（果树学专业论文）葡萄种质资源RAPD分析及亲缘关系研究.pdf

摘要 葡萄在长期的进化和栽培历史中，由于本身的变异、自 然杂交、 栽培环境不 同等形成了不同的品种类型， 使得葡萄的分类鉴定难度加大， 命名混乱。 本试验 以 欧亚、 欧美杂种部分品 种及砧木品种为材料， 应用r a p d 分子标记技术， 对5 3 个葡萄样品的遗传多样性进行了随机扩增多态性 d n a ( r a p d ) 研究，通过 n t s y s p c t . 1 0 e软件对 r a p d的扩增谱带进行分析， 进行葡萄品种的分子鉴定和分类研 究，探讨葡萄品种之间的亲缘关系。其主要的试验结果如下: 1 . 通过采用c t a b , s d s 和高盐低p h 法三种d n a 提取方法提取葡萄幼嫩叶片 d n a ，分别对其进行紫外吸收检测、电泳检测和r a p d 检测，结果表明; 三种方法 d n a完整性好，r a p d扩增带清晰，a 2 6 0 / a 2 8 0的值在 1 . 7 - 2 . 0之间，符合 r a p d 反应的要求，都可用于葡萄基因组d n a 提取。其中以c t a b 法提取的d n a 质量最 好，本试验选用 c t a b 法进行。 2 . 通过对模板d n a 、引物、 t a q d n a 聚合酶、d n t p 和m 犷浓度的优化试验及 对p c r 反应程序的筛选，确定了本研究的适宜反应体系和反应程序。反应体系: 2 5 u 1 反应体系中，含 2 . 5 u 1 i o x b u f f e r ( p h = 8 . 8 ) , 5 0 n g d n a , 0 . 4 u m o 1 / l随机引 物， 2 0 0 u m o 1 / l d n t p ( d a t p , d g t p , d c t p , d t t p ) ，1 u t a q d n a 聚合酶、 2 . o m m m g t 以及纯净水1 5 . 5 u l 。反应程序为:9 4 预变性2 m i n ; 9 4 变性 l m i n ; 3 6 退火 l m i n ; 7 2 延伸 2 m i n ; 3 9 个循环;7 2 c 延伸 5 m i n ; 4 保温。 3 ， 利用对2 8 0 个引物进行筛选所得到的3 3 个引物对5 3 个葡萄样品进行r a p d 分析，扩增片段大小为 3 0 0 - 3 0 0 0 b p ，共检测到 3 2 5 个位点，其中2 7 5 个是多态 位点，多态位点百分比达到 8 4 . 6 % 。平均每个引物获得 9 . 8 5个扩增位点，其中 具有多态性的位点为 8 . 3 3个。各品种间多态位点百分比变化范围为 5 8 . 3 - 1 0 0 . 0 % ，其中多态位点百分比最高的是引物 s 6 0 , 5 5 1 4 , s 1 3 9 9 , s 1 4 7 8 , 3 2 1 2 2 , s 5 1 0 , s 1 4 6 8 , s 6 和5 2 8 4 ， 最低的是引 物5 2 1 6 。 这说明了本试验所用的 5 3 份材料的遗传多样性很高。 4 . 通过对两个同名高妻及其亲本的遗传距离和指纹图谱分析， 并结合形态学 分析， 从分子水平上对其两个品种进行区分， 从而为纠正目 前品种命名杂乱的现 状提供依据。 5 . 利用 r a p d 技术对 5 3 份葡萄材料进行分类研究， 通过聚类分析， 估算遗传 距离， 建立树状图; 利用分子手段对葡萄遗传变异和亲缘关系进行研究， 为葡萄 遗传多样性的保护以及保护策略的制定提供了科学的依据， 也为葡萄育种提供了 一个有价值的参考，同时在果树遗传理论研究与育种相结合上作了有益的探索。 关键词:葡萄种质资源r a p d亲缘关系 ab s t r a c t o w i n g o f t h e v a r i a t i o n w i t h i n t h e s p e c i e s ,e a s i l y n a t u r e c r o s s b e t w e e n s p e c i e s a n d w id e g e n e r a t i o n ,d i f f e r e p t p l a n t i n g e n v ir o n m e n t i n t h e w o r l d ,m a n y s p e c i e s p o p u l a t i o n s a n d v a r i e t y .g r o u p s o f g r a p e ( v it is ) h a v e b e e n f o r m i n g in t h e lo n g h i s t o r y o f g r a p e e v o l u t i o n a n d c u lt u r i n g , w h i c h m a k e t a x o n o m y a n d i d e n t i f i c a t i o n o f g r a p e s d i ff i c u l t a n d n a m i n g c o n f u s i n g .t h e s t u d y w a s u n d e r t a k e n t o i d e n t i f y g r a p e ( v i t i s ) m a t e r i a l o f s e v e r a l g r a p e s o f vv i n if e r a l . a n d v . 