p a t o c y t e sa r r a n g e dn o r m a l l y , h e p a t i cl o b u l e sa r r a n g e dc l e a r l ya n dr e g u l a r l y , c y t o p l a s ms e e m e de v e n i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eo x i d ef i l mc o u l de f f e c t i v e l yi n h i b i t t h em u t a g e n e s i si nm i c r o n u c l e u st e s t s i nh a e m o l y s i st e s t s ，s e v e r eh e m o l y t i cc r i s i s ( 6 9 ) w a so b s e r v e di nt h eu n t r e a t e da z 31b ，w h i l et h es u i t a b l eb l o o dc o m p a t i b i l i t y ( 2 5 ) w a ss h o w ni ns a m p l e s 、析t ho x i d ef i l mc o a t i n go nt h es u r f a c e 3 c o n c l u s i o n i a z 31b w i t ho x i d ec o a t i n gp o s s e s ss u i t a b l ea n t i - c o r r o s i o nr e s i s t a n c e t h ef i l m c a nc o n t r o lt h ed e g r a d a t i o ns p e e do fm a g n e s i u ma n di t sa l l o y 2 a z 31b 、析廿1o x i d ec o a t i n go ni t ss u r f a c eh a v ea p p a r e n t l yc u td o w nt h e h a e m o l y s i sr a t e ，a n dh a v eg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n dc o r r e s p o n dw i mt h er e q u i r e so f h a e m o l y s i so fb i o m a t e r i a l i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eo x i d ef i l mc o u l de f f e c t i v e l y i n h i b i tt h ee f f e c to f m u t a g e n e s i si na z 3 1bm i c r o n u c l e u st e s t s k e vw e r d s m a g n e s i u ma l l o y ；m a g n e s i u mo x i d e ；c y t o t o x i c i t y ；b i o c o m p a t i b i l i t y 4 论文 氧化镁涂层a z 3 1b 镁合金材料生物相容性研究 刖置 人体内镁含量约2 5g ，它是体内仅次于钾的细胞内正离子，体内镁有离子 镁( m g ) 和结合镁两种形式。镁离子主要分布于细胞内，细胞外液中镁离子的水 平在0 7 - 1 0 5 m m o l l 之间，在此区间，肾和肠能维持其动态平衡。血清镁超过 1 0 5 m m o l l 能导致肌肉麻痹，低血压和呼吸性窘迫，当达到6 - 7 m m o l l 及高水平 时会出现心脏停止，由于通过尿液它可被有效排泄，所以高镁的发生率极其罕见 乜3 1 。镁是组成骨的主要成份，人体镁的6 0 存在骨组织内，所以镁对保护骨骼健 康非常重要。