（内科学专业论文）tryptase诱导aml骨髓基质细胞高表达vegf及机制的研究.pdf

目录 ilulliliillllljiillllllliiflll 丫17 6 9 6 7 8 中文论著摘要 t r y p t a s e 诱导a m l 骨髓基质细胞高表达v e g f 及机 制的研究 目的 急性髓细胞白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 是血液系统常见的恶 性肿瘤，以幼稚粒细胞克隆性增生且不伴有明显的分化为特征，临床分为多种亚 型，大部分亚型的发病机制仍不十分清楚。类胰蛋白酶( t r y p t a s e ) 是一种具有多 种生物学效应的丝氨酸蛋白酶，目前被作为a m l 发病和临床监测过程中的一种 新酶类而受到了人们的关注，以往被普遍认为主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞 ( 嗜碱性粒细胞产生少量) 产生的。随着对t r y p t a s e 广泛和深入的研究，发现在 a m l 患者的部分f a b 亚型也高表达t r y p t a s e ，同时，人们发现a m l 细胞系u 9 3 7 也可表达t r y p t a s e 。但是，a m l 患者白血病细胞所分泌的t r y p t a s e 在a m l 疾病发 展中的作用目前仍不十分明确。 我们前期研究证实，a m l m 2 患者骨髓单个核细胞的v e g f 与t r y p t a s e 的表 达均明显增高，且二者之间具有显著相关性。最近研究还发现，t r y p t a s e 阳性的肥 大细胞计数与许多恶性肿瘤和炎症的血管新生程度成正相关，可以促进多种肿瘤 细胞和炎症细胞表达v e g f ，并可作为判断恶性肿瘤患者预后的指标。这说明 t r y p t a s e 可能在a m l 血管新生中起着一定的作用，这种作用可能与v e g f 有关， 目前国内外尚未见相关报道。 p a r 2 是t r y p t a s e 的细胞表面受体，被t r y p t a s e 酶切裂解后可介导跨膜信号转 导，将细胞外的信号传递到细胞内。以往对多种细胞的研究表明，p a r 2 可通过 多种途径介导细胞内信号转导，但近年来研究主要集中在丝裂原活化蛋白激酶 m a p k 信号通路，其中v e g f 的表达则多与细胞外信号调节激酶e r k 和p 3 8 m a p k 通路有关。n f kb 是重要的转录调节因子，可作为e r k 和p 3 8 m a p k 信号通路 的下游信号分子，被激活后可引起相应靶基因的转录激活，以往的研究表明v e g f 的表达与n f kb 也有着密切的关系。 为探讨t r y p t a s e 在a m l 血管新生中的作用，我们将研究t r y p t a s e 作用于a m l b m c s 后是否上调v e g f 的表达，并进一步探讨t r y p t a s e 促进a m lb m c s 表达 v e g f 的可能作用机制：t r y p t a s e 与细胞表面的p a r 2 作用后，依赖细胞内m a p k ( e r k 和或p 3 8 m a p k ) 信号转导通路，激活转录调节因子n f kb ，使其转位到 核内，促使v e g f 表达增加。 方法 1 、细胞培养及鉴定：骨髓肝素钠混合液5 m l ，加入l o m l 淋巴细胞分离液， 2 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ，取单核细胞层，接种于2 5 m l 培养瓶中，1 5 胎牛血清， d m e m f 1 2 中，培养箱常规培养。根据细胞形态学和流式细胞术检测细胞表面 c d l 4 ，c d 3 4 ，c d 4 5 ，c d l 3 和c d l17 表达情况，鉴定所培养的细胞为a m lb m s c s 。 2 、重组t r y p t a s e 与a m lb m s c s 共同孵育后检测v e g f 的表达情况：以0 5 0 n g m l 的t r y p t a s e 作用于a m lb m s c s ，应用m t t 的方法检测细胞活性，从而挑 选t r y p t a s e 的最佳作用浓度。以不同浓度( 0 5 ，5 ，1 0n g m 1 ) 的t r y p t a s e 作用于 a m lb m s c s ，分别用e l i s a 、免疫荧光、r e a lt i m er t - p c r 和w e s t e r n - b l o t 的方 法检测v e g f 的表达情况。 3 、以u 9 3 7 细胞的培养上清培养a m lb m s c s ，检测v e g f 的表达：以 d m e m f 1 2 培养基、u 9 3 7 细胞培养上清液、u 9 3 7 细胞培养上清液加t r y p t a s e 抗 体作为培养基。培养a m lb m s c s2 4h 后，应用r e a lt i m er t - p c r 方法检测a m l b m s c s 中v e g fm r n a 的表达；培养a m lb m s c s4 8h ，应用e l i s a 方法检测 上清液中v e g f 的表达情况。 4 、免疫细胞化学和流式细胞术检测a m lb m s c s 表面p a r 2 的表达：用胰 酶将a m lb m s c s 从细胞培养瓶上消化下来，制成细胞爬片，待细胞生长至8 0 时，甲醛固定，以p b s 作为阴性对照，免疫细胞化学方法检测p a r 2 的表达。 取a m lb m s c s 约1 0 6 个细胞，甲醛固定，f i t c 标记的p a r 2 冰上孵育1 小时， p b s 洗2 次，以1 0 0r t lp b s 重悬细胞后上流式细胞仪检测。 5 、w e s t e r nb l o t 检测t r y p t a s e 处理前后e r k 、p 3 8 m a p k 蛋白：提取细胞总蛋 白，上样量为2 0 p g 。转印到p v d f 膜上后用5 脱脂奶粉封闭，e r k 鼠抗人多 2 克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) 、磷酸化e r k 鼠抗人多克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) g ：p 3 8 m a p k 羊抗人多 克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) 、磷酸化p 3 8 m a p k 鼠抗人多克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) 育过夜，分别用相 应的二抗室温孵育2h ，显色5 m i n ，于凝胶自动成像分析系统下成像，测定条带 的平均积分光密度值。 