（分析化学专业论文）硫酸铈（Ⅳ）罗丹明6g酚类化合物体系化学发光及其分析应用.pdf

中国科学技术大学博 学位论文 摘要 摘要 本论文综述了化学发光( c l ) 的发展历史及特点、基本原理、化学发光体系、 联用技术及分析应用和酚类化合物测定方法的研究进展。基于酚类化合物对硫酸 铈( i v ) 一罗丹明6 g 体系的化学发光具有增强作用，本论文以深入认识硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 一酚类化合物化学发光体系的规律、机理和分析应用潜力为出发点， 通过详细分析化学发光反应的动力学过程、化学发光光谱、荧光谱和紫外一可见 吸收光谱，提出了该体系的化学发光枫理；用流动注射一化学发光( f 卜- c l 联 用技术系统研究了3 2 种酚类化合物的化学发光强度和分子结构之间的关系，总 结出酚类化合物对硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 体系化学发光的影响规律；为了发展 高灵敏度的液相色谱化学发光检测器，在硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 一酚类化合物 化学发光体系的宽响应范围的基础上，建立了一系列酚类化合物的f i a c l 和高 效液相色谱一化学发光( h p l c c l ) 分析法。本论文取得的主要研究成果如下： 1 基于硫酸铈( i v ) 和罗丹明6 g 在硫酸介质中可以发生氧化还原反应，产生微 弱的化学发光，用f i c l 联用技术系统研究了5 3 种令人感兴趣的不同分子 结构的有机物对硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 体系化学发光的影响。结果表明： 苯环上的酚羟基是必需基团，且共有3 2 种酚类化合物可以增强该体系的化 学发光：各种酚类化合物的化学发光强度的大小与其苯环上的取代基种类和 位置有关，分别总结出了苯酚、多酚、酚酸、羟基肉桂酸和类黄酮五大类化 合物对该体系化学发光的影响规律。通过详细研究化学发光反应的动力学过 程、化学发光光谱、荧光谱和紫外一可见吸收光谱，提出硫酸铈( i v ) 一罗丹 明6 g 一酚类化合物体系的化学发光机理为：在酸性介质中，硫酸铈( i v ) 氧 化了罗丹明6 g 和酚类化合物，同时自身被还原为铈( i i i ) 。硫酸铈( i v ) 和酚 类化合物之间的反应速度比硫酸铈( i v ) 和罗丹明6 g 之间的反应速度快，因 而酚类化合物的存在可以加速激发态的铈( i i i ) 的产生。最后，能量从激发 态的铈( i i i ) 转移给罗丹明6 g ，将罗丹明6 g 分子激发，激发态的罗丹明6 g 分子辐射跃迁回到基态，发出波长为5 5 5n m 的特征光，各种酚类化合物的 不同化学发光行为可能与其氧化产物相关，据此提出了硫酸铈( i v ) 一罗丹明 中国科学技术大学博士学位论文 摘要 6 g 一酚类化合物的化学发光反应存在二个竞争的反应路径。最后，用f i c l 分析法研究了该发光体系的分析潜力，分别对2 5 种酚类化合物进行了测 定实验，其检测限的范围为o 4 4 4 2 0n g 珩l 。 2 基于豆蔻明对硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 体系的化学发光的增强作用，建立了 一种新颖的测定豆蔻明的f i c l 分析法，其线性范围为1 o 1 0 。8 8 o 1 0 6 9 m 1 ，检测限为8 8 1 0 4 9 m l 。该法与文献报道的仅有的一种高效液相 色谱分离紫外检测法( h p l c u v ) 相比，该法检测豆蔻明的线性范围更宽、 灵敏度更高，丰富了豆蔻明的测定方法；成功应用于中草药草豆蔻中的豆蔻 明含量的测定。 3 基于葛根素对硫酸铈( ) 一罗丹明6 g 体系的化学发光的增强作用，建立了 一种新颖的测定葛根素的f i c l 分析法。葛根素浓度( o 的对数值与其 净化学发光强度( 4 d 的对数值在1 3 x1 0 母一8 0 1 7 9 m 1 范围内呈现良 好的线性关系，检测限为8 4 10 - g m l ，相对标准偏差为1 8 6 。该法的 检测限比文献报道的紫外( u v ) 和电化学( e c ) 检测法均低了二个多数量 级。本实验方法已成功应用于葛根素注射液中的葛根素定量分析，每小时可 以测定1 2 0 个样品溶液。 4 基于黄酮醇可以增强酸性介质中硫酸铈( i v ) 一罗丹明6 g 体系的化学发光， 以及此化学发光体系与h p l c 流动相的良好兼容性，首次建立了一个同时测 定槲皮素、山萘酚和异鼠李素的h p l c c l 新方法。该法采用的流动相为 甲醇和1 o 乙酸的混合物，在等度洗脱模式下对所测试的三种黄酮醇进行 了很好的基线分离。该法测定槲皮素、山萘酚和异鼠李素的线性范围分别为 6 ox1 0 。8 7 o 1 0 。5 ，6 ，o 1 0 9 7 o 1 0 。6 和3 o 1 0 。