镁缺乏可明显干扰骨矿代谢的平衡，镁缺乏不仅可使血钙浓度降低， 而且还直接影响甲状旁腺激素( p ，i h ) 的分泌，当镁摄人不足时则从骨中释出镁， 镁促进骨、牙齿及细胞形成，也是j 下常骨细胞间质形成所需要的。镁离子参与体 内所有能量代谢，激活和催化3 0 0 多个酶系统，同时还与线粒体细胞及所有膜结 构和功能的完整性有关，通过激活膜上的n a - k - a t p 酶，保持细胞内钾的稳定，维 持心肌、神经、肌肉的正常功能“1 。既往研究表明，骨钙素对钙具有很高的亲和 力，骨钙素由成骨细胞合成和分泌，被认为是成骨细胞最具特征性的标志，也是 反映成骨细胞活性敏感而特异的指标畸1 。 2 0 世纪的上半叶，镁材料首次引入矫形外科，既往研究表明，当时主要由于 手术后镁材料极快的降解速度和皮下产生的大量气体使得多次尝试失败。为了减 缓降解速度，增加移植物的力学完整性，近年来的工作主要是研究各种镁合金材 料 8 1 。w i t t e 等人田1 研究镁合金材料在活体内的降解，比较包含少量铝锌的两种 合金和包含稀土元素的两种合金1 。铝锌包括3 w t 铝和1 w t 锌( a z 3 1 ) 及9 w t 铝和1 w t 锌( a z 9 1 ) 。第一份稀土金属包含4 w t 钇和3 w t 稀土金属混合物钕、铈 和镝( w e 4 3 ) 。第二份稀土金属包含4 w t 锂，4 w t 铝和2 w t 稀土金属混合物铈、 镧、钕和镨( l a e 4 4 2 ) 。直径为1 5m m ，长度为2 0m m 的移植物嵌入实验猪的股 骨。相同特点的多乳酸化合物用于调控，分别在6 周和1 8 周采集埋置物。同步放 6 射显微断层摄影术用于测定埋置物的降解，在1 8 周后可观察到其完全降解过程。 值得注意的是，在第6 周和第1 8 周所有镁材料组对比聚合物调控组都能观察到成 骨区域的增加( p o 0 5 ) 。在动物实验中发现，包含9 w t 铝的镁合金应用表现出 适当的生物相容性，在骨组织移植后，快速的腐蚀引起很典型而不显著的炎症反 应，这些炎症反应对邻近组织无害阳 1 。但是体外腐蚀率的测定结果并不能推测 体内的腐蚀率，检测活体内的腐蚀非常困难，尤其是硬组织n 引。大量实验结果表 明降解的镁基质能够促进移植物周围的骨形成和骨吸收，已观察到的作用证实， 镁合金材料作为骨移植物具有引人注目的前景。 镁在活体内电解质生理环境里降解速度太快是其应用的矫形外科中的一个很 大的限制，没有经过任何保护的镁暴露在空气中，由于大气中的氧化作用使其生 成氢氧化镁m g ( o h ) 。，在水的生理环境和氯离子的环境中，m g ( 0 h ) 。和氯离子发生 反应生成m g c l 。和h ：n3 j 。镁及其合金埋置物在活体内使用，没有发现不良反应的 征兆，同时许多已得到的信息都支持其使用的安全性。v o r m a n n 等人已经开始判 定纯镁和经过表面处理的镁在体外鼠骨髓细胞的细胞毒性，结果显示镁7 2h 后有 促进细胞增殖和发育的作用，并没有生长抑制的迹象n4 1 引。 以上例子支持镁及其合金材料作为轻量、可降解、有生物相容性和可能的矫 形外科生物活性材料的存在能力，但还应进一步加深对其无毒性、生物相容性、 力学完整性、活体内降解过程和骨应答的研究。当前组织工程学已经开始聚焦于 各种可降解材料在病态骨组织替代和置换方面的研究n 6 19 l ，比如在骨骼肌方面， 应需要一个机械力学性十分相近的组织材料呦1 ，在软骨组织工程，最佳的基质材 料应该是最开始的两个月内在力学方面应该具有机械稳定性，然后在人体内可逐 渐降解并消失，并且降解成分可以允许细胞的侵入和血管的形成。在可降解的生 物埋置剂中，镁作为最具有潜能的最佳植入材料越来越多的得到关注心，与一些 生物聚合体比如聚乳酸或聚乙醇酸相比，镁合金则显示出其较高机械稳定性。同 时镁的密度低1 7 4g c m 3 ，与人密质骨密度1 7 5g c m 3 相近陋2 2 3 i ，而且镁具有高 的比强度与比刚度，相比当前使用的可降解多聚体植入物，这些镁合金具有2 倍 拉伸屈服强度( 2 0 0 m p a ) 和4 倍杨式模量( 4 5 g p a ) 乜4 j 。