（特种经济动物饲养专业论文）家蚕性别决定途径上游关键基因的鉴定与功能研究.pdf

摘要 家蚕性别决定途径上游关键基因的鉴定与功 能研究 特种经济动物饲养专业博士研究生王子龙 指导教师夏庆友教授 何宁佳教授 摘要 家蚕性别决定既是基本的生物学问题，也与蚕丝产业密切相关，长期以来受到人们的高 度关注。家蚕为雌杂合型，经典遗传学研究表明在w 染色体上的一个强雌性决定因子( f e r n ) 决 定个体为雌性，但是到目前为止f e m 还没有被鉴定出来。2 0 0 1 年o h b a y a s h i 等克隆了果蝇性别 决定级联末端基因d s x 在家蚕中的同源体b m d s x ，发现其与果蝇d s x 相似：b m d s x 的初级转录物 在雌性和雄性中也是通过选择性拼接产生性别特异性成熟m r n a 来控制家蚕性别的末端分化。 但是b m d s x 基因前体m r n a 选择性拼接的调控机制与果蝇d s x 不同，果蝇中默认的拼接方式为雄 特异性的，在雌性中t r a t r a 2 激活了雌特异性拼接，而家蚕中b m d s x 默认的拼接方式为雌特 异性的，在雄性中由于受到某一阻遏机制的作用使得b m d s x 前体m r n a 的第3 和第4 j - 显子的拼 接受到抑制。遗憾的是，到目前为止对于从上游的f e m 到下游b m d s x 之间的性别调控途径仍然 不清楚。为了弄清家蚕b m d s x 之上的性别调控途径，本文首先利用基因芯片分析了早期胚胎雌 雄差异表达基因，其次通过蛋白与r n a 结合及质谱对调控砌缸拼接的因子进行了鉴定，并对 可能的f e m 候选基因进行了克隆及转基因研究。获得的主要结果如下： 1 基于基因芯片的家蚕早期胚胎雌雄差异表达基因分析 家蚕的性别决定于胚胎发育的早期，理论上，参与家蚕性别决定的基因在胚胎发育的早 期应该有雌雄表达上的差异。为了寻找参与家蚕性别决定的基因，我们利用基因芯片来寻找 在早期胚胎有雌雄表达差异的基因。以胚胎期根据卵色就能分开雌雄的限性白卵品种为材料， 取受精后4 8 小时、6 0 小时、7 2 小时、9 6 小时4 个时间点的雌雄胚胎，以受精后4 小时胚胎 为对照进行芯片杂交。其结果，共筛选出4 0 4 9 个至少在一个时间点有雌雄表达差异的基因。 g o 分类表明，这些基因的功能主要为催化功能，核酸结合，蛋白结合以及转录调控功能， 参与代谢过程，发育过程，生物过程的调控以及色素形成。其中有2 4 3 2 个差异表达基因是由 于受精后合子基因在雌雄中的转录差异而造成的。1 0 6 2 个基因是由于母体转录物在雌雄中降 解程度的不同而导致的差异。以受精后4 小时为参照，分析发现，在受精后4 8 小时、6 0 小 两南大学博十学位论文 时、7 2 小时和9 6 小时，每一个时间点相对于受精后4 小时上调表达的基因总比下调表达的 基因数目多，这说明早期胚胎雌雄之间的差异更多的是由于合子基因在雌雄中转录水平的差 异而造成的。将这些相对于受精后4 小时上调表达的雌雄差异表达基因进行聚类，发现这些 基因在雌雄中的表达模式不同，在雌性中的4 8 小时形成一个峰，表达量从4 8 小时到7 2 小时 逐渐下降，到9 6 小时又上升；而在雄性中绝大多数基因是从4 8 小时到7 2 小时逐渐上升，到 9 6 小时又下降。这可能与胚胎发育的早期雌雄蚕卵的着色不同有关。 综合分析结果，找到了8 1 个在一个以上的时间点有雌雄表达差异的选择性剪接体，占所 有选择性剪接体的2 1 8 ，这些剪接体属于4 3 个基因。它们主要为具有催化活性的各种酶类 和具有结合蛋白或核酸功能的蛋白。此外，分析还发现了1 7 个具有雌雄表达差异的前体 m r n a 拼接因子。其中有4 个h n r n p 蛋白，4 个s n r n p 蛋白，以及其它的r n a 结合蛋白。 2 b m s x l 及b m r b p l 的功能研究 s x l 是果蝇性别决定调控级联中的一个关键基因，以前的研究者克隆了b m s x l 的两种拼接 形式b m s x l - p a 和b m s x l - p b ，发现b m s x l - p b 在精巢特异表达。在果蝇中，s x l 通过结合到拼 接位点附近的一串富含尿嘧啶的p o l y ( u ) 序列上阻遏该位点的拼接，从而调控下游基因t r a 的 性别特异性拼接，而在家蚕b m d s x 的第3 内含子的3 拼接位点处刚好有一串富含尿嘧啶的 p o l y ( u ) 序列，那么b m s x l p b 是否结合到这一段序列上阻遏了b m d s x 第3 和第4 外显子在 雄性中的拼接? b m s x l p b 是不是b m d s x 上游的关键性调控因子? 为了弄清这两个问题，本研究通过p o l y o d ) 序列与雌性和雄性核抽提物的g e l - s h i f t 实验， 结果表明，b m s x l p b 并没有结合到b m d s x 的第3 内含子的37 拼接位点处的p o l y ( u ) 序列上。 同时以限性白卵品种为材料，通过r t - p c r 检测表明b m s x l - p b 在雌雄胚胎中表达量及其微弱， 并且没有雌雄表达差异。这些结果说明b m s x l p b 并不是调控b m d s x 前体m r n a 雄特异性 拼接的的关键性拼接阻遏因子。 r b p l 是参与果蝇性别决定基因d s x 前体m r n a 选择性拼接的重要拼接因子。