1 a b r u s c a l . a n d r o o t s t o c k b y r ap d . t h i s p a p e r m a i n l y s t u d i e s t h e g e n e t i c d i v e r s i t y o f 5 3 s e r i e s g r a p e s o n r a p d . t h e a i m o f t h e s t u d i e s o n t h e a m p l i f i c a t i o n p a tt e r n s o f r a p d g o t b y n t s y s p c 2 . l 0 e i s t o i d e n t i f i c a t e a n d t a x o n o m y g r a p e ,s t u d y l i n k a g e d i s t a n c e .t h e m a i n r e s u l t s a s b e l o w : 1 .t h e m e t h o d s - c t a b m e t h o d , s d s m e t h o d , a n d h i g h s a l i n i t y a n d l o w p h m e t h o d w e r e u s e d t o e x t r a c t g e n o m i c d n a fr o m l e a v e s o f g r a p e .t h e d n a s a m p l e s o f t h e t h r e e m e t h o d s w e r e t e s t e d b y s p e c t r o p h o t o m e t e r ,a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s a n d r a p d . t h e r e s u l t w a s t h a t t h e d n a i n t e g r a l i t y e x t r a c t w i t h t h e t h r e e m e t h o d s w a s g o o d ,t h e d n a t r a p w a s d i s t in c t ,t h e n u m b e r o f a 2 6 0 / a 2 8 0 l i e d b e t w e e n 1 .7 a n d 2 .0 ,t h e d n a c o u l d c o n f o r m t o t h e r e q u e s t , w h i c h c o u l d b e u s e d f o r e x t r a c t i n g g e n o m i c d n a f r o m l e a v e s o f g r a p e ,a n d t h a t t h e c t a b m e t h o d w a s t h e b e s t o n e s t h r o u g h w h ic h t h e p r o d u c t i o n h a d t h e h i g h e s t p t u i t y . s o ,w e c h o s e c t a b m e t h o d t o c o n d u c t f o l lo w in g e x p e r i m e n t s . 2 . t h e d i ff e r e n t p c r p r o g r a m a n d t h e i n g r e d i e n t s i n r a p d r e a t i o n s y s t e m s u c h a s d n a a n d p r i m e r ,t a q d n a p o l y m e r a s e , d n t p ,m 广， w e r e s c e e n e d b y d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n s , s u i t a b l e r e a c t i o n s y s t e m a n d p r o g r a m o f t h e r a p d f o r g r a p e g e n o m i c d na wa s s e t t l e d . t h e v o lu m n o f a m p l i f i e d r e a t i o n w a s 2 5 u 1 , c o n t a i n i n g l 0 x b u ff e r ( p h = 8 . 