8 7 o 1 0 5g m l ，均 达到了三个数量级以上；其检测限分别为1 6 1 0 一，3 5 l o 母和6 5 1 0 母 g m l ，明显优于文献报道的紫外检测法( u v ) 和蒸发光散射检测法( e l s d ) 的线性范围及检测限。本实验方法成功用于测定中药制剂心达康胶囊和沙棘 颗粒中黄酮醇的含量。 5 基于硫酸铈( ) 一罗丹明6 g 一酚类化合物化学发光体系的宽响应范围，建 i i 中国科学技术火学博士学位论文摘要 立了一种高选择性和高灵敏度的同时测定2 0 种酚类化合物的h p l c c l 新 方法。该方法测定2 0 种酚类化合物的检测限范围为1 5 8 2 ，ln 咖l 。对比 d a d 和c l 的检测限，化学发光法的检测限均低于d a d 测定的检测限。该 化学发光体系与h p l c 流动相的兼容性良好，为h p l c 同时测定复杂体系中 的多种酚类物质提供了一个简单、快速和高灵敏度的方法。该法检测实际样 品时无需预浓缩或任何衍生步骤，已经成功应用于红葡萄酒中的酚类化合物 的定量分析。 6 发现几种对羟基苯甲酸酯在强酸介质中可以增强硫酸铈( i v ) 罗丹明6 g 体 系的化学发光。在此基础上，首次建立了一个同时测定对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的h p l c c l 新方法。本法采用的流动相为甲醇一水( 6 0 ：4 0 ，v v ) ，四种酯通过等梯度沈 脱在& 5 分钟内快速完成了基线分离。其线性范围均达到了三个数量级以上， 其检测限分别为1 9 、2 7 、3 9 和5 3n g m 1 。由于该法采用等梯度洗脱，检 测不同样品时不需要花费过长的时间去平衡分析柱，故该法又具有检测速度 快，效率高的优点，有利于实际应用中批量测定复杂基体中的单一或者多种 痕量对羟基苯甲酸酯。该方法检测实际样品时无需预浓缩或衍生步骤，已成 功应用于化妆品和食品中的多种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的定量分析。 关键词：硫酸铈( i v ) 罗丹明6 g 酚类化合物化学发光流动注射分析高效液 相色谱黄酮对羟基苯甲酸酯 儿l 中国科学技术大学博上学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h em s t o c h a r a c t e r i s t i c s ，p r i n c i p 王e ，m e 出o d o i o g ya n da n a i ”i c a ia p p i i c a t i o no f c h e m i l 啪i n e s c e n c e ( e l ) w e r er e v i e w e d a 1 s o ，m ea d v a n c ei na n a l y h c a lm e t h o d so f p h e n o l i cc o l p o 吼d s ( p c s ) 、 邯s u m m a r i z e d i tw a sf o l l l l dm a tp c sc o u l de n h a f l c et h c c lo fc e r i 啪( i v ) - r h o d 锄i n e6 gs y s t e mi ns u l f i m ca c i dm e d i 啪o nt l l i sb 髂i s ，t l l i s d i s s e r t a t i o nf o c u s e so nt l l es t u d i e so ft t l ec lm e c h 趾i s ma n da 1 1 a l y t i c a lp o t e n t i a lo f c e r i u m ( i v ) - r h o d a m i n e6 g - p h e n o l i cc o m p o u n dc ls y s t e m t h em a i nr e s u l t so ft h j s s t u d ya r e 粥f o l l o w s ： 1 丁h eo x i d a t i o nr e a c t i o nb e t w e e nc e r i 啪( i v ) a n dr h o d 跏i n e6 gi ns m 蹦ca c i d m e d i 啪u n d e r 、v e n tw e a kc l t h ee 疏c t so f 5 3o r g a n i cc o m p o u n d so f i n t e r e s to n c e r i 哪( i v ) 一r h o d 锄i n e6 gc lw e r ei n v e s t i g a t e db yan o w 两e c t i o n ( f i ) p r o c e d u r e ，a n d3 2p c sw e r ef o u n dt oe n h a n c ec lp c sm a i n