本研究克 隆了咖j 在家蚕中的同源体b m r b p l 基因。发现b m r b p l 前体m r n a 通过选择性拼接产生四 种成熟m r n a ，分别命名为b m r b p l - p a ，b m r b p l - p b ，b m r b p l - p c 和b m r b p l - p d ，分别编码 1 4 2a a ，1 5 9a a ，9 1a a 和1 1 7a a 。其中b m r b p l p a 和b m r b p l p d 具有一个n 末端r r m 结 构域和一个c 末端r s 结构域，而b m r b p l p b 和b m r b p l p c 只具有一个n 末端r r m 结 构域。氨基酸序列比对表明b m r b p i p a 与在其它昆虫中的同源体保守性很高，并与其它s r 家族蛋白在r r m 结构域高度保守。r t - p c r 结果表明b m r b p l - p a 在所检测的不同组织和各个 发育时期均有高量表达，b m r b p j 椰在所检测的这些组织和时期表达很弱，并且b m r b p l - p a 和b m r b p l - p b 在雌雄中无明显的表达差异，而b m r b p l - p c 和b m r b p l - p d 则很难检测到。 这些结果表明b m r b p i 应该是一个s r 类拼接因子，但是否参与家蚕b m d s x 前体m r n a 的 性别特异性拼接还需要进一步研究。 3 b m d s x 上游的拼接调控因子b m h r p 2 8 的鉴定 n 摘要 s u z u k i 等的研究表明b m d s x 第4 外显子对b m d s x 前体m r n a 的雄特异性拼接起着决定 性的作用，并且在该外显子上存在3 个关键性的顺式调控元件，发现b m p s i 能够结合到顺式 调控元件c e i 上调控b m d s x 的拼接。为了寻找其它调控b m d s x 雄特异性拼接的因子，我们 在b m d s x 第4 外显子上共设计了5 个r n a 探针做u vc r o s s l i n k i n g 及g e l s h i f t 实验，发现有 核蛋白结合在探针c e i + 6 上，u vc r o s s 1 i n k i n g 实验表明结合的蛋白大约为2 8k d ，将结合的 蛋白带从胶上切下，通过l c m s m s 对结合的蛋白进行鉴定，根据质谱鉴定的结果克隆出该 基因完整的编码区，结果表明该基因编码2 5 6a a ，为果蝇核糖核蛋白h r p 4 8 在家蚕中的同源 体，命名为b m h r p 2 8 ，大小为2 8 2k d ，在n 端含有两个r r m 结构域，c 端含有一个甘氨 酸富集结构域。氨基酸序列比对表明b m h r p 2 8 与哺乳动物中的h i l 鼢咿a l 以及果蝇n r p n 8 在r r m 结构域高度保守。将b m h r p 2 8 基因编码区用p e t 5 0 b 载体进行原核表达并进行纯化， g e l s h i f t 和u vc r o s s 1 i n k i n g 实验表明纯化的b m h r p 2 8 蛋白能够特异地结合到探针c e i + 6 上。 这些结果表明b m h r p 2 8 能特异结合到b m d s x 的第4 外显子上，应该是一个参与家蚕b m d s x 前体m r n a 雄特异性拼接的拼接因子。 4 f e m 侯选基因b m w z f l ，b m w z f 2 的分子克隆及功能研究 m i t a 等在2 0 0 6 年的第七次鳞翅目昆虫分子生物学和遗传学国际研讨会上提到它们发现 了位于家蚕w 染色体上的两个锌指蛋白基因，并且它们在第2 5 连锁群上有序列相似的同源 拷贝。根据这一信息，我们通过对2 5 连锁群上所有预测的锌指蛋白基因、家蚕e s t 以及基 因组序列的分析，找到了一条与基因组序列有很明显的差异的e s t ，由于家蚕基因组测序并 没有测w 染色体序列，因此，该e s t 可能来自w 染色体。根据该e s t 克隆了两种来自w 染色体的m r n a 分子，分别命名为砌硎捌和b m w z f l - p b ，两者仅仅相差5 6m ，并且 都包含完整的o r f ，分别编码3 6 0a a 和3 8 6a a ，推测这两种m r n a 分子可能由同一个基因 通过选择性拼接产生。结构域预测表明它们均含有1 个脯氨酸结构域和2 个c c c h 结构域。 通常脯氨酸结构域参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用，c c c h 结构域具有结合d n a 或r n a 的作用，参与m r n a 的拼接调控。将b m w z f i 蛋白在n c b i 进行同源性检索表明b m w z f l 与小鼠c h c r 基因、果蝇m u s c 沈b l i n d 基因具有一定的相似性。果蝇m u s c l e b l i n d 蛋白通过调 控下游基因的选择性拼接来调控肌肉的末端分化。这意味着b m w z f l 可能为一个拼接因子， 调控下游基因的选择性拼接。 随后以b m w z f l 为起点，向砌删基因的37 端延伸，克隆了位于w 染色体上b m w z f l 的3 端的另外一个锌指蛋白基因b m w z f 2 。发现该基因编码3 6 3a a ，含有6 个c 2 h 2 结构域。 