8 ) 2 . 5 u 1 , g e n o m i c d n a 5 0 n g , 0 .4 u m o 1 / l p r i m e r , 2 0 0 u m o l / l d n t p , l u t a q d n a p o l y r a s e . 2 . o m m m g z , a n d p u r e w a t e r 1 5 . s u l .t h e r e a c t i o n p r o g r a m w a s d e v i s e d f o r 3 9 c y c l e s ,e a c h w i t h 9 4 c d e n a t u r a t io n f o r 1 m i n , 3 6 0c a n n e a l i n g f o r 1 m i n ,7 2 0c e x t e n s i o n f o r 2 m i n , a n d 9 4 0c p r e d e n a t u r e f o r 2 m i n in t h e f o r m e r d e n a t u r e a n d 7 2 0c p o s t e x t e n s i o n f o r 5 m i n i n t h e f i n a l e x t e n s i o n . 3 . 3 3 p r i m e r s w h i c h a r e t h e b e t t e r o f 2 8 0 p r i m e r s a n a l y z e t h e g e n e t i c d i v e r s i t y o f 5 3 s e r i e s g r a p e s u s i n g i n t h e e x p e r i m e n t a r e u s e d t o r ap d ma r k e r s . a t o t a l o f 2 8 0 d n a f r a g m e n t s w e r e a m p l i f i e d f r o m 3 0 0 帅- 3 0 0 0 b p 3 2 5 l o c i a r e d e t e c t e d i n t o t a l , a m o n g w h i c h t h e r e a r e 2 7 5 p o l y m o r p h i c l o c i . t h e p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i c l o c i i s 8 4 . 6 %. t h e a v e r a g e n u m b e r d n a b a n d s p r o d u c e d b y e a c h p r i m e r w a s 9 . 8 5 a n d t h e a t o f p o l y m o r p h i c l o c i w a s 8 .3 3 .t h e p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i c l o c i a m o n g d i ff e r e n t g r a p e s v a r i e s fr o m 5 8 .3 % t o 1 0 0 .0 %. t h e p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i c l o c i o f p r i m e r s i n c lu d i n g s 6 0 , s 5 1 4 . 5 1 3 9 9 , 5 1 4 7 8 , 5 2 1 2 2 , 5 5 1 0 , 5 1 4 6 8 , s 6 a n d s 2 8 4 i s t h e h i g h e s t , a n d t h a t o f s 2 1 6 i s t h e l o w e s t .t h o s e a b o v e r e s u lt s s h o w e d t h a t t h e g e n e t i c d i v e r s i t y o f 5 3 a c c e s s i o n s w a s h i g h . 4 .a c c o r d i n g t o t h e s t u d y o f l i n k a g e d i s t a n c e a n d f i n g e r p r i n t i n g o f t h e t w o g r a p e v i n e w h i c h w e r e n a m e d t a k a t s u m a a n d i t s p a r e n t s , w i t h t h e s t u d y o n t h e m o r p h o l o g y , t h e t w o g r a p e v i n e w e r e i n d e n t i f i e d o n t h e m o l e c u l e l e v e l ,w h i c h a ff o r d a c c o r d a n c e t o a d a p t t h e d i s o r d e r s it u a t i o n o f t h e g r a p e v i n e n a m i n g n o w d a y . 