l yi n c l u d ep h e n o i s ， p o i y p h e n o l s ，p h e n o l i ca c i d s ，h y d m x y c i l l i l a m i ca c i d sa j l df l a v o n o i d s t h e c o r r e l a t i o nb e t 、 ，e e nc la n dm o l e c u i a rs t m c t u r ew a ss y s t e m a t i c a i l ys t u d i e d ，i t w a sn o t e 、v o n l l yt l l a tp h e n 0 1 i ch y d r o x y l sw e r et h em a i na c t i v eg m u p s 缸t h e g e n e r a t i o no fcl n em a g n i t u d eo fc lw a s 驿l a t e dt ot h et y p ea i l dp o s i t i o no f s u b s t i t u e n t si nt h eb e n z e n er i n g b a s e do nt h em l d i e so fl i n e t i cp r o c e s sa 1 1 dt h e s p e c 打a o f c l ， n u o r e s c e n c ea n du v v i s i b l e a b s o r p t i o n ， t 1 1 e c e r i u m ( i v ) 一r h o d a m h 蟛6 g p h e n o l i cc o m p 0 1 l f l dc lm e c h a n i s m h a sb e e n p r 叩o s e dt ob ed u et ot 1 1 a tr h o d a m i n c6 ga i l dp h e n o l i cc o m p o u n d a r eo x i d i z e d b y c e r i 啪( ) i ns u l 缸i ca c i dm e d i u mt of o n nn 坨e x c i t e d s t a t ec e r i u m ( i i i ) t h e r e a c t i o nr a t eb e t w e e nc e r i u m ( i v ) a n dp h e n o l i cc o m p o u n di sf a s t e rt 1 1 a nm a to f c e r i u m ( i v ) 谢t hr h o d a i n i n e6 g l u s ，t h ep r e s e n c eo fp h e n o l i cc o m p o u n dc a n a c c e l e r a t em eg e n e r a t i o no ft h ee x c i t e d s t a t ec c r i 啪( i i i ) ，a i l dt l l e ne n e r g yi s t r a n s f e e d 盘mc e r i u m ( i ) t or h o d a m i n e6 gt of o mt l l ee x c i t e d s t a t e r b o d a i n i n e6 gw h i c he m i t si t sc h a r a c t e r i s t i cr a d i a t i o na t5 5 5 哪m o r e o v e r t l l e r cm i 曲tb et 、v oc o m p e t i t i v ep a t l l w a y si nm ep r e s e n tc ls y s t e m f i n a l l y t h e a n a l ”i c a lp o t e r n i a lo ft h i sc ls y s t e mw a se x p l o r e db yaf ip r o c e d u r e ，a n d2 5 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t p c sw e r ed e t e c t a b l ea tt h er a l l g eo f o 4 4 4 2 0n m l 2 b a s e do nt h ec le n h a i l c e m e n tb yc a r d 跚o n i no fm ec e f i u m ( i v ) r h o d 锄i n e6 g s y s t e m ，af i c lm e t h o d h a sb e e nd e v e l o p e dt od e t e n n i n ec a r d a n l o n i n t h el i n e a r r a n g ei s 矗0 4 n1 o lo 。