由于在骨组织中功能作用 和状态，镁可能有激发新骨组织生长的作用n 3 2 引。镁合金的降解在活体内逐渐被 7 腐蚀，并且腐蚀产物能够通过巨噬细胞或其他细胞的吞噬带走。镁合金的腐蚀主 要依赖于它们的元素构成和腐蚀环境，添加稀土元素和新型镁合金相比有较低的 腐蚀率。此外，镁及其合金材料还可以增强成骨细胞的活性，最后在可降解埋置 剂周围完全被正常的骨组织替代n 别。我们知道，理想的骨缺损修复材料应具备有 良好的生物学性能。镁合金由于其较高的腐蚀性，将其应用于临床并不好实行， 因此控制镁的降解率在矫形外科显得尤为重要n 驯。 材料与方法 一、材料 l 、标本来源 实验动物包括昆明小鼠和大白兔( 中国医科大学实验动物中心提供) 、镁合金 材料( 中国科学院金属研究所提供) 。 2 、主要试剂 环磷酰胺( 山东鲁抗制药厂产品) 福尔马林固定液( 杭州市四季青生物工程有限公司) p b s 缓冲液( 上海西唐生物科技有限公司) 瑞士染色液( 北京耀明前沿科技发展中心) 肝素：1 2 5 0 0 i u m l 支( 河北常山生化药业有限公司) 小牛血清( 上海乐森生物有限公司) g i e m s a 染液( 北京耀明前沿科技发展中心) 3 、主要仪器 ( 1 ) c o b a s 生化自动分析仪( 瑞士产) ( 2 ) 2 2 0 1 型表面粗糙度检查记录仪( 哈尔滨量具刃具厂) ( 3 ) j s m - 8 4 0 型扫描电镜( s e m ) ( 日本j e o l 公司) ( 4 ) h i t a c h i 一6 0 0 透射电镜( 日本j e o l 公司) ( 5 ) 7 2 2 型分光光度计( 日本岛津制造) ( 6 ) 光学显微镜( 上海天能) ( 7 ) 超净工作台( 上海净化设备厂，c a 一9 2 0 2 型) 8 ( 8 ) p hs 一3 c 型数字式精密p h 计( 成都方舟科技开发公司) ( 9 ) 高速冷冻离心机( 德国h e r a e u s ) ( 1 0 ) 水浴恒温振荡器( 日本s a n y 0 0 ) ( 1 1 ) 恒温箱、记数器、比色皿、试管等相关设备( 宁波新芝科器研究所) 二、方法 1 、材料的制备及测定 ( i ) 材料的来源及成分a z 3 1 b 镁合金氧化涂层材料的制备实验选用铸态 a z 3 1 b 镁合金( 中国科学院金属研究所提供) ，化学成分见表1 ，铸态试样取自铸锭， 切割成小试块，制成a z 3 1 b 材料。 表1 ，实验用a z 3 1 b 镁合金的化学成分 ( 2 ) 阳极氧化法制备m g o 涂层a z 3 1 b 镁合金材料( m 9 0 a z 3 1 b 材料)将材料加 工成5 0 m i n x4 0 m i n x2 m m 的条形镁合金，经过金相砂纸粗磨、机械抛光、去离子水 超声清洗等过程，得到机械抛光后的基体。在可密封的电解槽中加入ph 值为 1 2 0 0 的饱和c a ( o h ) 。溶液，通入n 。气2 0 m i n ，用前处理后的抛光基体作工作电极 ( 阳极) ，金属铂片作辅助电极( 阴极) ，饱和a g a g c l 电极作参比电极；控制反 应温度为6 0 ，工作电极的电位为0 1 0 v 阳极氧化时间为8 0 m i n 的条件下，制备 出阳极氧化膜( m g o 膜层) 薄膜样品。也就是在a z 3 1 b 镁合金表面形成阳极氧化膜 ( m g o 膜层) ，制备成m 9 0 a z 3 1 b 材料。 ( 3 ) 材料浸提液制备镁合金材料( a z 31 b 材料和m g o a z 3 1 b 材料) 加工成 5 0 r a m 4 0 m m x 2 m m 的条形试件( 中国科学院金属研究所提供) ，其表面积为 4 3 6 3 c m = ，按照3 c m 2 试样m l 溶液的标准，制备材料浸提液。环氧乙烷消毒，将材 料置于1 4 5 m l 生理盐水中5 0 浸提7 2 h 。 ( 4 ) 将材料浸提液在c o b a s 生化自动分析仪( 瑞士产) 上采用放免法检测浸提 液镁离子浓度，同时测定浸提液p h 值。 ( 5 ) 材料表面粗糙度测定a z 3 1 b 及m 9 0 a z 3 1 b 材料浸提液制备前后，分别将 9 材料用2 2 0 1 型表面粗糙度检查记录仪( 哈尔滨量具刃具厂) 测定材料表面粗糙度 r z ( r z 代表微观不平度1 0 点高度平均数) ，取样长度为0 2 5 m m ，评定长度为1 2 5 m m 。 在试件表面随意3 个不同点取样，取平均值。 ( 6 ) 材料表面超微观察a z 3 1 b 及m g o a z 3 1 b 材料制作浸提液前后分别采用 j s m - 8 4 0 型扫描电镜( s e m ) 进行表面及截面扫描，观察生理盐水对生物材料的表面 及截面微观结构的影响，并且进行材料表面能谱线扫描分析。 2 、体内细胞毒性实验 ( 1 ) 急性毒性实验 动物来源取健康昆明小鼠3 0 只( 中国医科大学实验动物中心提供) ，体 重2 0 - - 2 5 9 ，雌雄各半。 剂量及分组随机分成3 组，分别记为a ，b ，c 三组。a 组为a z 3 1 b 材料 浸提液组；b 组为m g o a z 3 1 b 材料浸提液组；c 组为生理盐水阴性对照组；a 组小 鼠分别编号为a 。- a 。，b 组小鼠分别编号为b 。一b mc 组小鼠分别编号为c 。- c 帆，a ，b ， c 三组小鼠分别腹腔注射相应药物，其剂量均按5 0 m l k g 计算。 观察指标连续观察2 周，主要观察各组小鼠的精神状态，二便及饮食等 一般情况及不良反应。 ( 2 ) 亚急性毒性实验 动物来源取健康昆明小鼠3 0 只( 中国医科大学实验动物中心提供) ，体 重2 0 - - 一2 5 9 ，雌雄各半。 剂量及分组随机分成3 组，分别记为a ，b ，c 三组。a 组为a z 3 1 b 材料 浸提液组；b 组为m g o a z 3 1 b 材料浸提液组；c 组为生理盐水阴性对照组；a 组小 鼠分别编号为a 。- a 。，b 组小鼠分别编号为b 1 ，一b ：。，c 组小鼠分别编号为c l i - c 。，a ， b ，c 三组小鼠分别腹腔注射相应药物，其剂量均按l o m l k g 计算。各组小鼠每周 平均分别给药5 次。 病理观察2 个月后取肝脏标本作组织病理学检查。取实验鼠肝脏标本， 首先观察表面颜色、光泽、光滑度等大体变化，然后将标本同时置入1 0 缓冲甲 醛溶液( p h 7 4 ) 固定2 4 小时。 a 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯( i ) 5 m i n _ _ - - - - 甲苯( i i ) 1 0 5 m i n - - * 1 0 0 乙醇2 m i n - - * 9 5 的乙醇l m i n - - * 8 0 乙醇l m i n - - * 7 5 乙醇1 m i n 一蒸馏 水洗2 m i n 。 b 苏木素染色5 m i n ，自来水冲洗。 c 盐酸乙醇分化3 0 s ( 提插数下) 。 d 自来水浸泡1 5 m i n 或温水( 约5 0 ) 5 m i n 。 e 置伊红液2 m i n 。 f 常规脱水，透明，封片：8 5 乙醇l m i n - - * 9 5 乙醇1 m i n 一1 0 0 乙醇( i ) l m i n - - * 1 0 0 乙醇( i i ) l m i n - - * 二甲苯( i ) l m i n - - * _ _ _ 二甲苯( i i ) 1 m i n 一中性树脂 封固，光镜下观察。 3 、微核实验 ( 1 ) 动物来源选用昆明雄性健康小鼠2 0 只( 中国医科大学实验动物中心提 供) ，体重2 0 2 5 9 ， ( 2 ) 剂量及分组随机分成4 组：分别记为a ，b ，c ，d 四组。a 组为a z 3 1 b 材料浸提液组；b 组为m g o a z 3 1 b 材料浸提液组；c 组为生理盐水阴性对照组；d 组为环磷酰胺阳性对照组。a 组小鼠分别编号为a 。- a ，b 组小鼠分别编号为b 2 , - b 。， c 组小鼠分别编号为c 2 , - c ，d 组小鼠分别编号为d 2 1 - d 。，a ，b ，c 三组小鼠分别腹 腔注射相应药物，其剂量均按5 0 m l k g 计算。