5 .r a p d t e c h n i q u e c a n b e u s e d i n t h e s t u d i e s o n c l a s s i f i c a t i o n o f 5 3 g r a p e c u l t i v a r s ,t h e e v a l u a t i o n o f g e n e t i c d i s t a n c e a n d c o n s t r u c t i n g d e n d r o g r a m b y c l u s t e r a n a l y s i s .t h i s s t u d y w i l l p r o v i d e s c i e n t i f i c e v i d e n c e f o r e s t a b l i s h i n g t h e p r e s e r v a t i o n s t r a t e g y a n d p r o t e c t i n g o f t h e g e n e t i c d iv e r s i t y o f g r a p e . i t w i l l g i v e u s e f u l h e lp t o g r a p e b r e e d i n g a n d g i v e a b e n e f i c i a l r e s e a r c h o n t h e c o m b i n a t i o n o f t h e s t u d i e s o f g e n e t i c t h e o r y a n d b r e e d i n g o n f u i t t r e e k e y wo r d : g r a p e ( r t is ) g e r m p l a s m r e s o u r c e s r a p d p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p 本 文缩 略词表 缩略词 p cr rap d rf l p af l p s car s s r s ts vnt r b s a r na s e k b m m c t ab s ds p vp edt a eb o. d. t r i s dna d nt p c m up gma i p gr i bme s np 中文名 聚合酶链式反应 随 机扩增多态性d n a 限制性片段长度多态性 扩增片段长度多态性 序列特异扩增区域 简单重复序列 序列目标位点 可变数目串联重复 集群分离 核糖核酸酶 千碱基对 分钟 十六烷基三甲澳化钱 十二烷基磺酸钠 聚乙烯毗咯烷酮 碱基对 t r i s / e d t a缓冲液 乙二钱四乙酸 澳化乙锭 光密度 三轻甲基氨基乙烷 脱氧核糖核酸 脱氧核昔三磷酸 厘摩 类平均法聚类分析 国际植物遗传资源研究所 p 一 琉基乙醇 单核昔酸多态性 英文名 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a r e s t r ic t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m a m p l i f i e d f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e d a m p l i f i e d r e g i o n s s i m p l e - s e q u e n c e r e p e a t s e q u e n c e t a r g e t s i t e v a r i a b l e n u m b e r o f t a n d e m r e p e a t b u l k e d s e g r e g a n t a n a l y s i s r i b o n u c l e a s e k i l p o b a s e p a i r mi nu t e c e t y l t r i m e t h y a m m o n i u m b r o m i d e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e b as e p a i r s t r i s / e d t a b u f f e r e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d e t h