（微生物学专业论文）核糖核酸干扰在马铃薯淀粉代谢途径改良中的应用.pdf

原创性声明 | | i l l llj ll ll lll lf ll llsf y 18 8 8 6 4 4 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：西到盘红 日 期：2 鲤l 臣：丛 指导教师签名：圈 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有 权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和 磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇 编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古 大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期 问导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：西妞 闩 期：知k ：一 燃旦 核糖核酸干扰技术在马铃薯淀粉代谢途径改良中的应用 摘要 淀粉是仅次于纤维素的第二大碳水化合物。马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m - l ) 是淀粉生产的重要原料，块茎中淀粉含量可达8 - 3 4 ，是生产淀粉的适宜作物， 其淀粉具有优良的特性，已成为食品和工业的重要原材料。大多数应用领域中， 一般要求淀粉具有较低的糊化温度和较弱的凝沉( 老化) 性，即高纯度的支链 淀粉。 在马铃薯的淀粉代谢过程中，控制淀粉生物合成的关键酶有a d p 葡萄糖焦 磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶，利用基因工程技术对相 关基因表达进行调控，可定向改变淀粉含量和组成，特别是利用r n a 干扰( r n a i n t e r f e r e n c e ，i 处) 技术，可显著影响目标基因的表达，从而改变直链和支链 淀粉的含量及其比值。 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，砒临i ) ，是由内源性或者外源性双链r n a 引起的序列特异性基因沉默。小分子双链r n a 能对基因的表达有不同程度调控， 即转录水平的基因沉默( 主要体现在s i r n a 修饰d n a 分子，抑制转录的发生) 和转录后水平基因沉默( 主要指s i i a 在m r n a 水平抑制目标基因表达) ，调 节或关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。 本研究依照r n a 干扰原理，以马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶一 颗粒结合型淀粉合成酶( g r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s ei ，g b s si ) 作为靶标， 分别从转录水平，转录后水平和m i c r o r n a 途径构建植物双元表达载体，以期 获得含高纯度支链淀粉的马铃薯新品种同时，研究不同水平的基因沉默在基因 表达方面的分子机制。 另一方面，作为一个重要的粮食作物和有较高工业价值的经济作物，马铃 薯需要常年被提供。为了避免马铃薯在储藏期间发芽，低温储藏是常用的一种 方法。然而，低温糖化引起的褐变反应严重影响了马铃薯品质。所以低温糖化 和淀粉改良是马铃薯生产应用中的比较关注的内容。同时，高纯度支链淀粉马 铃薯品种在低温储藏过程中，相比于支链淀粉含量低的马铃薯品种更容易被低 温糖化，所以高纯度支链淀粉含量的马铃薯品种实现工业化，低温糖化是需要 解决的问题之一。如果可以通过r n a 干扰技术获得富含支链淀粉同时抗低温糖 化的马铃薯品种，不论是对于生产应用还是对于马铃薯淀粉代谢途径的研究都 有重要意义。 本研究依照r n a 干扰原理，构建了双元表达载体，它可以同时靶标马铃薯 淀粉代谢过程中两个基因颗粒结合型淀粉合成酶基因( 删) 和液泡转化 酶基因( i n v e r t a s e ) 。 