通常c 2 h 2 结构域具有结合d n a 的功能，将b m w z f 2 蛋白在n c b i 进行同源性检索发现与 其他物种的转录因子相似性很高。推测该基因编码的蛋白为一个转录因子，可能对下游靶基 因起到转录调控的作用。 将砌唧和b m w z f 2 的核苷酸序列与家蚕基因组序列进行b l a s t n 比对，发现两个 基因在常染色体均有两个序列高度一致的拷贝，其中b m w z f l 在常染色体上的两个拷贝命名 i i i 两南大学博j j 学位论文 r , m 量曼皇鼍曼量曼曼曼曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼! ! 曼曼曼曼鼍曼曼曼曼量曼鼍曼置曼 为b m a z f l a 和b m a z f l b 。b m w z f 2 在常染色体上的两个拷贝命名为b m a z f 2 a 和b m a z f 2 b 。 发现b m a z f l a ，西州z 兀6 ，b m a z f 2 a 和b m a z f 2 b 都位于家蚕第2 5 连锁群，并且依次排列 成一串，其中b m a z f l a 和b m a z f 2 a 的转录方向相对。 根据家蚕基因组序列，预测的c d s 及e s t 信息分别对常染色体上的锌指蛋白基因 b m a z f l a ，励纠z 门6 ，b m a z f 2 a ，b 批4 z 砣6 进行克隆。发现台耽4 z w 口存在选择性拼接，主 要为两种m r n a 形式，分别编码3 6 0a a 和3 8 6a a 的蛋白。均含有1 个脯氨酸结构域和2 个 c c c h 结构域。并且发现b m a z f l a 基因存在多个单核苷酸多态性( s n p ) 位点，由于s n p 的存在导致b m a z f l a 基因编码几种不同的蛋白。将b m w z f l 和b m a z f l a 编码的氨基酸序 列进行比对发现两者能够编码氨基酸序列完全一致的蛋白，只是由于b m a z f l a 存在多个s n p 位点导致编码多种其它形式的蛋白。这说明b m w z f l 和b m a z f l a 可能在家蚕中行使着同样 的功能。 b m a z f l b 基因编码4 5 6 鲍，同样含有1 个脯氨酸结构域和2 个c c c h 结构域，由1 1 个 外显子和1 0 内含子组成。核苷酸和氨基酸序列比对表明b m a z f l b 与b m w z f l ，b m a z f l a 在核苷酸和蛋白序列上均存在较大的差异。说明b m a z f l b 可能由于序列变异变成了与 b m 唧和b m a z f l a 功能完全不同的另外一个基因。b ，以z 门口基因前体m r n a 通过选择性 拼接产生两种成熟m r n a 分子，b m a z f 2 a - p a 和b m a z f 2 a - p b ，分别编码5 9 0a a 和1 5 7a a 。 结构域预测表明b m a z f 2 a - p a 含有1 2 个c 2 h 2 结构域，b m a z f 2 a - p b 含有6 个c 2 h 2 结构域。 b m a z f 2 a - p a 由1 2 个外显子和1 l 内含子组成。b m a z f 2 b 基因编码5 9 9a a , 含有1 1 个c 2 h 2 结构域，由1 1 个外显子和1 0 个内含子组成。将b m a z f 2 a 和b m a z f 2 b 蛋白在n c b i 进行 b l a s t 检索表明均与其它物种中的转录因子高度保守，说明这两个基因编码的蛋白也为转录 因子，可能调控下游基因的转录。将b m a z f 2 a 和b m a z f 2 b 的氨基酸序列进行比对表明两 者氨基酸序列高度相似。氨基酸序列比对表明b m w z f 2 与b m a z f 2 a 、b m a z f 2 b 相似性很 高，但在n 端比b m a z f 2 a 、b m a z f 2 b 少一段序列。 以限性白卵为材料，通过r t - p c r 检测各个基因在胚胎期的表达情况。结果表明b m w z f l 是在受精后大约3 6 小时才开始进行表达，并且仅仅在雌性胚胎中表达，由于家蚕的性别是在 胚胎发育的早期就决定了的，作为初始信号的f e r n 基因应该是在受精后胚胎发育的某一时间 点才开始在雌性中进行表达。这说明，b m w z f l 基因很有可能就是经典遗传学推测的位于w 染色体上的f e m 基因。r t - p c r 结果显示b m a z f l a ，b m a z f l b ，b m a z f 2 a 和b m a z f 2 b 在未 受精卵及整个胚胎发育过程中均有高量表达，并且在雌雄中无表达差异。 对b m w z f l 基因进行r n a i 之后发现一些雌蛾卵巢管内的卵排列出现混乱，同时粘腺也 出现异常，正常雌蛾的两个粘腺应该一样大小，而异常个体的两个粘腺其中一个大另一个小。 随后进一步通过转基因来验证b m w z f i 基因是否起性别决定的作用，结果发现将砌嗍 基因转到雄性和雌性后对性别并没产生什么影响，而r t - p c r 结果表明外源砌删基因在 m r n a 水平的转录量很高。这些结果说明将砌嗍进行转基因后并没有改变个体的性别， i v 摘要 可能只转b m w z f l 一个基因并不能对雌雄性别产生影响。 