d 组其剂量按8 0 m g k g 计算。 ( 3 ) 给药及标本制备小鼠2 4 小时内腹腔给药两次，开始给药1 次，2 4 小时 后给药1 次，第二次给药后6 小时处死，处死后取胸骨止血钳挤出骨髓，用小牛 血清稀释，快速均匀推片，制备骨髓涂片，甲醇固定，g i e m s a 染色，计数每1 0 0 0 个嗜多染红细胞中带有微核的红细胞数，以千分率表示，计算微核细胞出现率。 数据采用医学统计软件进行统计学处理。 4 、溶血实验 ( 1 ) 制备2 的兔红细胞混悬液乙醚麻醉兔后，白兔耳抽取血液l o m l ，加入 肝素l m l 抗凝，用生理盐水洗涤、1 5 0 0 转分离心2 0 分钟，至上清液不显红色， 弃上清液后取2 m l 再加入l o o m l 生理盐水即得。 ( 2 ) 方法取l o m l 干净玻璃试管4 支，分别编号为a z 3 1 b 材料浸提液组； m g o a z 3 1 b 材料浸提液组；生理盐水阴性对照组；蒸馏水阳性对照组。各管轻度 摇动均匀后置3 7 。c 水浴中温孵3 h ，将各管的溶液置入干燥离心管中离心，取所有 各管的上清液置于比色器中，在7 2 2 型分光光度计上于4 2 8 n m 处测定各样本光密 度，以蒸馏水为空白读取各管吸光度值，溶血率= ( 样品吸光度一阴性对照吸光度) ( 阳性对照吸光度一阴性对照吸光度) 1 0 0 。 实验结果 1 、m g o a z 3 1 b 及a z 3 1 b 材料表面超微结构的变化本实验中利用s e m 及表面 粗糙度仪可以部分量化描述材料表面的形貌特征。 图1 ，a z 3 1 b 材料s e m 表面形貌( 浸泡前) 1 2 图2 ，a z 3 1 b 材料s e m 表面形貌( 浸泡后) 图3 ，a z 3 1 b 材料s e m 断面形貌( 浸泡后) 1 3 图4 ，m g o a z 3 1 b 材料s e m 表面形貌( 浸泡前) 图5 ，m g o a z 3 1 b 材料s e m 表面形貌( 浸泡后) 1 4 图6 ，m g o a z 3 1 b 材料s e m 断面形貌( 浸泡后) 图卜6 表明：生理盐水中5 0 浸提7 2 h 后，a z 3 1 b 镁合金表面层状物堆积及 不规则大结节生成较m g o 膜层a z 3 1 b 明显，并且结构疏松，孔隙结构增多； m g o a z 3 1 b 表面沉积薄膜的晶粒界限清晰，而且生长更完全，更均匀。由断面的 放大形貌可以发现，a z 3 1 b 镁合金的表层除了有m g o 层外，基体也被氧化，并有 定的龟裂与孔洞；而m g o a z 3 1 b 基体基本无明显变化。表面能谱线扫描分析发 现，m g o a z 3 1 b 材料的表层m g 元素含量约为a z 3 1 b 材料含量的2 倍( 图卜6 和表 2 ) 。本实验中采用放免法检测材料浸提液镁离子含量，发现m g o a z 3 1 b 材料浸提 液镁离子浓度约为a z 3 1 b 材料的1 7 ( 表3 ) ，说明m g o 涂层延缓了a z 3 1 b 镁合金 降解产物的释放速度。 表2 ，m g o a z 3 1 b 材料表面能谱线扫描分析结果( ) 1 5 表3 ，浸提液镁离子浓度及酸碱度测定 表4 为体外生理盐水对镁合金材料表面粗糙度的影响。表4 表明，生理盐水 中5 0 浸提7 2 h 后，a z 3 1 b 材料和m g o a z 3 1 b 材料的表面r z 值明显增大，差异具 有统计学意义( p o 0 5 ) ，且低于5 的国际药典阳 性标准，无致突变反应( 表5 及图1 0 一1 3 ) 。 表5 ，金属材料致小鼠骨髓细胞突变反应检测结果 r 辩 ”弋 八上 图1 0 ，m g o a z 3 1 b 材料组1 0 0 碰巴擘唯 秽 1 8 哪啊 啭幽 霹 图1 1 ，生理盐水阴性对照组1 0 0 图1 2 ，a z 3 1 b 材料组1 0 0 1 9 匕 ，b、， 酆_、 一 |r露e，q q b p隧似 7y 7 瞒 ，。 