8t o8 oxl o 6g ，i n l ，a f l dt h ed e 白。c t i o nl i m i tw a s8 8 1 0 _ 9 m lc a r d 锄o n i n i nc o m p a r i s o nw i t ht h er e s u l t sf 而mt h ep r e v i o u s l yr e p o r t e d h p l cm e m o d ，w h i c hi st h e0 1 1 王ym e t h o du s i n gf o rt h ed e t e m l i n a “o no f c a r d a m o n i n ，w i d e rj i n e a r 舢g ea 1 1 dl o w e rd e t e c t i o ni i m i tw e r ea c h i e v e d t h e a p p l i c a b i l i t yo ft h i sm e t h o dw a sd e m o n s t r a t e db yt h ea n a l y s i so fc a r d a m o n i ni n a ! p n i ak n f s l t m o d a ih d y n l c t b a s e do nt h ec le n h a l l c e m e n tb yp u e r “no ft 1 1 ec e r j u n l ( i v ) 一r h o d a n l i n e6 g s y s t e m ，as e n s i t i v ea r i ds e l e c t i v ef i c lm e c h o df o rt h ed e t e n n i n a t i o no fp u e r a f 。i n w a se s t a b l i s h e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d j t i o n s t h ep r o p o s e dp r o c 砌u r eh a sa l i n e a rr a n g eb e t w e e n1 3 1o 一9a n d8 o 10 7 咖l ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f8 4 l o 1 0 m 1p u e r a r i na n dar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f1 8 6 i nc o m p a r i s o i l w i t ht h er e s u l t sf 而mt h ep r e v i o u s l yr e p o n e dm e t h o d sw i t hu va n d e l e c t r o c h e m i c a l ( e c ) d e t e c t i o n ，t h i sd e t e c t i o nl i m i t 、a s1 0 、v e rm o r et h a nt w o o r d e r so fm a g n j t u d e ，r h em e t h o dw a ss u c c e s s f m l ya p p h e dt ot h ed e t e m i n 蕊o n o fp u e r a r i ni n 叫e c t i o n t h es a m p l es o l u t i o n sc a nb ea n a l y z e da tar a t eo f l2 0 s a m d l e sh 一 4 an o v e lh p l c c lm e t l l o dh a sb e e nd e v e 】o 口e df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e m l i n a t i o no ft h r e en a v o n o l s i n c l u d i n gq u e r c e t i n ，k a e m p f e r o l a n d i s o r h a m n e t i n t h op r o c e d u r ew a sb a s e do nt h ec h e m i l u m i n e s c e n te n h a n c e m e n t b yf l a v o n o l so ft 1 1 ec e r i 啪0 v ) 一r h o d 锄i n e6 gs y s t e mi ns u l 铀j ca c i dm e d j u m t h ec lr e a c t i o nw a sw e l lc o m p a t i b l ew