i d i u m b r o mi d e o p t i c a l d e n t it y t r i s ( h y d r o x y m e t h y l) a m i n o - m e t h a n e d e o x y n u c l e o s i d e a c i d d e o x y n u c l e t i d e t r i p h o s p h a t e c e n t i mo r g a n s u n w e i g h t e d p a i r - g r o u p a v e r a g e i n t e rna t i o n a l p l a n t ge n e t i c r e s o u r c e s p - me r c a p t o e t h a n o l s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m bpte 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究上作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致日 的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 煮冱 时间：0 川年暑月i 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有机 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以崩_ 彳、同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 搿座砼 锄撤7 时间；0 年f 月，同 时问：加删r 年占月口日 1 前言 柑橘、 葡萄、 香蕉和苹果号称世界四大水果，目 前葡萄的栽培面积及产量仅 次于柑橘，而我国也是主栽葡萄国之一 1 1 葡萄属于葡萄科 ( vi t a c e a e l i n d l . ) 葡萄属( vi t is l ) 植物，其属有7 0 多个种 ( 我国就有3 5 种) ， 品种约有 1 4 0 0 0 个， 其中直接或间接与目前栽培有关者不过 约2 0 多个种， 其它都处于野生状态或作观赏之用2 1 0 2 0 余个栽培种分属于欧亚 种群、 东亚种群和美洲种群，且欧亚种群栽培最广，品种最多、产量最甚; 其品 质优良， 座果率高， 但抗寒性和抗病力差， 生长季节遇高温多雨的天气， 极易感 病 3 ,4 1 ; 用于食用和加工的 优良 品 种多 是这一种群。 东亚种群种类最为丰富， 约 有4 0 多种，但利用范围大多处于野生和半野生状态，主要用于酿酒和作抗寒砧 木或育种亲本: 我国野生葡萄属于东亚种群， 全国除新强和青海等地目 前未发现 有野生葡萄外， 其它各省均有野生葡萄分布。 它们的形态变异丰富多彩， 存在广 泛的抗性，一些经济性状也是其它种群所没有的。在5 0 年代初期，我国的科学 工作者利用山葡萄与欧洲葡萄进行杂交， 获得了一批抗性较强的优良品种， 并在 生产中得到了大面积的推广。美洲种群约2 8 3 0 种，其抗病和抗寒性均强，也 较抗旱，比欧亚种易栽培，主要用作杂交亲本或砧木: 但其纯种品质差，且伴有 “ 狐臭” 味，产品多用于制汁与酿酒， 用于鲜食的多是欧美杂交种( 5 1 葡萄品种繁多， 且主要采用无性繁殖， 不同地域间品种交流频繁， 新老品种 数量繁多， 导致同 名异物和同 物异名 现象十分普 遍6 - 1 0 1 。 主要表 现在: 第一， 种 类数目 不清; 第二， 种名混乱。由于葡萄种内 变异很大， 加上种间的自 然杂交以 及世界范围内对葡萄的广泛繁殖， 往往产生一些中间型或过渡型杂种， 给葡萄属 植物的分类鉴定带来困难， 因为仅仅从其外观特征或者生长习性， 某一个品种可 能具有某几个种或属的特性。 因而， 很难按一般的分类方法将其分类， 这些不仅 给育种带来了困 难， 也造成一定的经济损失i 一 ， 3 1 。 在已 有的报道中， 采用了 鉴定 叶结构、叶表皮细胞形状、 种子体积、种子油的脂肪酸组成、浆果花青素、芳香 物的成份、 不同器官酶带和蛋白 质类型以及数量分析法等， 但至今尚无一个通用 的高效简便的鉴定方法。 目前， 在育种方面， 传统的育种方法已不能满足生产与消费的要求， 分子生 物学理论和技术的飞速发展为葡萄育种， 尤其是无核葡萄育种效率的提高带来了 契 机， 己 有许多学者在这一方面取得了 进展 1 4 - 1 5 1 。 特别是近儿年来， 随着分子克 隆和重组脱氧核糖核酸技术的完善，诞生了一类重要的遗传标记 分子标记， 在植物研究上产生了巨 大的 影响 1 6 . 1 8 1 .目 前， 大量的 分子标记用于基因组分析 19 基因 定 位与 克 隆 (2 0 -2 4 1 、 品 种 鉴 定 2 5 ,2 6 1 、 外 源 基因 导 入(2 7 等 方 面。目 前 应 用 较广的分子标记 技术主要有r f l p , r a p d , a f l p , s c a r , s s r , s t s 等(2 8 -2 9 1 技术。