关键词：支链淀粉；低温糖化；核酸核糖干扰 l l a p p l i c a t i o no fr n a it e c h n o l o g yi n p o t a t o s t a r c hm e t a b o l i c a b s t r a c t s t a r c hi st h es e c o n dm o s ta b o u d e n tc a r b o h y d r a t ea r e rt h ec e l l u l o s e t h ec o n t e n t o fs t a r c hi s8 - 3 4 i np o t a t o ( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) t u b e r s p o t a t oi sai d e a lc r o pt o p r o d u c es t a r c hw h i c hi su s e da so n eo f t h em o s ti m p o r t a n tr a wm a t e r i a lsi nb o t hf o o d a n di n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s i nt h em o s ta p p l i c a t i o n s ，t h ep o t a t os t a r c hi sr e q u i r e dt o p o s s e s st h ep r o p e r t i e so fl o w e r - g e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r ea n df a i n t i s hr e t r o g r a d a t i o n t h ec h a r a c t e r i s t i co fs t a r c hi sr e l a t e dt ot h er a t i oo fa m y l o s ea n da m y l o p e c t i n ，a n dt h e k e ye n z y m e si ns t a r c hb i o s y n t h e s i sp a t h w a ys u c h a sa d e n o s i n e5 d i p h o s p h a t e g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ，s t a r c hs y n t h a s e ，s t a r c h - b r a n c h i n ge n z y m ea n ds t a r c h d e b r a n c h i n ge n z y m e t h ee n z y m ea s s o c i a t e dw i t ht h ea m y l o s es y n t h e s i s i sj u s t p a r t i c l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ( 6 a s s ) r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) i sm e d i a t e db ye n d o g e n o u so re x o g e n o u ss p e c i f i c d o u b l e s t r a n d e dr n a t h ed o u b l e s t r a n d e dr n a sa r ep r o c e s s e di n t os i r n a sb y d i c e rp r o t e i n s s i r n a sr e g u l a t e g e n ee x p r e s s i o n a td i f f e r e n tl e v e l s ，s u c ha s t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ( i n d u c e db ys i r n a - m e d i a t e dd n am e t h y l a t i o nt o s u p p r e s sg e n et r a n s c r i p t i o n ) a n dp o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ( s i r n a - m e d i a t e d c l e a v a g eo fm r n a ) i no r d e rt oi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fg b s si ( g r a n u l e b o u n ds t a r c hs y n t h a s ei ) g e n ee n c o d i n gt h ek e ye n z y m ei na m y l o s es y n t h e s i sp a t h w a ya n dt op r o d u c ean e w p o t a t oc u l t i v a r f r e eo fa m y l o s e ，p l a n tb i n a r y e