5 家蚕性别决定调控途径的推测 经典遗传学的研究表明家蚕的性别由位于w 染色体上一个推测的f e r n 基因决定，但f e r n 基因的具体分子形式一直没鉴定出来。s u z u l d 等的研究表明b m d s x 为位于家蚕性别决定途径 末端的基因，而在b m d s x 之上家蚕的性别调控途径与果蝇似乎不同，同时发现b m p s i 为调 控b m d s x 前体m r n a 雄特异性拼接的一个拼接因子。而b m p s i 在果蝇中的同源体脚为调 控p 元件转座酶组织特异性拼接的关键基因，因此，b m p s i 也有可能是调控b m d s x 拼接的关 键基因。在本研究中，我们发现了调控b m d s x 前体m r n a 拼接的另外一个拼接因子b m h r p 2 8 ， 它能特异地结合到b m d s x 第4 外显子的顺式调控元件c e i + 6 上。我们还克隆了两个来自w 染色体的锌指蛋白基因b m w z f l 和b m w z f 2 ，它们可能为经典遗传学所预测的f e m 基因。 根据目前的这些研究结果，我们推测家蚕性别决定的主干途径如下图所示： f e r n ( b i n 掰1 b mw z f 2 ) b m p s i b m h r p 2 8 b m d s x 夕、 b m d s x fb m d s x m 旦 o 奉 关键词：家蚕性别决定b m h r p 2 8 选择性拼接凡册候选基因 v a b s t r ac t i d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o nr e s e a r c ho ft h e k e y g e n e si nm eu p p e rp a r to f t h eb o m b y xm o r is e x 1 一 一一一 一 d e t e r m l n a t l o np a t h w a y 上- p hd c a n d i d a t e ： w a n gz i l o n g s u p e r v i s o r ：p r o f x i aq i n g y o u p r o f h en i n g ji a a b s t r a c t t h eb o m b y xm o r is e xd e t e r m i n a t i o nh a sl o n gb e e ng r e a t l yc o n c e r n e d , b e c a u s ei ti sn o to n l ya f u n d a m e n t a lb i o l o g i c a lp r o b l e m , b u ta l s ob ec l o s e l yr e l a t e dw i t ht h es i l ki n d u s t r y t h ec l a s s i c a l g e n e t i c sr e s e a r c h e ss h o w e das t r o n gf e m a l ed e t e r m i n a t o r ( f e m ) p r e s e n t e do nt h ew c h r o m o s o m e c o n t r o l st h es e xd e v e l o p m e n to ft h eb o m b y xm o r i w h i l e ，b yf a rt h ep u t a t i v ef e r ng e n eh a sn o tb e e n i d e n t i f i e d i n2 0 01 ，o h b a y a s h ic l o n e db o r n b y xm o r ih o m o i o g u eo ft h ed r o s o p h i l ad s xg e n el y i n gi n t h et e r m i n a lo ft h es e xd e t e r m i n a t i o nc a s c a d e s i m i l a rt od s x ，t h eb m d s xt r a n s c r i p ti sa l t e r n a t i v e l y s p l i c e di nm a l ea n df e m a l et op r o d u c em a l ea n df e m a l es p e c i f i cm a t u r em r n a s ，w h i c hc o d ef o r m a l e s p e c i f i c ( b m d s x m ) a n df e m a l e s p e c i f i c ( b m d s x ) p r o t e i n st oc o n t r o lt h et e r m i n a ls e x d i f f e r e n t i a t i o ni nb o m b y xm o r i e v e nt h o u g h , t h ea l t e r n a t i v es p l i c i n gm e c h a n i s mo ft h eb m d s x p r e m r n ai sv e r yd i f f e r e n tf r o mt h a to f t h ed s x t h ed e f