i t hm em o b i l ep h a s eo fh p l c t h eg o o d s e 口a r a t i o nm sa c h i e v e dw i t ha ni s o c r a t i ce l u t i o nu s i n gam i x t u r eo fm e t h a n 0 1 a n da q u e o u s1 o a c e t i ca c i d ，u n d e rt h eo p t i m j z e dc o n d i t i o n s ，al i n e a r 、v o r k i n g r a n g ee x t e n d s3o r d e r so fm a g n i t u d e 撕t hr e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n sb e l o w 4 5 ，a n dd e t e c t i o nl i m i t sw e r e1 6 1 0 一，3 5 1 0 9 ，a n d6 5 1 0 1 9g m lf o r v 中国科学技术大学博 学位论文 q u e r c e t i n ，k a e m p f e r o la n di s o r h 锄n c t i n ，r e s p e c t i v e l y t h ep r o p o s e dm e t h o dh a s 、v i d e rl i n e a rr a j l g ea 1 1 dl o w e rd e t e c t i o nl i m i tt h a i lt h o s eo ft h er e p o n e dh p l c m e m o d su s i n gu vd e t e c t i o na i l de v a p o r a t i v el i g h ts c a t t e r i n gd e t e c t i o n ( e l s d ) t h ep r o p o s e dm e t l l o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p h e dt ot h ed e t e r 】n i n a t i o no f t h r e e a c t i v en a v o n o l si ns h a j ig r a 士1 u l ea 1 1 dx i n d a l ( a 1 1 9c a p s u l eb yas i m p l ee x t r a c t i o n d r o c e d u r e 5 b a s e do nm ec le n h a n c e m e mb yp c so ft h ec e r i u m ( i v ) 一r h o d 啪i n e6 gs y s t e mi n s u l 向r i ca c i dm e d i 啪，as i m p l e ，s e i e c t i v ea n ds e n s i t i v ed e t e 咖i n 融i o nm e t h o do f 2 0p c sh a sb e e nd e v e l o p e du s i n gh p l cw i t hc ld e t e c t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i t s o f2 0p c sw e r ea tt h er a n g eo f1 5 - 8 2 1n m 1 ，w h i c ha r el o w e rt h a nt h o s eo f d a d t h u s ，t h ep r o p o s e dh p | l c c lm e t h o dc a nb eu s e dt od e t e 珊i n ep c sa t t m c el e v e l i nd i f r e r e n tm a t r i c e s m o r e o v er t h ec lr e a c t i o nw a sw e l lc o m p a t i b i e w i t ht h em o b i l ep h a s eo f h p l c t h em e t h o da l l o w sf o rt h es i m u l t a n e o u sa n d s e n s i t i v ed e t e c “o no fp c si nr c dw i n ew i t h o u tp r c c o n c e n t r a t i o no rd e r i v a t i z a t i o n s t e d 6 an e wm e t h o df o r t h es i m u i t a n e o u sd e t e 舯i n a t i o no fp