x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e dt o s i l e n c eg b s sia tt r a n s c r i p t i o n a la n dp o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l sa c c o r d i n gt ot h e p r i n c i p l eo fr n a i n t e r f e r e n c e i na d d i t i o n ，a sa i li m p o r t a n tf o o da n dc a s hc r o p ，p o t a t o e sn e e dt ob es u p p l i e d y e a rr o u n da n ds t o r a g ei nl o wt e m p e r a t u r ei sac o m m o nw a yt oa v o i dg e r m i n a t i o n h o w e v e r ，t h eb r o w n i n gc a u s e db yc o l d i n d u c e ds w e e t e n i n gs e r i o u s l ya f f e c t st h e q u a l i t yo fp o t a t ot u b e r s t h e r e f o r e ，s p o n t a n e o u ss u p p r e s s i o no fa m y l o s ef o r m a t i o n a n dc o l d i n d u c e ds w e e t e n i n gm a yc r e a t ean o v e lt y p eo fp o t a t of o rp r o d u c t i o na n d a p p l i c a t i o n r n ai n t e r f e r e n c et e c h n o l o g yi sa na c c e p t a b l es t r a t e g yf o r t h i s i nt h i ss t u d y ，ab i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ri sc o n s t r u c t e dt os i l e n c eb o t hv a c u o l a r a c i di n v e r t a s eg e n e ( v l n v ) a n dg b s s , a i m i n gt om i n i m i z ea m y l o s ef o r m a t i o na n d r e d u c ec o l d i n d u c e ds w e e t e n i n g k e y w o r d s ：a m y l o p e c t i n ；c o l d i n d u c e ds w e e t e n i n g ；r n ai n t e r f e r e n c e l v 目录 一、前言l 1 1 马铃薯概述1 1 1 1 马铃薯特性1 1 1 2 我国马铃薯产业现状2 1 2 马铃薯淀粉与低温糖化2 1 2 1 淀粉2 1 2 2 马铃薯淀粉特性：3 1 2 3 马铃薯低温糖化5 1 2 4 支链淀粉与低温糖化5 1 3 马铃薯淀粉代谢6 1 3 1 淀粉代谢过程6 1 3 2 淀粉代谢相关的酶7 1 4r n a 干扰技术1 2 1 4 1r n a 干扰技术的发现1 2 1 4 2r n a 干扰机制1 3 1 5 研究意义1 6 二、实验材料与方法1 8 2 1 实验材料1 8 2 1 1 菌种与质粒1 8 2 1 2 工具酶和试剂1 8 2 2 实验方法1 8 2 2 1c t a b 法提取植物总d n a 1 8 2 2 2 碱裂解法提取少量质粒d n a 2 0 2 2 3t r i z o l 法提取植物总r n a 2 2 2 2 4 大肠杆菌细胞感受态的制备与转化2 3 2 2 5 热激法转化大肠杆菌实验2 3 2 2 6 技术路线2 4 2 2 7 质粒载体的构建2 5 三、结果与讨论3 1 3 1 目标序列的扩增3 1 3 1 1 植物总r n a 提取3 1 3 1 2 目的序列的扩增3 1 3 2 载体鉴定分析3 3 3 2 1 克隆载体的酶切分析3 3 3 2 2 表达载体的构建与测序3 6 3 3 讨论4 0 v 3 3 1 转录后水平和转录水平的r n a i 载体的构建4 0 3 3 2 载体结构中影响r n a 干扰的因素4 l 3 3 3 粉代谢途径的改良思考4 1 3 3 4g b s s 基因启动子区域的研究4 2 3 3 5m i c r o r n a 介导的基因沉默4 2 3 3 6 建载体过程中遇到的问题4 3 3 4 结论4 3 参考文献4 5 致谢5 2 一、刖吾 上_ - j - 1 1 马铃薯概述 1 1 1 马铃薯特性 形态特征：马铃薯茎为直立或匍匐，叶为奇数羽状复叶，主茎埋入土中，各节发生匍匐 枝，顶端肥大，形成圆形、扁圆或长圆筒形的块茎，上有许多芽眼，呈螺旋状排列，并为二 个叶序环，顶端有项芽，皮色红、黄、白或紫色，肉有白、黄、淡紫色等。