烹露_ 爹； 越二 熙 ，馕 蚓 章 图1 3 ，环磷酰胺阳性对照组x1 0 0 4 、溶血实验本实验我们发现a z 3 1 b 材料出现了较为严重的溶血现象，溶血 率为6 9 ；m g o a z 3 1 b 材料溶血率为2 5 ，符合生物材料溶血性的要求( 溶血率 小于5 ) ( 表6 ) 。以上实验结果表明，从溶血度标准上，可以认为本品生物相容 性好，无明显的溶血作用，a z 3 1 b 经过表面m g o 涂层等处理后，具有良好的生物 相容性，有可能应用在生物材料领域。 表6 ，金属材料溶血性检测结果 讨论 镁及其合金材料在人体内通过电解质环境的腐蚀逐步降解为镁离子，人体内 镁主要分布于细胞内，它参与体内一系列的新陈代谢过程，同时促进成骨细胞的 形成，加速骨愈合等，因此考察镁金属的生物相容性、细胞毒性和生物适应性， 解决镁在人体内耐腐蚀性差这一关键问题十分重要。本研究中，我们利用恒电流 2 0 阳极氧化技术提高镁合金a z 3 1 b 的表面腐蚀防护性能。研究发现，a z 3 1 b 的表面 m g o 膜层明显地减慢了镁的降解速度。可使镁合金的降解在活体内逐渐被腐蚀， 并且腐蚀产物能够通过巨噬细胞或其他细胞的吞噬带走呻1 引。同时通过表面分析对 比发现，m g o 膜层明显地减少了a z 3 1 b 颗粒堆积及不规则大结节的生成，并且结 构较为紧密，孔隙结构减少。m g o a z 3 1 b 表面沉积薄膜的晶粒界限清晰，而且生 长更完全，更均匀。微核实验亦证实了m g o 膜层能够有效地抑制a z 3 1 b 材料的致 突变反应口6 i 。同时急性及亚急性的毒性实验中发现，实验组和对照组小鼠均无不 良反应，而在生长、体重、精神状态、饮食及二便未见明显差异，小鼠肝脏病理 学检查可见肝细胞形态排列正常，肝小叶清晰规则，细胞质均匀，未见明确组织 水肿、纤维化及炎症细胞浸润等异常变化，偶见小泡性脂肪滴空泡。说明本实验 并未发现a z 3 1 b 材料和m g o a z 3 1 b 对小鼠具有毒性及其不良反应。 溶血实验我们发现，a z 3 1 b 材料在体外生理环境下可以迅速释放大量的镁离 子，且出现了较为严重的溶血现象；而a z 3 1 b 材料经过表面m g o 膜涂层处理后， 明显降低了a z 3 1 b 材料的溶血率，具有良好的生物相容性，符合生物材料溶血性 的要求。血液相容性是衡量生物材料生物相容好坏的一个重要指标乜2 1 ，我们采用 了体外非直接接触的方法来考察镁合金材料的血液相溶性，非直接接触法是利用 材料的浸提液来与新鲜血液接触，从而考察血液的溶血情况，该方法的有点是能 直接方便的考察由试样释放出的有害离子对血红蛋白的溶血作用，不足之处是不 能考察试样形貌对细胞溶血的影响，在实验中未经处理的a z 3 1 b 材料发生了较为 眼中的溶血现象( 6 9 ) ，而经过表面m g o 膜涂层处理后的试样则表现出较为优良 的血液相容性。由此可以合理推断a z 3 1 b 材料和m g o a z 3 1 b 材料试样表现出不同 的容血率是由试样不同的耐腐蚀性导致的，事实上，在制备材料浸提液的实验中， 由于生理盐水中的氯离子浓度较高，a z 3 1 b 材料在与生理盐水溶液5 0 。c 浸泡7 2 小 时后，产生了严重的腐蚀现象，浸提液变得比较粘稠，而m g o a z 3 1 b 材料浸提液 只是变得略微混浊，如果在浸提液中含有较高浓度的镁离子，则当红细胞悬液与 材料浸提液接触后，红细胞会因细胞壁两边产生不同的渗透压而产生溶血现象。 由此可见，只要通过合适的表面改性以提高镁合金的耐腐蚀性能，是可以避免对 人体产生有害的溶血现象的。 2 1 同时许多已得到的信息都支持其使用的安全性，v o r m a n n 等人已经开始判定 纯镁和经过表面处理的镁在体外鼠骨髓细胞的细胞毒性，结果显示镁7 2h 后有促 进细胞增殖和发育的作用，并没有生长抑制的迹象n 4 1 副。与一些生物聚合体比如 聚乳酸或聚乙醇酸相比，镁合金则显示出其较高机械稳定性。镁合金的腐蚀主要 依赖于它们的元素构成和腐蚀环境，添加稀土元素和新型镁合金相比有较低的腐 蚀率。相比当前使用的可降解多聚体植入物，这些镁合金具有2 倍拉伸屈服强度 ( 2 0 0 m p a ) 和4 倍杨式模量( 4 5 g p a ) 泓3 ，因此在可降解的生物埋置剂中，镁作 为最具有潜能的最佳植入材料越来越多的得到关注。 