r f l p分析是一项综合技术，但由于技术操作复杂，需要较全面的基因操 作技术， 而且成本高、耗时耗力、 所需d n a量较多2 5 ,3 0 .3 1 1需要用同 位素进行 标 记， 这 些 都限 制了r f l p 技 术的 使 用 和 推 广 10 。 而r a p d ( r a n d o m ly a m p l if ie d p o ly m o r p h ic d n a ， 即 随 机 扩 增 多 态 性d n a ) 3 2 分 析 是 建 立 在p c r ( p o ly m e r a s e c h a in r e a c t io n ) 3 3 1 基 础上的 一 种 可 对整 个 未知 序列的 基因 组 进 行多 态 性分 析的 d n a分子标记技术。 r a p d技术自w i l l ia m s 3 4 1和w e ls h 3 5 1 等首创以来， 在葡萄种 质资 源 遗 传多 样 性分 析3 6 3 7 1 目 的 性 状 墓因 标记 和定 位 17 13 8 1 、 遗 传连 锁图 谱的 构 建3 9 1 等方面得到了 广泛的 应用。 r a p d标记继承了p c r的 优点，具有样品用量 少( 通 常1 5 - 2 5 n g ) 、 灵 敏度 高、 特异 性 强和 检 测 容 易的 特点 4 0 ,4 11 ， 可以 对没 有 进 行任何分子生物学研究的物种进行d n a多态性分析，不具有种属特异性，无需 进行克隆、制备探针、 分子杂交等工作，而且此技术简单易行、分析自 动化， 具 有简便迅速、高效和实验成本低等优点 p o t 。 并 且其多态性强， 不需要放射性同 位素示踪， 因而被广泛应用于基因定位和物种多样性等研究中， 几乎所有重要的 果树和品种鉴定都用此技术1 4 1 1 。 所以， 利用分子标记技术为葡萄品种鉴定和亲 缘关系的研究提供了有利手段， 比 传统方法更能反映品种的遗传多样性， 在理论 和实践上都具有重大意义4 2 1 1 . 1 遗传多样性的研究 1 . 1 . 1 遗传多样性的涵义 广义的遗传多样性沙n e t i c d i v e r s i ty ) 是指生物界中所有遗传变异的总和， 但 狭义的遗传多样性是指种内的遗传多样性， 即种内 基因的变化， 包括种内显著不 同的居群间和同一居群内的遗传变异的总和，亦即基因多样性。在一般情况下， 遗传多样性的概念是指狭义的范围和内容。 种内的多样性是物种以上各水平多样 性的最重要来源。 首先， 每个物种是由许多个体组成的，在群体遗传学中， 现代 生物学意义上的物种也是由许多地理或生态群体组成， 这些群体显示了丰富的遗 传变异。 它是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定因素， 其遗传变异程度也 决定该物种进化的潜势。 种内的遗传变异， 即遗传学中所称的多态性， 它不仅包 括变异水平的高低， 也包括变异的分布格局， 即种群的遗传结构， 它表现在生物 的不同组织水平。 首先是外部形态， 其次是染色体水平。一个物种的核型特征即 染色体数目、 形态及行为的稳定是相对的， 种内染色体的多态性是广泛存在的现 象。 居群内变异又称为个体变异，影响因素有环境饰变、 遗传重组和突变。 对于 不同个体而言， 这三种因素的作用方式和作用程度不尽相同， 三者之间相互影响 的程度也不一样，使得种内或居群内变异复杂。 1 . 1 . 2 遗传多样性研究的意义 遗传多样性是生物多样性的生物组成部分， 是长期适应与进化的结果， 也是 农业生 产的前 提和人类生存发展的 物质基础4 3 1 。 特别是 在全球气候 变暖的 今 天， 不同自 然区域的环境和农业都可能产生预料不到的变化。 因此， 保护遗传多样性， 为培育新的不同特性的品种提供基本材料， 是自 然保护和农业综合发展的一项重 要任务。另外，由于定向培育和与本地品种及其野生亲缘种间缺乏基因流动， 它 们的遗传背景越来越狭窄，使新品种培育和抵御病虫害等方面都有较大的弊端 四。因而深入地利用各种方法特别是现代分子生物学技术来研究作物遗传多样 ,胜，使作物改良更加有目的地进行，具有重要的理论意义和实际意义。 1 . 1 . 3 选传多样性研究的方法 作物遗传多样性研究主要是通过一些遗传标记 进行作物种质资源的遗传多 样性检测。目前， 遗传标记主要有四大类:即形态学标记、细胞学标记、生化标 记和分子标记。 形态学标记主要指一些可以观察到的性状， 如种皮颜色、 株高等; 细胞学标记主要包括核型分析、 染色体分带和原位杂交技术、 利用非整倍体材料 进行遗传操作进而基因定位等; 生化标记主要是同工酶及蛋白质标记， 同工酶技 术在揭示基因位点变异方面有其突出的优点， 它是蛋白质水平上的遗传多样性检 测方法， 是基因生化表现型， 是机体的天然标记， 可以反映出生长发育过程中基 因表达的情况， 已 被广泛用于种质分类、 估算遗传多样性和鉴定品种间的亲缘关 系等;分子标记技术则从d n a分子水平检测物种的遗产多样性，更为直接、有 效，是目前最为普遍采用的方法。 