花为聚伞花序， 顶生，白红或紫色，自花授粉。浆果球形，绿或紫褐色。种子扁圆形、黄色。 生物学特性：马铃薯是茄科茄属马铃薯组基上节亚组植物，起源于南美洲安第斯山脉高 原秘鲁南部地区的多年生植物，1 6 世纪末开始陆续传播到世界各地，并逐渐成为欧洲和东 亚地区的主要粮食作物。马铃薯生长在北纬3 5 至5 0 之间适宜的土壤和气候条件下。喜砂质 土壤，光照强、昼夜温差大、气候冷凉的地区。野生型的马铃薯染色体为二倍体，而马铃薯 栽培品种的染色体为四倍体，栽培品种马铃薯为无性繁殖作物，且以薯块作为种源。 生长习性：马铃薯植株的生长及块茎的膨大，有喜欢冷凉的特性，块茎在土温5 开始 发芽，1 8 生长最好，茎叶生长适温为2 0 ，块茎膨大要求较低温度，适宜土温为1 5 1 8 。c ， 超过2 5 停止生长膨大，高温季节易发生病毒病而引起退化，植株和块茎在气温降到0 c 以 下则受霜害；马铃薯是喜光性的作物，长日照能促进茎叶生长和现蕾开花，短日照有利块茎 形成，一般每天日照在1 1 小时，茎叶发达，块茎产量高。马铃薯要在黑暗中块茎才能形成； 马铃薯是需水量较多的植物，活植株的水分约占9 0 ，块茎含水量也达8 0 左右，通常，每 生产1 千克鲜马铃薯块茎，约需要从地里吸收1 4 0 升水。马铃薯耐酸不耐碱，要求在p h 5 5 6 0 的微酸性疏松的砂壤土中生长，碱性土栽培易发生疮痴病，而砂壤土则有利于薯块在土壤中 的呼吸作用。 1 1 2 我国马铃薯产业现状 在世界粮食作物中，马铃薯仅次于水稻和小麦，为第三大作物。根据联合国粮农组织统 计，目前全世界马铃薯种植面积2 0 0 0 万公顷，分布于世界1 2 8 个国家和地区，总产量达3 5 亿 吨。2 0 0 8 年，中国的可耕种植面积为1 2 2 亿公顷，其中4 9 0 万公顷土地用于种植马铃薯，占全 世界马铃薯栽培总面积的2 6 ；马铃薯总产量7 0 0 0 万吨，占世界马铃薯年总产量的2 2 。 中国是世界农业大国，但是由于农业、工业以及一些科学管理体制的发展步伐不同步， 导致农产品的工业化道路异常艰难，这一现象在马铃薯生产中尤为明显。中国的马铃薯生产 总量虽然在世界己处于领先地位，但由于我国农产品加工利用率和增值率非常低，马铃薯的 应用大部分局限在简单食用、饲料等领域，目前我国生产的马铃薯绝大部分用于鲜储、鲜运、 鲜销、鲜食，占总量的8 5 ，而马铃薯加工量只占鲜薯产量的1 5 ，比发达国家的5 0 低3 5 个百分点，差距较大。欧、美、日等发达国家直接以马铃薯为原料加工的各类食品有3 0 0 多 种，制成淀粉、各种类型的变性淀粉及淀粉深加工产品更达上千种。各发达国家马铃薯产量 虽然有限，但其大部分用于加工增值，如：荷兰加工品占4 7 ，美国占4 8 ，英国占4 0 ，法国占5 9 ，而我国加工率只占1 5 。这种情况，一方面反映出我国的马铃薯产业化 水平很低，无法满足社会发展和工业化需求，但另一方面，也预示着中国马铃薯加工产业有 巨大的发展空间和市场潜力，具有旺盛的生机和活力。 1 2 马铃薯淀粉与低温糖化 1 2 1 淀粉 淀粉是以葡萄糖为基本单位构成的多糖，是仅次于纤维素的第二大碳水化合物，为植物 体中贮存的养分，贮存在种子和块茎等组织中，各类植物中的淀粉含量都较高。根据淀粉 分子结构的特征，可分为直链淀粉( a m y l o s e ) 和支链淀粉( a m y l o p e e t i n ) 两类。直链淀粉是以 a 1 ，4 糖苷键连接而成的数干个单位的葡萄糖链状分子，分为完全没有分支和分支极少 的两类线性大分子，其相对分子质量为( o 2 1 ) x 1 0 6 ；支链淀粉是短的a 1 ，4 糖苷键相连 的葡萄糖链通过0 【1 ，6 糖苷键连接而成的高度分支的葡萄糖聚合物，其相对分子质量为 ( 1 0 - 5 0 0 ) x1 0 6 。 淀粉的工业用途相当广泛，纺织、造纸、食品、石油钻井、铸造等很多工业领域都需 要以淀粉为原材料，而淀粉的工业价值与它自身的两个特性有直接联系，即“糊化”与“老 化”。“淀粉糊化”是指，当淀粉在冷水中被搅拌的时候会成为淀粉乳，停止搅拌静置后，由于 淀粉的比重比水大而不溶于水，所以会沉淀于下部。若将其加热，淀粉分子间的作用力随温 度升高而逐渐减弱，水分子可以进入淀粉微晶体结构，拆散分子间的缔合力，淀粉颗粒开始 吸水膨胀，进而淀粉粒的形状被破坏，当加热至6 0 - - , 7 5 0 c 左右，成为半透明的胶体状，此时 即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀，这种现象称为淀粉的“糊化”，淀粉能实现糊化的温度称 为糊化温度。