a u l ts p l i c i n gf o r mo f d s xi sm a l es p e c i f i c ，i n f e m a l e ，t h et r a t r a 一2a c t i v a t e st h ef e m a l e s p e c i f i cs p l i c i n g w h i l ei nb o m b y xm o r i , t h ed e f a u l t s p l i c i n gf o r mi sf e m a l es p e c i f i c ，s o m ei n h i b i t o r sr e p r e s st h es p l i c i n go ft h eb m d s xe x o n s3a n d4i n m a l e b yf a r , t h er e g u l a t i o nc a s c a d eb e t w e e nt h ef e r na n dt h eb m d s x i ss t i l lu n c l e a r t om a k ec l e a r t h es e xd e t e r m i n a t i o nc a s c a d eu p s t r e a mb m d s x ，w ea n a l y z e dt h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si n m a l ea n df e m a l ee m b r y o sb ym i c r o a r r a y , i d e n t i f i e das p l i c i n gf a c t o ro fb m d s xb yg e l s h i f ta n dl c m s m s ，a n dw ec l o n e dt w oc a n d i d a t e so ff e r na n dp e r f o r m e dt r a n s g e n i ca n a l y s i s w eo b t a i n e dt h e f o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 m i e r o a r r a y - b a s e da n a l y s i so fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si nm a l ea n df e m a l ee m b r y o s v i i 西南大学博上学位论文 t h es e xo fs i l k w o r mi sd e t e r m i n e da tt h ee a r l ys t a g eo fe m b r y od e v e l o p m e n t t h eg e n e s i n v o l v e di ns e xd e t e r m i n a t i o ns h o u l db ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nm a l ea n df e m a l ee m b r y o sa tt h e e a r l ys t a g eo fe m b r y od e v e l o p m e n t t oi d e n t i f yg e n e si n v o l v e di nb o m b y xm o r is e xd e t e r m i n a t i o n , w ep e r f o r m e dm i c r o a r r a yt oi d e n t i f yt h o s eg e n e s t h es i l k w o r ms t r a i ns e x l i m i t e dw h i t ee g gw a s u s e d 雏m a t e r i a l t h e4 8h ，6 0k7 2ha n d9 6hm a l ea n df e m a l ee m b r y o sa f t e rf e r t i l i z a t i o nw e r e u s e df o rm i c r o a r r a ya n a l y s i s a n d4he m b r y o sa f t e rf e r t i l i z a t i o nw e r eu s e d 孙c o n t r 0 1 t h e r ea r eat o t a lo f4 0 4 9g e n e sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da tl e a s ta to n et i m ep o i n ti nm a l ea n d f e m a l ee m b r y o sb ya n a l y s i s g oa n a l y s i ss h o w e dt h e i rf u n c t i o n sa r em a i n l yc a t a l y t i ca c t i v i t y , n u c l e i ca c i db i n d i n g ，p r o