a m b e n si n c i u d i n g m e t h y l p a r a b e n ，e t h y l p a m b e n ，p r o p y l p a r a b e n ， a n d b u t y l p a r a b e nb y h p l c c o u p l e dw i t hc ld e t e c t i o nw a sf o rt h ef i r s tt i m ed e v e l o p e d t h ep r o c e d u r ew a s b a s e do nt h ec h e m “u m i n e s c e me n h a n c e m e n t b yp a r a b e n s o ft h e c e r j u m ( i v ) 一r h o d a m i n e6 gs y s t e mj nt h es t o n gs u l 如r i ca c i dm e d i u m t h eg o o d s e p a r a t i o no fp a r a b e n sw a sc a r r i e do u tw i t ha ni s o c r a t i ce l u t i o nu s i n gam i x t u r e o fm e t h a n o la n dw a t e rw i t h i n8 5m i n u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，al i n e a r w o r k i n gr a l l g ee x t e n d s3o r d e r so f m a gn i t u d e ，a 1 1 dt h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e1 9 1 0 一，2 7 1 0 一，3 9 l o 。9 ，a n d5 | 3 1 0 。9 m lf o rm e t h y l p a r a b e n ，e t h y l p a r a b e n ， p r o p y i p a r a b e n ，a n db u 哆l p a r a b e n ，r e s p e c t i v e i y t h ec lr e a c t i o nw a sw e l l c o m p a t i b l ew i t ht h em o b i l e 曲a s eo fh p l c t h ep m p o s e dm e t h o dh a sb e e n s u c c e s s f u l j ya p p i i e dt ot h ea s s a yo fp a r a b e n si nw a s h o f fc o s m e t j cp r o d u c t sa n d f o o d s 、v i mt h em i n i m a ls 枷p l ep r e p a r a t i o n v i 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 第一章综述 第一节化学发光分析概述 1 化学发光的发展历史及特点 1 1 化学发光的发展历史 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n e c e ，c l ) 作为一种自然现象很早以前就为人类 所注意 1 。最早发现的化学发光现象发生在生物体内，如萤火虫和一些海洋生 物的发光。由生物体发出的可见光被称为生物发光( b i o l u m i n e s c e n e c e ) 。发光 生物体广泛存在于自然界，大约有1 3 大类近千种。自然界也存在着丰富多彩的 发光现象，大气上空的晚霞是最常见的一种气体化学发光。1 5 世纪，德国医生 b r a n d 发现某种“白色磷光体”能在黑暗中持续发光，此现象被广泛地关注。 b o y l e 对氧气的研究为正确理解和观察化学发光和生物发光现象开创了一个新视 角，他于1 6 6 3 年提到磷的发光可能需要氧气的参与 2 。到了1 9 世纪后期，人 们发现简单的非生物有机化合物也能产生化学发光现象。1 8 7 7 年，r a d z i s z e w s k i 证实在乙醇一氢氧化钾溶液中洛粉碱( l o p h i n e ，2 ，4 ，5 三苯基眯唑) 被过氧 化氢等试剂氧化发出绿色的光 3 ，这种试剂至今仍然被普遍使用。但是，直到 十九世纪末期，德国科学家w i e d e m a 肌才首次解释了化学发光的机制，他把这种 发光现象归属于一种相对简单的有机反应过程 4 。 对化学发光真正丌始进行大量的研究始于2 0 世纪初。1 9 0 1 年，法国生物学 家d u b o i s 引入了荧光素( l u c i f c 血) 和荧光素酶( l u c i f e m s e ) 的概念 5 。