经完全糊化的淀粉，在较低温度下自然冷却或缓慢脱水干燥，就会使在糊化时 已被破坏的淀粉分子氢键发生再度结合，胶体发生离水使部分分子重新变成有序排列，结晶 沉淀为凝胶体，这种现象被称为“老化”( 回生或凝沉) 。老化结晶的淀粉称为老化淀粉，老化 淀粉难以复水。“老化”是“糊化”的逆过程，“老化”过程的实质是在糊化过程中，已经溶解膨 胀的淀粉分子重新排列组合，形成一种类似天然淀粉结构的物质，淀粉老化的过程是不可逆 的。 淀粉的“糊化”与“老化”特性的强弱除与含水量、温度、酸碱度、共存物等外界因素相关 外，与淀粉的种类、分子的结构及组成密切相关。直链淀粉由于分子排列比较规整，分子容 易相互靠拢而重新排列，所以在冷的水溶液中，直链淀粉有很强的凝聚沉淀作用。而支链淀 粉的分子大，各支链的空间阻碍作用使分子间的作用力减小，晶体结构不太紧密，水分子容 易进入，使颗粒润湿胀大。当温度升高，水的渗透作用加快，支链间作用力减弱而水分子作 用力加强，形成非常黏滞的液体。温度继续上升，支链淀粉溶解度进一步增大。通常淀粉分 子越小，直链淀粉含量越多，氢键作用越强，破坏这些氢键所需能量越大，糊化温度则高， 糊化较难。相反时，则容易糊化。而对于糊化淀粉老化特性而言，直链淀粉分子在糊化液中 空间障碍小，易于取向，亦易老化。但是，其中相对分子量大的，取向困难；相对分子量小 的，易于扩散，均不易老化：相对分子量适中的方易于老化。而且直链淀粉构成比例越大， 越易老化。因此，含直链淀粉多的淀粉易老化，不易糊化；含支链淀粉多的淀粉易糊化不 易老化。通常在大多数生产原材料中需要高纯度的支链淀粉，尤其是在造纸业、纺织业、食 品加工业和粘合剂等领域中需要的淀粉为高纯度的支链淀粉。按照传统方法，工业上要使用 高纯度的支链淀粉，必须要将淀粉中的支链淀粉与直链淀粉通过化学修饰或者物理方法分离， 严重增加了生产成本。 1 2 2 马铃薯淀粉特性 马铃薯在淀粉产业中是仅次于玉米的第二大淀粉原材料，其淀粉含量为8 - 3 4 ，马铃薯 淀粉与其他植物淀粉相比，有着不可代替的独特品质： ( 1 ) 马铃薯淀粉具有较高的粘性，可作为增稠剂使用，而且小剂量使用时，就能获得适 合的粘稠度；马铃薯淀粉分子聚合度高，颗粒大，因此具有高膨胀度，保水性能优异，适用 于膨化食品、肉制品及方便面等产品。 ( 2 ) 马铃薯淀粉的蛋白质、脂肪残留量低，含磷量高而且颜色洁白，具有天然的磷光， 溶液的透明度也很高，因此能改善产品的色泽和外观。 ( 3 ) 由于马铃薯淀粉糊化温度低，粘度的增加速度快，有利于节省能耗。 ( 4 ) 马铃薯淀粉由于其支链淀粉含量较高，很少会出现凝胶和老化现象，是一种较好的 稳定剂。 ( 5 ) 马铃薯淀粉口味温和，无刺激，它没有玉米、小麦淀粉那样典型的谷物口味，所以 是食品添加剂的最佳选择。 马铃薯淀粉及其衍生物具有十分广泛的工业用途。国内潜在需求量在1 0 0 万吨以上。主 要用途有以下方面： 造纸业：在造纸生产过程中，薄纸成形之前，需将纤维组织凝结在一起，此时使用的主 要产品是阳离子衍生物，马铃薯淀粉所制备的阳离子淀粉能有效地改善填充剂和细纤维的固 定能力以及纸张的其他化学性质，因此被广泛应用。其生产流程中主要用在四个方面：打浆 机上胶，在薄纸成形之前，将纤维组织凝结在一起；桶上胶，浸透稀胶液，预形成薄纸；轧 光机上胶，上光整修；表面上胶。美国的马铃薯淀粉约有3 3 用在在造纸工业。 食品加工业：在食品工业中，马铃薯变性淀粉主要用做增稠剂、粘结剂、乳化剂、充填 剂、赋型剂等。在美国，马铃薯淀粉约3 0 应用在食品上，特别是在汤料中大量使用，它具 有较高的初始粘度，能有效地分散各种成分，在随后的高压消毒处理时，最终产品的粘度可 以达到所要求的程度。同时，用于焙烤特殊食品；制成颗粒作为“布丁；香肠的扎线和填 充料；适于口味极温和的清水罐头水果等；添加在糕点面包中，可增加营养成分，还可防止 面包变硬，从而延长保质期；添加在方便面中，增强柔软度、改善口感。 纺织业：主要是用于棉纱、毛织物和人造丝织物的上浆，以增强和保持经纱在编织时的 耐摩性、光洁度。经用马铃薯淀粉上浆的纱具有另一个优点是染色后能得到鲜艳的色泽。用 马铃薯淀粉精梳的棉纺品具有一个良好的手感和光滑的表面。 饲料工业：主要用于水上养殖饲料的粘结剂。甲鱼、鳗鱼饲料是浮漂在水中供食用的， 作为水上养殖饲料的粘结剂应该具有不怕水、易于消化、无毒等特点，而马铃薯精淀粉的变 性产物预糊化淀粉是鳗鱼饲料的最好粘结剂，一般添加量占2 0 。 4 胶粘剂生产：作为胶粘剂主要是糊精化马铃薯淀粉。在美国约有1 9 的马铃薯淀粉用于 制备粘胶剂。糊精化马铃薯淀粉具有高的糊粘性和柔韧的最终膜，还具有极容易再显胶的特 性，使它可用于生产涂胶商标、贴标签、包装胶纸和胶带纸等。 铸造业：预糊化淀粉在高温状态下失去粘性并炭化为粉末，这一特性使其在铸造上得到广 泛应用。用预糊化淀粉作粘结剂制作的砂芯不仅清砂容易，而且具有表面光洁等特点。国外 已广泛采用此技术，国内也开始应用。 石油工业：马铃薯预糊化淀粉具有抗高温和耐高压的特性，国外用作石油钻井中的稠度稳 定剂，能有效地控制泥浆水分的滤失。