6 、e m s a 检测t r y p t a s e 处理前后n f kb 活化情况：a m lb m s c s 以p b s 、 t r y p t a s e 、t r y p t a s e 加n f - k b 的阻断剂p d t c 孵育2 4h 后，提取总的核蛋白，标 记探针，加样，转膜，用x 射线胶片曝光3 0 m i n ，显影液5m i n ，定影液5r a i n 。 观察t r y p t a s e 处理前后n f k b 的表达水平。 7 、r e a lt i m er t - p c r 检测使用p a r 2 、e r k 、p 3 8 m a p k 和n f kb 特异性 阻断剂预处理细胞后，t r y p t a s e 诱导a m lb m s c s 表达v e g fm r n a 的情况：分 别使用p a r - 2 、e r k 、p 3 8 m a p k 和n f - kb 特异性阻断剂：f l l s y - n h 2 ( 2 0 0j a m ) 、 p d 9 8 0 5 9 ( 2 0 “m ) 、s b 2 3 0 5 8 0 ( 1 0g m ) 和p d t c ( 1 0 0p m ) 孵育细胞3 0m i n ，然后 t r y p t a s e 与a m lb m s c s 共孵育2 4h 。收集细胞提取总r n a ，r e a lt i m er t p c r 检 测v e g fm r n a 表达。 8 、w e s t e r n b l o t 检测使用p a r 2 、e r k 、p 3 8 m a p k 和n f kb 特异性阻断剂 预处理细胞后，t r y p t a s e 诱导a m lb m s c s 表达v e g f 蛋白的情况：分别使用 p a r 一2 、e r k 、p 3 8 m a p k 和n f kb 特异性阻断剂：f l l s y n h 2 ( 2 0 0g m ) 、 p d 9 8 0 5 9 ( 2 0g m ) 、s b 2 3 0 5 8 0 ( 1 0g m ) 和p d t c ( 1 0 0 “m ) 孵育细胞3 0m i n ，然后 t r y p t a s e 与a m lb m s c s 共孵育4 8h 。收集细胞提取总蛋白，w e s t e r n b l o t 检nv e g f 蛋白的表达。 9 、统计学分析：统计数据以s p s s l 3 0 软件进行分，计量资料用均数标准 差表示，组间比较用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较用l s d 方法。结 果以p 0 0 5 认为差异有统计学意义。 结果 1 、e l i s a 、免疫荧光、r e a lt i m er t - p c r 和w e s t e r n b l o t 结果显示，t r y p t a s e 作用于a m lb m s c s 后，与对照组相比v e g f 表达明显增加( 尸 0 0 5 ) ，且在一 定浓度范围内，成一定剂量关系。 2 、e l i s a 和r e a lt i m er t - p c r 结果显示，以u 9 3 7 细胞培养上清液、u 9 3 7 细胞培养上清液培养a m lb m s c s 后，与对照组相比a m lb m s c s 中v e g f 表 达明显增加( p 0 0 5 ) ，这种增加在使用了t r y p t a s e 特异性抗体后明显减低 ( p 0 0 5 ) 。 3 、流式细胞术和免疫细胞化学方法结果显示，a m lb m s c s 细胞表面有 t r y p t a s e 特异性受体p a r - 2 的表达。 4 、w e s t e r nb l o t 结果显示，t r y p t a s e 与a m lb m s c s 共同孵育4 8h 后，与对 照组相比，磷酸化的e r k 和p 3 8 m a p k 蛋白表达明显增加( 尸 o 0 5 ) ，在使用了 磷酸化阻断剂p d 9 8 0 5 9 和s b 2 3 0 5 8 0 后表达降低( 尸 o 0 5 ) 。 5 、e m s a 结果显示，t r y p t a s e 与a m l b m s c s 共同孵育4 8h 后，与对照组 n f k b 核转位增加，在使用了n f k b 特异性阻断剂p d t c 后表达降低。 6 、r e a lt i m er t - p c r 和w e s t e r n b l o t 结果显示，分别使用p a r 2 、e r k 、 p 3 8 m a p k 和n f kb 特异性阻断剂( f l l s y n h 2 、p d 9 8 0 5 9 、s b 2 3 0 5 8 0 和 p d t c ) 处理细胞3 0m i n 后，t r y p t a s e 上调a m lb m s c s 的v e g fm r n a 和蛋白的 表达明显减低( 尸 0 0 5 ) 。 结论 1 、重组的t r y p t a s e 可以促进a m lb m s c s 高表达v e g f ，在一定浓度范围 内呈剂量依赖关系。 2 、白血病细胞系u 9 3 7 分泌的t r y p t a s e 可以促进a m lb m s c s 高表达 v e g f 。 3 、a m lb m s c s 表面表达p a r 2 ，p a r 一2 在t r y p t a s e 上调a m lb m s c s 的 v e g f 表达中起着重要作用。 4 、 e r k 、p 3 8 m a p k 和n f - k b 通路参与了t r y p t a s e 上调a m lb m s c s 的 v e g f 表达。 