本研究证实，经过氧化涂层的m g o a z 3 1 b 材料具有良好的耐腐蚀性，可以较 好的控制镁的降解速度，镁材料可作为轻量、可降解、有生物相容性和可能的矫 形外科生物活性材料的存能力。但还应进一步加深对其无毒性、生物相容性、力 学完整性、活体内降解过程和骨应答的研究。 结论 1 、经过氧化涂层的a z 3 1 b 材料具有良好的耐腐蚀性，可以较好的控制镁的降 解速度。 2 、a z 3 1 b 材料经过表面m g o 膜涂层处理后，明显降低了a z 3 1 b 材料的溶血率， 具有良好的生物相容性，符合生物材料溶血性的要求。而且微核实验亦证实了m g o 膜层能够有效地抑制a z 3 1 b 材料的致突变反应。 本研究创新性的自我评价 目前在病态骨和破坏骨的替代和修补方面，金属材料仍扮演着一个非常重要的 角色。镁及其合金材料作为生物医用植入材料有很多优点，如果同时利用镁及其 合金在含有氯离子体液环境中的高腐蚀速率，发展生物可控降解的镁合金植入材 料，这将是一个崭新而且富有挑战的创新性研究课题，但是由于镁的高降解速率 将其应用于临床非常困难，本研究采用a z 3 1 b 镁合金的阳极氧化法，在a z 3 1 b 镁 合金表面形成阳极氧化膜( m g o 膜层) ，明显降低了其镁合金材料在体液环境中的 腐蚀率。随着研究的深入，镁可望在骨折的愈合与修复的治疗中发挥重要的作用， 但还应进一步加深对其无毒性、生物相容性、活体内降解过程和骨应答的研究， 在不远的将来镁将会作为一种新兴的金属材料应用于临床。 参考文献 1d ev a l kh w m a g n e s i u mi nd i a b e t e sm e l l i t u s n e t hjm e d ，19 9 9 ，5 4 ( 4 ) ：13 9 14 6 2o k u m at m a g n e s i u ma n db o n es t r e n g t h 【j 】n u t r i t i o n ，2 0 0 1 ，1 7 ( 8 ) ：6 7 9 6 8 0 3s a r i sn e ，m e r v a a l ae ，k a r p p a n e nh ，e ta 1 m a g n e s i u m a nu p d a t eo np h y s i o l o g i c a l ，c l i n i c a l a n da n a l y t i c a la s p e c t s 【j 】c l i nc h i ma c t a , 2 0 0 0 ，2 9 4 ( 1 ) ：l 一2 6 4 z r e i q a th ，v a l e n z u e l as m ，n i s s a nb b ，e ta 1 t h ee f f e c to fs u r f a c ec h e m i s t r ym o d i f i c a t i o no f t i t a n i u ma l l o yo ns i g n a l l i n gp a t h w a y si nh u m a no s t e o b l a s t s 【j 】b i o m a t e r i a l s ，2 0 0 5 ，2 6 ( 3 6 ) ： 7 5 7 9 7 5 8 6 5k a s t e np ，v o g e lj ，l u g i n b i l h lr ，e ta 1 i n f l u e n c eo fp l a t e l e t r i c hp l a s m ao no s t e o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o no fm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sa n de c t o p i cb o n ef o r m a t i o ni nc a l c i u mp h o s p h a t e c e r a m i c s c e l l