近十几年来，已有 1 0多种分子标记 相继出现，主要包括:限制性片段长度 多 态 性 ( r e s t r ic t io n f r a g e m e n t l e n g t h p o ly m o rp h is m ， 即r f l p 尹 5 ; 建 立 在 聚 合 酶 链式反应( p o ly m e r a s e c h a i n r e a c t io n , p c r ) 基础上的随机扩增的多态性 d n a ( r a n d o m ly a m p l if ie d p o ly m o r p h ic d n a ， 即r a p d ) 4 6 1 ; 扩 增片 段 长 度 多 态 性 ( a m p l ifi e d f r a g m e n t l e n g t h p o ly m o rp h is m，即 a f l p ) 14 1 1 ;简单重复序列 ( s im p l e - s e q u e n c e r e p e a t ， 即s s r ) 4 8 1 ; 序 列 特 异 扩 增 区 域( s e q u e n c e c h a r a c te r iz e d a m p l ifi e d r e g io n s ， 即s c a r ) 4 9 1 ; 小 卫 星d n a ( m in is a t e l l i t e d n a ) 等 等。 其中r a p d 和a f l p 常用于植物遗传多样性检测5 0 1 . 2 葡萄种质资源及其遗传多样性研究 1 . 2 . 1 葡萄种质资源的分类研究 葡萄科( v i t a c e a e l i n d l 或a m p e l i d e a e k u n t h ) 有1 4 属， 约有9 6 8 种。 1 9 9 0 年中国李朝变又命名一个愈藤属 ( y u a c . l i d. 据c i .a l l e w e l d t 等统计， 葡萄属 中己明确起源地的种有6 5 个， 起源地不太明确或有争议的种有4 4 个， 分属于圆 叶葡萄亚属( m u s c a d i n i a p l a n c k ) 和真葡萄亚属( e u v i t i s p l a n c h . ) , 前者含圆叶葡萄、 鸟葡萄和一个有争议的墨西哥葡萄。真葡萄亚属一 般认为有7 0 余种，有人认为 有6 3 种和4 3 个争议种6 1 。通常按原产地划分为三个种群:欧亚种群 ( 1 个种) ， 东亚 种群 3 1 个种和若干个争议种) 和北美种群( 3 1 个种和若干个争议 种) 5 1 1 关于真葡萄亚属不同种群内包含的物种数， 各家报道颇有出入， 除了发现新种以 外， 还由于植物学家、 果树学家们对什么是真正的种及杂种类型的看法不完全一 致， 缺乏明确的标准，造成种的归类因人而异。到目前为止，有p l a c h o n 分类体 系( 1 8 7 5 ) , m u n s o n 分类体系、 r a v a z 分类体系( 1 9 0 9 ) , d e - l a t t i n 分类体系( 1 9 3 9 ) , v i a l a 分类体系( 1 9 0 1 - 1 9 1 0 ) , h e d r i c k 分类体系( 1 9 0 8 ) 和b a i l e y 分类体系( 1 9 3 4 ) 等。 总的来说各种分类体系大同小异， 而且似乎和亲缘系统的远近没有太大关系。 因此， 葡萄属， 特别是真葡萄亚属内种的分类主要还是按重要的形态解剖性状进 行检索分类的5 2 - 5 3 1 1 . 2 . 2 菊萄遗传多样性 葡萄属植物染色体小，减数分裂时真葡萄亚属有规律地形成 1 9个二阶体 ( 2 n = 2 x = 3 8 ) ，而圆叶葡萄亚属则形成2 0 个二阶体 ( 2 n = 2 x = 4 0 ) 。亚属内种间杂 交未发现不亲和、 杂种发育障碍和细胞学行为的不正常， 亚属间杂交则有明显的 交配不亲和。亚属以内的种通常仅根据形态和分布及适应性方面的差异分类的， 因而不少人认为， 亚属内的很多种应该是生态种， 而不是真正的植物学种， 如真 葡萄亚属内种间人工杂交非常容易， 且不同种的染色体组型差异很小， 除了少数 落后染色体外，减数分裂一般正常。 u .p .h e d r ic k 研究了 美国1 4 0 0 个葡萄品种，其中 种间杂交起源的约占7 3 %; 种间杂交品种中， 欧洲葡萄或美洲葡萄杂交的占4 2 %， 有欧洲葡萄或美洲葡萄作 为亲本之一的约占 9 3 %，美洲葡萄以外的其它北美种作为亲本之一的合计约占 8 2 %，其中占比重较大的有夏葡萄、林西氏葡萄、 河岸葡萄、 沙地葡萄和山平氏 葡萄，分别占3 9 .3 %, 1 7 .0 %, 1 5 .8 %, 5 .9 % 和 1 .0 %，大体上反映了不同野生资 源在葡萄抗性育种中的相对重要性。 高 爱 农 5 4 运 用r a p d标 记 研究了2 0 个 葡 萄品 种和2 2 个中国 野生 葡萄 种， 得到了种和品种间的遗传距离系数矩阵和聚类分析图， 探讨了各个种间和品种间 的亲缘关系。 