关键词 类胰蛋白酶，急性髓细胞白血病，血管内皮生长因子，蛋白酶激活受体2 ，丝裂 原活化蛋白激酶，核转录因子kb 4 英文论著摘要 t h er e s e a r c ho ft r y p t a s e - i n d u c e dv e g f o v e r e x p r e s s i o na n d i t sm e c h a n i s mi na m l b o n e m a r r o ws t r o m a lc e l l s o b j e c t iv 6 a c u t em y e l o i dl e u k e m i ai sac o m m o nm a l i g n a n c y i nb l o o dd i s e a s e ，w h i c h c h a r a c t e r i s t i c e db ya c l o n a l p r o l i f e r a t i o n i ni m m a t u r e g r a n u l o c y t e s a n dn o t a c c o m p a n i e d w i t hac l e a rd i f f e r e n t i a t i o n a m lc a nb ed i v i d e di n t oav a r i e t yo f c l i n i c a l s u b t y p e ，p a r to fw h i c h i ss t i l ln o tv e r yc l e a r t r y p t a s ei sas e r i n ep r o t e a s e ，w h i c hh a sa v a r i e t yo fb i o l o g i c a le f f e c t sa n dc u r r e n t l y c o n s i d e r e da san e we n z y m ei na m l p a t h o g e n e s i s ，c l i n i c a lm o n i t o r i n gp r o c e s sa n d r e c e i v e de x t e n s i v ea t t e n t i o n i tw a s w i d e l yb e l i e v e dt o b ep r i m a r i l ys e c r e t e db ym a s tc e l l sa n db a s o p h i l s b u tw i t ht h e e x t e n s i v ed e e p l ys t u d yi nt r y p t a s e ，ah i g he x p r e s s i o no ft r y p t a s eh a sb e e nf o u n ds o m e i na m lp a t i e n t so fp a r to ff a bs u b t y p e p r e v i o u sr e s e a r c hh a sa l s oc o n f i r m e dt h a t a c u t em y e l o i dl e u k e m i ac e l ll i n eu 9 3 7c a ns e c r e t et r y p t a s e h o w e v e r ，t h er o l e o f t r y p t a s ew h i c hs e c r e t e db yl e u k e m i a c e l l si na m li sn o tv e r yc l e a ri nt h ed e v e l o p m e n t o f a m l o u rp r e v i o u sf i n d i n g ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fv e g fa n dt r y p t a s e ，e r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di na m l - m 2p a t i e n t s ，a n dh a sas i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o n b e t w e e n v e g fa n dt r y p t a s e r e c e n ts t u d i e sh a v ea l s of o u n dt h a t ，t h ec o u n t so fm a s tc e l lo f t r y p t a s e p o s i t i v eh a s ap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t ha n g i o g e n e s i si nan u m b e ro fm a l i g n a n t t u m o r sa n di n f l a m m a t i o n t r y p t a s ec a np r o m o t eo v e r e x p r e s s i o no fv e g f i nav a r i e t y o ft u m o ra n di n f l a m m a t o r yc e l l s ，a n dm a ys e r v ea si n d i c a t o r sf o rj u d g i n gt h ep r o g n o s i s o fp a t i e n t sw i t hm a l i g n a n tt u m o r s t h i ss h o w st h a tt r y p t a s em a yp l a y sac e r t a i nr o l ei n a m l a n g i o g e n e s i s ，w h i c hm a y b er e l a t e dt ov e g f 5 p a r - 2i st h ec e l ls u r f a c er e c e p t o r so ft r y p t a s e ，a c t i v a t e db yt r y p t a s ea n dt h e n m e d i a t i n gt r a n s m e m b r a n es i g n a l t r a n s d u c t i o n p r e v i o u ss t u d i e ss h o w nt h a t p a r - 2 c o u l dt r a n s m i ti n t r a c e l l u l a ri n f o r m a t i o nb yav a r i c t yo fw a y s t h es t