1 9 2 2 年，k a u t s k i 研究了强氧化剂作用于硅氧烷所产生的光辐射 6 。1 9 2 7 年，m a l l e t 认为次氯酸盐与过氧化氢之间的反应可以将能量转移给一些磷光或荧光物质如 曙红、荧光黄、葸和奎宁，从而产生化学发光 7 。 广泛用于血迹鉴定的鲁米诺( l u m i n o l ，3 一氨基二甲酰肼) 发光试剂早在 l o o 多年前的1 9 0 2 年由s c h m i t z 合成而得，1 9 2 8 年，a 1 b r e c h t 观察到鲁米诺在 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 碱性介质中的化学发光行为 8 。这一试剂的合成和发光现象的发现，对于化学 发光发展成为分析化学的一种重要手段起到了重要的作用。1 9 3 5 年，g 1 e u 和 p e t s c h 报道了光泽精( l u c i g e n i n ，n ，n 一二甲基二丫啶硝酸盐) 与过氧化氢反应 产生化学发光 9 。 然而，由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学发光研究 主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机理的探讨上，其发展一直比较缓 慢。1 9 4 5 年出现了光电倍增管，1 9 5 0 年出现了商品化的化学发光检测装置。直 到2 0 世纪6 0 年代，随着电子技术的迅速发展和集成电路的广泛使用，使过去难 以测试的微弱光的检测成为可能，化学发光才迈进定量分析研究的时代。到了八 十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴起，化学发光才被真正应用于 分析化学并迅速得到了发展 1 0 1 2 。目前，化学发光分析的研究和应用已经成 为当前微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法 1 3 一1 5 。 从2 0 世纪6 0 年代的气相色谱、7 0 年代的液相色谱、8 0 年代的毛细管电泳 到9 0 年代的微流控芯片等分离技术的出现，为化学发光这一高灵敏度检测技术 提供了用武之地。近年来，高效液相色谱化学发光检测的分析方法、化学发光成 像技术、化学发光免疫分析法和生物的超微弱发光在生命科学、临床医学和环境 化学等许多领域的应用都已成为研究热点。 1 2 化学发光的特点 化学发光分析法不需要外部光源，消除了瑞利散射和拉曼散射，同时也克 服了光源不稳定而导致的波动的缺点，从而降低了噪声，提高了信噪比。 ( 1 ) 灵敏度高。化学发光分析法突出的优点就是具有极高的灵敏度。化学 发光分析的检测限一般可达l o 一8 一l o o m o l l ，少数可达】o 啪m o l 几。如用荧光 素酶和磷酸三腺苷( a t p ) 的化学发光反应，可测定低至2 o 1 0 - 1 7m o l l 的a t p ， 即可检出一个细菌中的越r p 含量。 ( 2 ) 仪器设备简单。由于不需要外加光源及单色器等，没有散射光及杂散 光等引起的背景值，因此仪器简单，操作方便，且价格低廉，易于推广。 ( 3 ) 分析速度快。由于多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即可 2 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 完成，因而发光分析的一次测定可在一分钟内完成。若与流动注射技术联用，每 小时可分析测定9 0 一1 2 0 个样品。 ( 4 ) 线性范围宽。化学发光为发射过程，特征衄线通常与活度呈线性关系。 化学发光分析的线性范围一般在2 4 个数量级。 ( 5 ) 易于自动化。适合与h p l c 和h p c e 等其它的分离技术联用，作为其高 灵敏度的检测器。 2 化学发光的基本原理 2 1 化学发光的理论基础 产生化学发光的能量来源于化学反应，虽然很多化学反应能释放出能量，但 并不是所有的能释放出能量的化学反应都能产生化学发光。一个化学反应要产生 化学发光现象，必须满足以下三个条件：一是化学反应必须释放出足够的能量可 以使某种反应产物或中间体到达激发态；二是反应历程必须有利于形成激发态产 物；三是这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或者能够将其能量转移 给共存的某种荧光物质，产生光辐射。 化学反应激发后的激发态电子回到基态的过程中可能有许多途径，这一过程 和光致发光是完全雷同的。激发态的电子可以通过碰撞失活、振动、转动和系间 跨跃等多种形式释放能量，所有这些过程与发光过程竞争进行 1 6 ，如图1 一l 所示。因此，化学发光有个发光效率问题，其发光效率( 中c l ) 可表达为： 西c l = 巾c m e 中f 中c l 为化学发光效率；中。为化学发应效率，即表示某一化学发应完成程度：西。 为分子激发效率，它是处于激发态分子与化学发应产生的能量应激发的分子总数 相比较所得；嘶为发光体的荧光效率或磷光效率。 