研究表明，大复叶、小复叶和麦黄小复叶等在d n a指纹上 差别很 大，可考虑列为单独的种;葵莫葡萄和华北葡萄在d n a指纹上也是有差别的， 也 可以 作为独立的种处理。 曹辉庆5 5 1 利用聚丙 烯酞肢凝胶电 泳技术 对3 1 个葡萄 品种 ( 或杂种)进行了过氧化物酶同工酶分析，并就其中 1 1 个葡萄品种 ( 或杂 种)进行了r a p d分析，同时以形态标记辅助分析，得到了1 1 个葡萄品种的过 氧化物酶酶谱聚类图， 探讨了 其遗传距离的远近。 1 . 3 r a p d 分子标记研究 1 . 3 . 1 r a p d 分子标记的原理 r a p d ( r a n d o m a m p l i f ie d p o ly m o r p h i c d n a ) 是 指随 机 扩增多 态 性d n a , 它以一个 1 0碱基的任意序列的寡核普酸片段为引物在未知序列的基因组 d n a 上 进行随机 p c r扩增5 6 . 5 7 1 。它是一种新的d n a分析技术，由 美国wi l l i a m s 和 w e l s h 3 5 于1 9 9 0 年分别提出， 它是建立在p c r ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) 基 础上的一种可对整个未知序列的 基因组进行多态性分析 d n a分子标记 技术5 fl 它以样品d n a 为模板， 以一个人工合成的随机寡核昔酸序列 ( 通常 1 0 个碱基对) 为引物， 通过对所研究的基因组 d n a 进行 p c r 扩增反应，电泳分离， 然后通过琼 脂糖凝胶电泳分离后，经e b 染色后紫外凝胶成像系统来检测其扩增产物 d n a 片 段的多态性，这些扩增产物 d n a片段的多态性即反映了基因组相应区域的 d n a 多态性5 9 .6 1 1 r a p d 是用短的随机序列 d n a作为引物对基因组 d n a进行 p c r 扩增而产生的 多态性d n a 片段， 所用的一系列引物d n a 序列各不相同， 但对于任一特定的引物， 它同基因组d n a 序列有其特定的结合位点。 一个单引物与基因组d n a 混合， 在耐 热d n a 聚合 酶和合适的 缓冲系统存在下进行 经典的p c r 热循环 6 2 1 。 模板在9 2 - 9 4 变性解链后，在足够低的温度 ( 3 5 - 3 7 0c)下，根据碱基互补原则，单个引物 退火到基因组d n a 模板两条反向链的不同位置上， 在有足够的d n a 聚合酶活性条 件下， d n t p 从引物的3 端掺入， 接上与模板d n a 互补的各种单核普酸， 延伸到 一定长度得到一段新的互补d n a 链【6 3 1 . 在基因组上， 某一引物可能会与单链d n a 的多个位点互补结合， 但只有这些引物的位置是在彼此可扩增的距离内( 引物间 距为2 0 0 - 2 0 0 0 b p ) ， 一组不连续的分子量为2 0 0 - 2 0 0 0 b p 的d n a 片段就会通过p c r 产生。 因此， 如果基因组在这些区域发生d n a 片段插入、 缺失或碱基突变就可能 导致这些特定结合位点分布发生相应变化， 而使p c r 产物增加、 缺少或发生分子 量的改变而产生多态。 通过 p c r 产物的检测即可检测出基因组 d n a 在这些区域的 多态性。由于进行 r a p d 分析时可用引物里很大，虽然对每一个引物而言其检# i 基因d n a多态性的区域是有限的， 但是利用一系列引物则可使检测区域几乎覆盖 整个基因组，因此， r a p d 可以 对整个基因组d n a 进行多态性检测6 4 1 1 . 3 . 2 r a p d 分子标记的特点 1 . 3 . 2 . 1 r a p d 分子标记的优点 1 . 3 . 2 . 1 . 1 在材料方面具有优点r a p d标记以其作为d n a水平上的标记， 取材广泛， 不受季节和组织器官发育时期的限制对时间特异性、 组织特异性要求 不高， 不随组织或发育阶段而异， 从植物体任何部位提取的d n a均可用于分析， 而优于其它的形态标记， 细胞学标记和蛋白 质标记【6 5 1 1 . 3 . 2 . 1 . 2在模板方面具有优点r a p d分子标记 在模板方面的优点主要有: 川 r a p d分析只需少量模板，一次反 应仅需2 0 - 1 o o n g ， 这对于d n a量很少 的材料进行基因组分析有利，比如对花粉粒、原生质体、种子等的d n a分析是 切实 可 行的 16 6 1 ; ( 2 ) 可供r a p d 检 测的d n a 标记位点 数量多 16 1 1 ; ( 3 ) 对模 板的 质 量 要求不是 很高 16 8 1 ; ( 4 ) r a p d标记可以 覆盖 整个基因 组， 包括编码区 和非编 码 区，可以反映整个基因组的变化。 1 . 3 . 2 . 1 . 3 在引物方面具有优点r a p d分子标记 在引物上所具有的优点有: ( 1 ) r a p d由于其引物为人工定序合成的， 没有严格的种属界限，同一套引物 可应用于任何一种植物的研究， 并且这些引物对任何基因组研究是通用的， 其有 广泛性和通用性， 不需要建立文库或筛选探针;因此， 适合于大规模生产和