美国马铃薯淀粉在油田中使用约占它的总消费量的1 5 。一般情况下，钻一口深油井需预糊化淀粉2 - 5 吨。国内目前钻井用预糊化淀粉只是试用 阶段，预计以后会大幅度增长。 1 。2 3 马铃薯低温糖化 作为一个重要的粮食作物和有较高工业价值的经济作物，马铃薯需要常年被提供。为了 避免马铃薯在储藏期间发芽，通常采用化学药物抑芽或者低温储藏的方法，而使用抑芽剂会 对环境造成一些不利影响，所以低温储藏是马铃薯生产中常用方法。在夏季，低温储藏马铃 薯有着以下的一些优点：( 1 ) 可以减少一些真菌和细菌污染的同时避免使用化学药剂。( 2 ) 低温储藏期间，因为薯块的呼吸作用被减少，所以减少了干物质含量的损失。( 3 ) 更容易维 持储藏期间的湿度条件。( 4 ) 增加销售时间和延长生产线。( s o w o k i n o s ，2 0 0 7 ) 然而，低温储藏也伴随着一些对薯块加工的不利影响。在低温条件下，由于淀粉的分解 代谢，淀粉可以转变为还原糖，在马铃薯薯块中可以转变为葡萄糖和果糖，这一现象称为低 温糖化。在制作薯片过程中，薯块中积累的还原糖成分可以与其游离的氨基酸反应，在炸片 表面形成褐色到黑色不等的非酶反应导致的物质，即美拉德反应，( p r e s s e y , 1 9 6 9 ；c o f f i ne ta 1 ， 1 9 8 7 ) ，从而严重影响薯片的品质。马铃薯低温储藏的另外一个弊端是，薯块中积累的还原糖 成分可以与天冬酰胺类化合物在马铃薯薯块油炸过程中的高温条件下反应生成丙烯酰胺类物 质，曾有报道称，此类化合物可能对人体健康存在着潜在的威胁( f o o de ta 1 ，2 0 0 7 ) 。所以不论 是常规育种或者分子生物学育种，抗低温糖化的马铃薯品种是非常重要的一- 项内容。 1 2 4 支链淀粉与低温糖化 淀粉粒中支链淀粉构成淀粉粒中的无定形区部分，而直链淀粉则组成结晶区域，无定形 区部分是酶解的敏感区域【8 1 】【8 2 1 ，结晶区则是抗酶解的，支链淀粉的高度分支阻碍了分子内和 5 分子间的氢键形成，使淀粉结构不稳定，所以在淀粉降解途径中，支链淀粉是一些磷酸化酶 与转化酶等的主要作用区域。l e s z k o w i a 的研究发现，在容易被低温糖化的马铃薯品种的淀粉 粒结构中，直链淀粉支链淀粉的比值相对于不易被低温糖化的其他马铃薯品种小很多，通过 光镜与电镜的观察发现，易被低温糖化品种的淀粉粒被酶大量分解【8 1 1 。此外，在马铃薯的低 温储藏过程中，由于淀粉的降解途径，最终，不但形成一些还原糖成分，还会大量降低薯块 中的淀粉含量。终上所述，可以将淀粉组分与低温糖化的联系归结为：1 支链淀粉含量越高， 淀粉的结构越不稳定，从而容易被一些磷酸化酶与转化酶所作用导致低温糖化。2 低温处理 后，由于低温糖化，随着还原糖含量的增加淀粉含量会降低。 1 3 1 淀粉代谢过程 1 3 马铃薯淀粉代谢 淀粉是碳水化合物的主要储存体，在光合及非光合组织都有合成，叶绿体和造粉体是淀粉 合成的主要场所。叶绿体中，淀粉在光照下合成、黑暗中分解及转运到植物的其它部位，贮 藏时间较短，称为转运淀粉。而造粉体中，合成的淀粉能够稳定积累达几个月甚至几年，称 为贮藏淀粉，人类利用的淀粉主要是贮藏淀粉。无论在叶绿体还是在淀粉体中，淀粉的合成 与分解都需要以下几种酶的协调催化，即腺嘌呤葡萄糖焦磷酸化酶( a d g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e ，a g p a s e ) 、淀粉合成酶( s t a r c hs y n t h a s e ，s s ) 、淀粉分支酶( s t a r c b r a n c h i n ge n z y m e ，s b e ) 、 脱分支酶( s t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e ，d b e ) 、液泡转化酶( i n v e r t a s e ) 。 淀粉合成途径中，在焦磷酸化酶( a g p ) 的作用下，葡萄糖1 磷酸( g l u 1 p ) 与a t p 作用 生成a d p 葡萄糖( a d p g l u ) ，随后a d p g l u 在淀粉合成酶( 髂) 的作用下进行链的延伸。淀粉 合成酶可以分为两种，即可溶性淀粉合成酶( s s s ) 和颗粒结合型淀粉合成酶( g b s s ) ，在 这两种酶的催化作用下，a d p 葡萄糖分别形成可溶性直链淀粉与颗粒型直链淀粉。在淀粉合 成酶( 鼹) 的作用下，a d p 葡萄糖链达到一定长度后，在淀粉分支酶( 艇冱) 作用于可溶性 直链淀粉上，在其线性链之间引入a 1 ，6 糖苷键形成分支，进一步形成支链淀粉。最后淀粉脱 分支酶( d b e ) 对两种淀粉进行修饰，合成具有一定结构特性的淀粉结晶体1 2 1 。 淀粉分解途径中，淀粉体首先通过淀粉磷酸化过程变成葡萄糖1 磷酸( g l u 1 p ) ，葡萄糖 6 1 。