t e i nb i n d i n ga n dt r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n , i n v o l v e di nm e t a b o l i cp r o c e s s , d e v e l o p m e n tp r o c e s s ，t h er e g u l a t i o no fb i o l o g i c a lp r o c e s sa n dp i g m e n t a t i o n o ft h e m ，2 4 3 2g e n e s a r ez y g o t i ce x p r e s s e d 10 6 2g e n e sa r ec a u s e db yt h ed i f f e r e n t i a ld e g r a d a t i o no fm a t e r i a lt r a n s c r i p t s a t4 8k6 0k7 2ha n d9 6h ，t h en u m b e ro fg e n e su p - r e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h4ha f t e rf e r t i l i z a t i o n i sl a r g e rt h a nd o w n - r e g u l a t e d c l u s t e r i n go fa l lt h e s eu p - r e g u l a t e dg e n e ss h o w e dt h ee x p r e s s i o n p a a e m so ft h e s eg e n e sa r ed i f f e r e n tb e t w e e nm a l ea n df e m a l e i nf e m a l e ，m o s to ft h e s eg e n e sf o r m ap e a ka t4 8h ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h e s eg e n e sg r a d u a l l yd e c r e a s e df r o m4 8ht o7 2h t h e n i n c r e a s e da t9 6h w h i l ei nm a l e ，m o s to ft h e mi n c r e a s e df r o m4 8ht o7 21 1 ，t h e nd e c r e a s e da t9 6h i tm a yb ed u et ot h ep i g m e n t a t i o nd i f f e r e n c eb e t w e e nm a l ea n df e m a l ee g g sd u r i n gt h ee a r l ys t a g e s o fe m b r y od e v e l o p m e n t w ef o u n d81a l t e r n a t i v es p l i c i n gi s o f o r m sb e l o n g i n gt o4 3g e n e s ，o c c u p y i n g21 8 o fa l lt h e a l t e r n a t i v es p l i c i n gi s o f o r m s t i l e ya r em a i n l ye n z y m e sw i t hc a t a l y t i ca c t i v i t ya n dd n ao rr n a b i n d i n gp r o t e i n s b e s i d e s ，w ea l s of o u n d17s p l i c i n gf a c t o r sw i t he x p r e s s i o nd i f f e r e n c ei nm a l ea n d f e m a l ee m b r y o s t h e yi n c l u d e4h n r n p s ，4s n r n p sa n do t h e rr n ab i n d i n gp r o t e i n s 2 t h ef u n c t i o nr e s e a r c ha b o u tb m s x a n db m r b p l s x li sak e yr e g u l a t o ri nt h ed r o s o p h i l as e xd e t e r m i n a t i o nc a s c a d e p r e v i o u sr e s e a r c h e rc l o n e d t w os p l i c i n gv a r i a n t so fb m s x l , b m s x l - 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s p e c i f i cs p l i c i n go f b m d s xp r e m r n a a n dt h e r ea r et h r e ec r i t i c a lc i s -