毕业设计（论文）-PPT答辩-脂质体介导的CHO细胞转染.ppt

,脂质体介导的CHO细胞转染脂质体介导的基因真核细胞转染,指导老师：班级：生物2班姓名：XX,一内容简介二实验材料三实验方法四实验结果分析五结论,一内容简介转染就是让外源核酸进入真核细胞中。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年代末和70年代初期已经建立。常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol沙rene介导的外源DNA导入培养细胞可分为瞬时转染和稳定转染。本实验将采用脂质体转染法转染宿主细胞。Lipofectamine2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率，具有高效性和操作步骤简单的优点。,影响阳离子脂质体转染细胞转染效率的因素1.被转染细胞脂质体复合物越易进入细胞，基因转染效率就越高。转染前细胞最好经过1次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。贴壁细胞生长到活率为80%时就要进行下一次传代，否则细胞就会出现接触抑制，从而降低细胞转染活力。转染时细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度相同2.培养基种类不同的细胞类型有不同的特性，需要特定培养基、血清、补充添加剂等。3.转染混合物中DNA与阳离子脂质体的量阳离子质脂体具有细胞膜活性，因此可能对细胞膜或亚细胞结构的膜结构的完整功能产生影响，从而形成细胞毒性。体外转染中，优化的比率常常大于1，而体内转染时其比率接近1较好。,二实验材料1.细胞系中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)2.试剂脂质体LipofectaminerM2000；G418；台盼蓝，储存浓度4，使用浓度04；固定液：4多聚甲醛甘氨酸漂洗液：IOOmML，用DPBS配制冲洗液：DPBS，每升溶液中含CaCl2O109、KCl0209、MgCl26H20O109，NaCl8009、Na2H711202169调节pH74，4“C保存。封闭液：5正常山羊血清抗荧光淬灭封片剂3.药品青霉素、链霉素；胎牛血清；D-Hanks：每升溶液中含NaCI89、KCl049、Na2HP040069、l(IL2P040069、NaHC030359。双抗：以PBS或D-Hanks配制，过滤除菌；抗体稀释液；抗PrP单抗BEl2；羊抗小鼠IgG。,4.培养基DMEM培养基，无血清optiMEM，Gibeo5.实验仪器细胞用倒置显微镜医用超净工作台C02细胞培养箱OliymptB倒置荧光显微镜；激光共聚焦扫描显微镜(FV500)超低温冰柜：80CULTFreezer702高速离心机冷冻台式离心机全自动高压锅DK8D电热三相恒温水槽,三实验方法（一）CHO细胞制备1.CHO细胞简介CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kla大于10h-1即可满足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。2.DMEM培养基组成将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温2030）到950毫升，轻微搅拌溶解。加入2.438克碳酸氢钠轻微搅拌溶解，加注射用水至一升用1molL氢氧化钠溶液或1molL盐酸溶液调ph至所需值用0.2um滤膜正压过滤除菌溶液应在28下避光保存,3.培养皿处理玻璃器皿一般需用清洁液浸泡17天，清水冲洗20次后再用蒸馏水洗两次，烤干备用。用前160高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1NHCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37干燥后，紫外线灯照射消毒。新橡皮塞须用1/2NAOH煮沸15分钟，洗后再用4HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压锅灭菌。4.CHO细胞培养将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。5.CHO细胞无血清驯化取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95，转瓶中开始进行无血清驯化。将无血清细胞培养基和原培养基按1:1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2105cells/ml的细胞，在37、5CO2培养箱进行培养。根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一个阶段可稳定传代1-3代，接种密度维持在2105cells/ml，逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例，即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2-3105cells/ml，直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2，每一代的细胞活率大于90后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养。,6.活体染色台盼蓝活体染色简单易行，是常用检查细胞存活的方法，用台盼蓝染液，然后可见死细胞染成均匀的蓝色，活体细胞不着色。7.细胞计数用血球计数板做细胞计数。根据情况用营养液稀释与否均可。做法是用习惯吸取少许染色的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙。稍后片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数，压线只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：细胞数/ml原液=四角大格内的细胞总数/4*10000*稀释倍数。（二）脂质体制备1.脂质体简介脂质体是由脂质双分子层组成的，不同组成的脂质体其表面电性会不同，表面电荷为阳性、阴性和中性的脂质体对细胞的转染频率也会有差别。其中阳离子脂类起主要作用，通过静电作用与DNA形成DNA-脂复合体，并引导DNA进入细胞,2.脂质体的制备方法脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离子融合法和逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。3.脂质体介导转染的机制阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞食、作用进入溶酶体。内吞后DNA-脂复合体在细胞内形成包涵体，在DOPE作用下，细胞膜上的阴离子脂质因膜的不稳定而失去原油的平衡扩散进入复合体，与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的DNA游离出来，进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行转录并表达。4.增加转染效率的添加剂脂质体-DNA复合体中加入一些阴离子物质促进复合体与细胞膜的融合或DNA的释放。DNA与脂质体混合前预先用磷酸盐缓冲液处理。硫酸精蛋白通过精蛋白分子中精氨酸残基浓缩质粒DNA来增加转染率。Ca2+能促进膜对DNA-脂质体的吸收。,11,（三）脂质体转染转染前24h，以胰蛋向酶消化CHO接种于24孔细胞培养板中，转染前细胞达到95融合。最佳DNA和脂质体转染比例确定：根据DNA和lipofeetamine2000的比例不同进行分组DNA(ug)：lipofectamine(uL)分别为l：l、1：2、l：3，l：4、1：5和空白对照组。转染细胞在37“C，5C02培养箱培养。转染不同时间置于(荧光显微镜)显微镜进行细胞形态学观察，确定DNA与脂质体哪个比例细胞转染成功率最高。得出转染的最佳比例后进行转染实验。实验分为空白对照组，脂质体转染PEGFP-ovPrP组。转染不同时间进行光镜观察并照相。转染24h后，按l：lO稀释细胞，接种到含G418的选择性培养基(2550ml培养瓶)，48小时内杀死阴性细胞，然后传代，接种6孔板。,三实验结果荧光显微镜、光学显微镜观察转染后24h在荧显微镜下观察转染效果，并计算转染效率。因为我们所构建的真核表达载体含有GFP绿色荧光蛋白报告基因，如果转染成功，被转染基因得到表达。在荧光显微镜下可看到绿色荧光，否则。不产生绿色荧光,对脂质体介导的质粒转染在不同的时间段观察，正常CHO细胞成圆形或椭圆，有的呈不规则三角形，细胞生长良好、饱满。转染8h后，个别细胞边缘不整齐，高倍镜下可见胞质那内有颗粒状物。转染绵羊PrP24h后，有的细胞表面出现空洞，这些细胞随时间延长，细胞体积变小。皱缩。最后悬浮在培养液中死亡。转染空质粒的细胞和只加脂质体的细胞无明显变化2.转染效率计算直接在荧光显微镜下随机采三个视野，计算发绿色荧光的细胞数占总细胞数的百分率即为转染效率。计算公式：转染效率()=(三个视野发绿色荧光的细胞总数)(三个视野总细胞数)100。空载体和pEGFP-OvPrP的转染效率大于65，表示在同一倍数下，同一视野下明场与荧光背景下转染空载体、pEGFP-OvPrP的细胞重合图，从图片可以看出，各质粒DNA的转染效果良好。,五结论在本实验中，在带有加强型绿色荧光蛋白报告基因pEFGFP-Ni真核表达载体的基础上，我们成功构建了pEGFP-OvPrP