磷酸在磷酸葡糖变位酶的作用下形成葡萄糖6 磷酸，葡萄糖6 一磷酸在一系列异构酶的作用 下成为细胞容易吸收的果糖6 一磷酸，进一步在磷酸葡糖变位酶和u d p g 焦磷酸化酶的作用下 成为u d p 葡萄糖。接下来蔗糖磷酸酶利用两个前体一果糖6 磷酸和u d p 葡萄糖合成蔗糖6 磷酸，蔗糖6 磷酸又在蔗糖合成酶的催化下形成蔗糖，蔗糖通过植物的呼吸作用，在液泡转 化酶的作用下分解为两种还原糖成分一果糖与葡萄糖。淀粉的分解途径中，淀粉的磷酸化一 直是人们所关注的焦点。淀粉磷酸化是伴随着一系列酶的协同参与下完成的复杂过程，n i e l s e n t h 等利用同位素标记法，揭示了淀粉磷酸化地全部过程，并指出一种叫葡聚糖水合激酶 ( g 肋) 在淀粉的磷酸化过程中起到了关键作用。 淀粉的合成与降解途径如下图1 1 所示： 图1 1 马铃薯淀粉代谢途径 f i g u r e l 1t h em e t a b o l i cp a t h w a yo f p o t a t os t a r c h 1 3 2 淀粉代谢相关的酶 酸 a d p 葡萄糖焦磷酸化酶( a d p - g i u p p a s e ，a g p a s e ) 植物淀粉合成的第一个关键酶是a d p 焦磷酸酶( a g p a s e ) ( o k i t a ，1 9 9 2 ) 【3 1 ，催化1 磷 酸葡萄糖和a t p 生成a d p 葡萄糖，作为淀粉合成酶的底物参与直链和支链淀粉的合成，该反 应是淀粉生物合成的重要调节点。a d p 焦磷酸酶( a g p a s e ) 存在于淀粉贮藏器官及植物叶中 【4 】i s 】。植物中，a g p a s e 受变构调节，3 磷酸甘油酸( 3 p g a ) 与无机磷酸( p i ) 的比率改变其 活性，从而调节淀粉合成( p r d s sc ta l ，1 9 9 1 ) 。3 - p g a 及其类似物被称为激活因子，p i 贝j j 被 称为抑制因子，两者统称变构因子( a l l o s t e r i ce f f e c t o r s ) ( g o m e zc a s a t i ，2 0 0 2 ) 。 a g p a s e d a 4 个亚基组成，细菌中，该酶i 由g l g c 基因编码，为同源四聚体 6 1 ；高等植物中的 a g p a s e 是异源四聚体，由2 个大亚基和2 个小亚基组成。a g p a s e 的分子量在2 0 0 2 4 0k d a 之间， 且不同植物的a g p a s e 的大、小亚基有差异。两个小亚基的m r 为5 0 0 0 0 - - - 5 5 0 0 0 ，两个大亚基的 m r 为5 1 0 0 0 - - 6 0 0 0 0 ( m i i l l e r - r o b e re ta l ，1 9 9 4 ) 。现在，许多植物j a g p a s e 的大、小亚基被分 离纯化，并获得了相应的c d n a 序列和基因组d n a 序列。如已在拟南芥叶片，小麦、大麦和 玉米胚乳，马铃薯块茎，水稻种子等中确定了a g p a s e 的大小亚基序列，同源比对后发现，不 同植物的小亚基序列同源性高于大亚基，且小亚基的底物结合与变构激活相关区域是保守的， 而大亚基相对变幅较大，这可能与大小亚基苞, l g p a s e 中承担不同的功能有关。小亚基被认为 是酶的活性中心，大亚基是酶的调节中心。大亚基分为两类：光合作用组织的大亚基和非光 合作用的大亚基【_ 7 1 。植物不同组织或器官中表达的大、小亚基是不同的，这是植物砌g p a s e 酶的重要调节方式，从而形成不同结构的a g p - a $ e 酶，表现出对变构调节物不同的敏感性。 s t a r k 等【8 】( 1 9 9 2 ) 通过提高植物体内a g p a s e 活性来实现提高淀粉含量的目的。他们利用 突变的大肠杆菌k 1 2 株系6 1 8 来源的a g p a s e 基因菩g e l 6 ( 对变构调节不敏感) 连接来源于拟南 芥的r u b p 羧化酶小亚基的叶绿体转运肽( c h l o r o p l a s tt r a n s i t p e p t i d e - c t p ) 基因f f 口p a t a t i n 启动 子，转化马铃薯品种r u s s e tb u r b a n k 。在转基因植株中，糖原积累速率明显提高，进而提高了 淀粉含量。种植在实验室中的转基因马铃薯块茎中淀粉含量和干物质含量比未转化对照高出 3 5 - 6 0 。 淀粉合成酶( 鼹) 淀粉合成酶是一个葡萄糖转移酶，它以寡聚糖为前体，a d p 葡萄糖为底物，通过a 1 ，4 糖苷键不断增加寡聚糖的葡萄糖单位，最终合成以a 1 ，4 糖苷键连接的聚糖，该酶是多型性酶， 定位于叶绿体和淀粉体。 淀粉合成酶，根据与淀粉粒结合的紧密程度及与底物的催化特异性，可分为颗粒结合型 淀粉合成酶( g r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ，删) 和可溶性淀粉合成酶( s o l u b l es t a r c h s y n t h a s e ，s s s ) ，g b s s 与淀粉粒紧密结合在一起，而s s s - 与淀粉粒结合程度较弱。