u d yi nr e c e n ty e a r s m a i n l yf o c u s e do nm a p ks i g n a l i n gp a t h w a y ，a n dt h ee x p r e s s i o no fv e g fw a sr e l a t e d w i t he x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s ee r ka n dp 38 m a p kp a t h w a y s n f r d 3i sa l l i m p o r t a n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，w h i c hc a n b eu s e da sd o w n s t r e a ms i g n a l i n gm o l e c u l e si n e r ka n dp 38 m a p ks i g n a l i n gp a t h w a y p r e v i o u ss t u d i e sh a v ea l s os h o w nt h a t e x p r e s s i o no fv e g f h a sac l o s er e l a t i o n s h i pw i t hn f - r b t oi n v e s t i g a t et h er o l eo ft r y p t a s ei na m la n g i o g e n e s i s ，w ew i l lr e s e a c ht h a t w e t h e rt r y p t a s ec o u l di n c r e a s e v e g fe x p r e s s i o ni nb o n em a r r o ws t r o m a lc e l l so fa m l ， a n dw e t h e rt h em e c h a n i s mo ft r y p t a s ep r o m o t ea m lb m c se x p r e s s i o nv e g fi st h a t t r y p t a s e a c t i v e sp a r - 2 ，t h e nd e p e n d e n t i n go nm a p k ( e r ka n d o rp 38 m a p k ) s i g n a l i n gp a t h w a ya n da c t i v i n gn f - r b ，i n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o no f v e g f m e t h o d s 1 c e l lc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o n ：b o n em a r r o wa n dh e p a r i ns o d i u mm i x t u r e 5 m l ，l y m p h o c y t es e p a r a t i o nm e d i u m10 m l ，2 0 0 0 r p m ，10 m i n , m o n o n u c l e a rc e l lw e r e o b t a i n e d t h e ni n o c u l a t e di n2 5 m 1c u l t u r e f l a s k 15 f e t a lb o v i n es e r u ma n d d m e m f12w e r eu s e dt oc u l t u r ec e l l s a c c o r d i n gt oc e l lm o r p h o l o g ya n dt h ee x p r e s s o fc d l 4 ，c d 3 4 ，c d 4 5 ，c d l 3a n dc d l1 7i n c e l ls u r f a c e ，w h i c hd e t e c t e db yf c m ， a m lb m s c sw a si d e n t i f i c a t e d 2 t h ee x p r e s s i o no fv e g fi na m lb m s c sa f t e ri n c u b a t e dw i t ht r y p t a s e ： m t tw a su s e dt od e t e c tc e l lv i a b i l i t ya f t e ri n c u b a t e dw i t ht r y p t a s ef 0 5 0n g m 1 ) i n o r d e rt os e l e c tt h eb e s tc o n c e n t r a t i o no ft r y p t a s e ，d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ( 0 5 ，5 ，10n g m 1 ) o ft r y p t a s ew e r eu s e dt oe f f e c to na m lb m s c s e l i s a ，i m m u n o f l u o r e s c e n c e ，r e a lt i m e r t p c ra n dw e s t e r n b l o tm e t h o dw e r eu s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fv e g f 3 t h ee x p r e s s i o no fv e g fi na m lb m s c sc u l t u r e db yt h es u p e r n a t a n t so f u 9 3 7c e l l s ：d m e m f 1 2s u b s t r a t u m ，u 9 3 7c e l lc u l t u r es u p e r n a t a n ta n du 9 3 7c e l l c u l t u r es u p e m a t a n tp l u st r y p t a s ea n t i b o d yw e r eu s e dt ob es u b s t r a t u m , t