st i s s u e so r g a n s ，2 0 0 6 ，1 8 3 ( 2 ) ：6 8 7 9 6w i t t ef ，k a e s ev ，h a f e r k a m ph ，e ta 1 i nv i v oc o r r o s i o no ff o u rm a g n e s i u ma l l o y sa n dt h e a s s o c i a t e db o n er e s p o n s e 【j 】b i o m a t e r i a l s ，2 0 0 5 ，2 6 ( 17 ) ：3 5 5 7 3 5 6 3 7w i t t ef ，u l r i c hh ，r u d e r tm ，e ta 1 b i o d e g r a d a b l em a g n e s i u ms c a f f o l d s ：p a r t1 ：a p p r o p r i a t e i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e jb i o m e dm a t e rr e sa ，2 0 0 7 ，8l ( 3 ) ：7 4 8 - 7 5 6 8h a m m o n dj s ，b e c k i n g h a mi j ，s h a k e s h e f fk m s c a f f o l d sf o rl i v e rt i s s u ee n g i n e e r i n g e x p e r t r e v m e dd e v i c e s ，2 0 0 6 ，3 ( 1o ) ：21 - 2 7 9w i t t ef ，u l r i c hh ，p a l mc ，e ta 1 w i l l b o l db i o d e g r a d a b l em a g n e s i u ms c a f f o l d s ：p a r ti i ： p e r i i m p l a n tb o n er e m o d e l i n g j 】w i l e yi n t e r s c i e n c e ，2 0 0 7 ，8l ( 3 ) ：7 5 7 - 7 6 5 10w i t t ef ，f e y e r a b e n df ，m a i e rp ，e ta 1 b i o d e g r a d a b l em a g n e s i u m h y d r o x y a p a t i t em e t a l m a t r i xc o m p o s i t e s b i o m a t e r i a l s ，2 0 0 7 ，3 5 ( 2 8 ) ：2 1 6 3 - 2 1 7 4 1 l o r r i s si r ，k n i g h tg e ，r a n a s i n g h es ，e ta 1 o s t e o b l a s tr e s p o n s e st on u c l e o t i d e si n c r e a s e d u r i n gd i f f e r e n t i a t i o n 【j 】b o n e ，2 0 0 6 ，3 9 ( 1 6 ) ：3 0 0 - 3 0 9 12w i t t ef ，f i s c h e rj ，n e l l e s e nj ，酣口z i nv i t r oa n di nv i v oc o r r o s i o nm e a s u r e m e n t so f m a g n e s i u ma l l o y s j 】b i o m a t e r i a l s ，2 0 0 6 ，2 7 ( 7 ) ：1013 - 1018 13h e u b l e i nb ，r o h d er ，k a e s ev ，e ta 1 b i o c o r r o s i o no fm a g n e s i u ma l l o y s ：an e