淀粉合成酶 在淀粉的生物合成途径中与淀粉分支酶( 船e ) 一起催化淀粉的直接前体a d p 葡萄糖或u d p 8 葡萄糖的葡萄糖基转移至g t 1 ，4 葡聚糖的非还原末端形成直链淀粉( a m y l o s e ) 和支链淀粉 ( a m y l y p e c t i n ) 。淀粉合成酶存在多种同工型，在形成淀粉最终结构的过程中所起的催化作 用不同。根据编码这些同工型基因的c d n a 和以此推定的氨基酸序列的同源性差异将其分为： g b s si 、删i i 、黜i 、鼹s 1 i 、弧钳i i 等。 颗粒结合型淀粉合成酶( a b s s ) 颗粒结合型淀粉合成酶( g b s s ) 是与淀粉粒结合的，与直链淀粉合成直接相关的酶。根据 在不同组织中表达水平的不同，g b 镕基因可以分为g b s si 和觥，颗粒结合型淀粉合成 酶多数时候是指g b s si 酶。g b s si 是研究最多的淀粉合成酶，w a x y 蛋白就是禾谷类植物中 的这类酶。g b s s1 分子量约为6 0 k d a ，现在g b s s i 基因已从玉米、小麦、水稻、马铃薯、豌 豆中得到，且基因序列已经确定。对g b s s i 突变体( 如禾谷类的w a x y 突变体【9 】、马铃薯的a m f 突变体1 0 】以及豌豆的l 锄突变体【1 1 】) 的分析表明，当植物体内缺乏g b s s i 蛋白时，随后合成 的淀粉便缺乏直链淀粉；利用反义r n a 技术特异地抑制植物体g b s s i 基因的表达，降低g b s s i 酶的活性，结果导致植物体内淀粉中直链淀粉含量下降。 在植物的非贮藏器官或组织中，如果皮、叶片、茎和根中也有淀粉粒，这些器官中的淀粉粒 与贮藏器官中的淀粉粒的理化特性不同。这些组织中，合成直链或支链淀粉的关键酶是 g b s s i i ，g b s s i i 蛋白分子量l g g b s si 大，在7 0 - 1 0 0l a 之间。目前已从马铃薯块型1 2 1 ；豌豆胚 【1 3 】等中克隆了相应的g b s s i i 基因。与g b s si 蛋白氨基酸序列比较分析表明，g b s - s i i 有一个 额外的n 末端区域，以三个连续的脯氨酸结尾。在功能上g b s s i i 与支链淀粉的亲和性更高，可能 参与支链淀粉的合成【1 4 1 。 此外，关于g b s s 基因启动子区域也非常值得进一步的研究。在植物中，g b s s 基因的表 达有严格的组织表达特异性，比如水稻g b s s 基因只在胚乳和花粉中表达，且在胚乳中表达 量是花粉的5 0 倒1 5 1 。玉米中的g b s si 基因仅在胚乳、花粉、胚囊中表达，具有很强的专一 性。马铃薯与玉米和水稻不同，不同组织( 叶片、悬浮培养物、匍匐茎以及块茎) 中均发现 g b s si 表达，其中块茎与匍匐茎中最为丰富，是叶片中的4 0 倍【1 6 1 。这种组织专一性表达与 其启动子区域有着紧密的联系，在马铃薯中，0 8k bg b s s 基因启动子驱动的g u s 基因在匍 匐茎和块茎中高表达，比叶片高1 2 5 3 3 5 0 倍，叶、茎和根中低表达【1 7 】；0 4k b g u s 亦表现块 茎专一表达，而且高浓度蔗糖等因素可诱导g b s s 启动子的高水平表达【l8 】；但宋东光等认为： 0 4k b 和0 8k b 的g b s s 启动子并不表现强的块茎专一性，1 6 k b g b s s 启动子才开始表现块 茎表达专一性，只有2 9 k b g b s s 启动子才表现出最强烈的块茎表达专一性，而且块茎中g u s 活性基本上都比茎段高出了一个数量级以上，也大大高于植物中公认的高表达启动子3 5 s 启 9 动子【1 9 】 2 0 1 。这些研究结果提示，在g b s s 基因上游顺序可能存在一些调控元件，器官特异性 的表达抑制可能是块茎专一表达的一种机理。 马铃薯中直链淀粉的合成与g j 脚切相关2 1 】【2 2 1 ，马铃薯块茎淀粉的直链淀粉含量为 2 0 - - 2 5 ，颗粒结合型淀粉合成酶( 6 b s s ) 基因是马铃薯中唯一与块茎直链淀粉合成有关的 基因，它的突变可以造成直链淀粉合成缺吲2 3 1 ，马铃薯中g b 船i 基因为单拷贝，结构基因长 3k b ，有1 3 个内含子，其中第一内含子在不翻译的前导区( c h r i s t i n ee ta l ，1 9 9 8 ) ，v i s s e r 等 用反义r n a 技术抑制直链淀粉的合成，结果g b 孓湛因活性被抑制了7 0 - - 1 0 0 ，同时马铃薯 薯块中支链淀粉的含量降低了9 0 以上【2 4 1 。g b 船基因的转录呈块茎专一性，块茎的转录水平 比叶的转录水平高l o 倍 2 s l ，而且在受蔗糖诱导后，表达量可增加3 0 5 0 l 型2 6 】 i 口 。 可溶性淀粉合成酶(