h e na m l 6 b m s c sw e r ec u l t u r e df o r2 4ha n dv e g fm r n aw e r ed e t e c t e db yr e a lt i m er t - p c r m e t h o d a m lb m s c sw e r ec u l t u r e df o r4 8hc u l t u r e da m lb m s c s4 8 h a n dv e g f e x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e db ye l i s am e t h o d 4 t h e e x p r e s s i o n o fp a r - 2i na m lb m s c sw a sd e t e c t e d b y i l i l m u n o c y t o c h e m i s t r ya n df l o wc ”o m e t us u r f a c e ：a m lb m s c sw e r ef i x e dw i t h p a r a f o r m a l d e h y d e ，a n dp b sa sn e g a t i v ec o n t r o i m m u n o c y t o c h e m i s t r yw a su s e dt o d e t e c tt h e e x p r e s s i o no fp a r - 2 a m lb m s c sa b o u t 10 6c e l l sw e r ef i x e dw i t h p a r a f o r m a l d e h y d e ，a n di n c u b a t e d 谢t hf i t cl a b e l e dp a r - 2f o r 1h o u ro ni c e ，a n d w a s h e dt w ot i m e s 谢t hp b sa n dr e - s u s p e n d e dc e l l sw i t h10 0 斗lp b s , t h e nd e t e c t e db y f l o wc ”o m e t r y 5 e r k , p 38 m a p kp r o t e i nd e t e c t e db yw e s t e r nb l o t i na m lb m s c s i n c u b a t e dw i t ht r y p t a s e ：t o t a lc e l l u l a rp r o t e i nw a se x t r a c t e d t h es a m p l e2 0 1 t gw a s t r a n s f e r e dt op v d fm e m b r a n e a n dc l o s e dw i t h5 s k i mm i l kp o w d e r t h em e m b r a n e w e r ei n c u b a t e d o v e r n i g h t 、析t he r km o u s e a n t i - h u m a np o l y c l o n a l a n t i b o d y p h o s p h o r y l a t e de r km o u s ea n t i - h u m a np o l y c l o n a la n t i b o d y ，a n dp 38 m a p kg o a t a n t i h u m a np o l y c l o n a la n t i b o d y ，p h o s p h o r y l a t e de r km o u s ea n t i - h u m a np o l y c l o n a l a n t i b o d y t h e ni n c u b a t e d 、v i t hr e s p e c t i v es e c o n d a r ya n t i b o d ya tr o o mt e m p e r a t u r ef o r2 ha n dw e r ec o l o r e d5 m i n 6 t h ea c t i v a t i o no fn f r d 3w a sd e t e c t e de m s ai na m lb m s c sa f t e r i n c u b a t i n gw i t ht r y p t a s e ：a m lb m s c sw e r ei n c u b a t e dw i t hp b s ，t r y p t a s e ，t r y p t a s e p l u sp d t cf o r2 4 h ，t h e nt o t a ln u c l e a rp r o t e i nw e r ee x t r a c t e d e m s am e t h o dw a su s e d t od e t e c tt h ea c t i v a t i o no f n f - r bi na m lb m s c s 7 p a r - 2 ，e r k ，p 3 8 m a p ka n d n f - r d 3 一s p e c i f i c i n h i b i t o r r e s p e c t i v e l y ： f l l s y - n i - 1 2 ( 2 0 0r t m ) ，p d 9 8 0 5 9 ( 2 0v m ) ，s b 2 3 0 5 8 0 ( 1 0p m ) a n dp d t c ( 1 0 0p m ) w e r eu s e dt ot r e a t e da m lb m s c sf o r3 0m i n t h e nt r y p a s ew e r eu s e dt oi n c u b a t ew i t h a m lb m s c s ，a n dr e a lt i m er t - p c rm e t h o dw e r eu s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f v e g f m r n a 8 p a r 一2 ，e r k , p 3 8 m a p ka n dn f - r b s p e c i f i c i n h i b i t o r r e s p e c t i v e l y ： 7 f l l s y - n h 2 ( 2 0 0g m ) ，p d 9 8 0 5 9 ( 2 0u m ) ，s b 2 3 0 5 8 0 ( 1 0g m ) a n dp d t c ( 10 0p m ) w e r eu s e dt ot r e a t e da m lb m s c sf o r3 0m i n t h e nt r y p a s ew e r eu s e dt oi n c u b a t e 谢t h a m lb m s c s ，a n dw e s t e r nb l o tm e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f v e g f 9 s t a t i s t i c a la n a l y s i ss p s s13 0s o f t w a r ew a su s e dt oa n a l y s i ss t a t i s t i c a ld a ：t a t h em e a s u r e m e n td a t aw a si n d i c a t e d 、i t hm e a n4 - s t a n d a r dd e v i a t i o n ，a n do n ew a y a n o v ew a su s e dt o a n a l y s i w i t ht h em e t h o no fl s dp 0 0 5w a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t r e s u i t s 1 t h er e s u l to fe l i s a ，i m m u n o f l u o r e s c e n c e ，r e a lt i m er t - p c ra n d w e s t e r n - b l o ts h o w e dt h a t ，a f t e ra m lb m s c s i n c u b a t i n gw i t ht r y p t a s e ，c o m p a r e dw i t h t h ec o m r o lg r o u p ，v e g fe x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( 尸 o 0 5 ) ，w i t ha d o s e d e p e n d e n tr e l a t i o n s h i pi na c e r t a i nr a n g e 2 t h er e s u l t so fe l i s aa n dr e a lt i m er t - p c rs h o w e dt h a t ，a f t e ra m lb m s c s c u l t u r e dw i t hu 9 37c e l lc u l t u r es u p e m a t a n t ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，v e g f e x p r e s s i o ni na m lb m s c ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 俨 0 0 5 ) ，t h ei n c r e a s e dw a s s i g n i f i c a n t l yr e d u c e db ya n t i b o d yo ft r y p t a s e ( p 0 0 5 ) 3 t h er e s u l to ff l o wc y t o m e t r ya n di m m u n o c y t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a t , t r y p t a s e - s p e c i f i cr e c e p t o rp a r - 2w a se x p r e s s e do na m l b m s c s 4 t h er e s u l t so fw e s t e r nb l o ts h o w e dt h a t ，a f t e ra m lb m s c si n c u b a t e d 晰t h t r y p t a s ef o r4 8 h ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，p h o s p h o r y l a t i o no fe r ka n d p 3 8 m a p kp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d o 0 5 ) ，a n dt h ei n c r e a s i n g w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e db yp d 9 8 0 5 9a n ds b 2 3 0 5 8 0 ( p 0 0 5 ) 5 t h er e s u l t so fe m s as h o w e dt h a t a f t e ra m lb m s c si n c u b a t e dw i t ht r y p t a s e f o r4 8 h ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h ea c t i v a t i o no fn f - r d 3w e r ei n c r e a s e d ，a n d t h ei n c r e a s i n gw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e db yp d t c 伊 0 0 5 ) 6 t h er e s u l t so fr e a lt i m er t - p c ra n dw e s t e r n b l o ts h o w e dt h a ta f t e ra m l b m s c si n c u b a t e dw i t hp a r - 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