发光效率最高的是生物发光反应，可以接近于1 ，例如：萤火虫素发光体系 的m c l 高至o 8 8 1 7 。化学发光的发光效率比较低，很少超过o 0 l ，西c l 达到 o 0 1 都是很强的化学发光了，大多数化学发光的发光效率都大约在1 0 _ 8 左右。 因此，在一些弱化学发光体系中加入增敏剂( 通常是些高发光量子效率的 荧光化合物) ，使能量从化学发光体转移给增敏剂，再以光辐射形式释放出来， 3 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 以提高整个化学发光的量子效率。这种能量转移最主要的一种形式是共振转移， 要使能量发生共振转移需要满足三个条件：一、能量供体必需是能发射光辐射的： 二、供体的发射光谱必须与受体的吸收光谱有重叠，重叠程度越大，能量转移效 率也越高；三、供体和受体间的距离在5 0 一1 0 0 a 以内。 c 珏蹦l i 礤e c 玎a 们d n x _ _ _ _ _ - _ _ 一卜 l ia _ k 嘲h c l 辩铷u i - o r 1 ) n 姗蛔_ 细t | j ， ： ? ： ：f ： ， 靳：? 三f ，? = f 图l i 化学发光过程示意图 y 当某一处于激发态的分子发射光子，即按量子力学允许的途径跃迁返回到较 低能态时，其能量e 的改变与辐射频率两者问的关系遵循下列方程式： e l e 2 = 址= h 上式中h 为普朗克常数，v 为辐射频率。 由于化学发光不包含热和电功，因此，化学发光反应所需的自由能变化可 由下列公式计算： 一g 2 c k 上式中h 为普朗克常数，c 为光速，五。为激发分子发射的长波波长的上限。如果 4 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 丸的单位为n m ，则对lm o l 物质而言有： 一g 加，以2 8 5 7 1 0 4 千卡丸摩尔 由上式可知，4 0 0 一7 5 0 肿的可见光发射所需要的g 的数值应在7 1 3 8 千卡之间。许多具有过氧化物中间产物的氧化反应都可以满足这个要求，在分解 时，过氧化物将多余的能量传递给适当的接受体，如反应剂、产物或特选的添加 剂等。 2 2 化学发光的反应类型 化学发光根据其化学发光反应过程可分为以下二种类型： 直接化学发光反应：某一化学发光反应生成了某种电子激发态的产物，当电 子回到基态时，以辐射光的形式释放能量。反应过程为： a + b 寸c 1 + d c 专c + v 间接化学发光反应：又叫敏化化学发光反应，某一化学发光反应最初生成的 激发态中间体不发光，而是将激发能转移给其它能量受体( 如荧光物质) ，导致 其它物质发光。反应过程为： 2 3 化学发光的分析原理 a + b j c + d c + f 畸c + f ，+ f + 矗v 根据化学发光反应在某一时刻的化学发光强度( i c l ) 或发光总量来确定反 应中相应组分含量的分析方法叫做化学发光分析。化学发光反应之所以能用于分 中国科学技术大学博上学位论文第一章综述 析测定，是因为化学发光强度与化学反应速率相关联，因而一切影响反应速率的 因素都可以作为建立测定方法的依据。 在任一给定的时间t 时，i c l 可用下列方程式表示： l n = 串c l d c 憾 上式中如( f ) 新为特定时间化学发光反应速率t 。是化学发光的量子效率。对 某个化学反应来说，破。为一常数。其反应速率可按质量作用定律表示出与反 应体系中物质浓度的关系。因此，通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中 某种物质的浓度。原则上讲，对任何化学发光反应，只要反应是一级或假一级反 应，都可以通过上式进行化学发光定量分析。例如，在直接化学发光反应中，如 果物质b 保持恒定，则物质a 的浓度变化可视为一级或假一级反应，于是： 。= j 五t p ) 衍= i 五。批纠o ) 砖) j 出= 畋。c 。 即化学发光强度i c l 与物质a 的浓度成正比。 化学发光分析测定的物质通常可以分为三类：第一类物质是化学发光反应的 反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或者抑制剂：第三类物 质是偶合反应中的反应物、催化剂或者增敏剂。通过标记方式利用这三类物质还 可以测定人们感兴趣的其它化合物，从而进一步扩大化学发光分析的应用范围。 3 化学发光体系 根据化学发光反应所在的介质不同，化学发光反应可分为液相化学发光、气 相化学发光、固相化学发光和异相化学发光四种。如果化学发光反应是在液相中 进行，就称之为液相化学发光：如果化学发光反应是在气相或固相中进行，就称 之为气相或固相化学发光：如果化学发光反应是在二个不同相中( 如气体通过固 体表面或液一固界面上) 进行，则称之为异相化学发光。由于液相化学发光具有 体系多样、反应易于操控、设备易于商品化等特点，目前己成为发展最为迅速的 化学发光分析方法。本节将讨论几种常见的液相化学发光体系。 6 中国科学技术大学博士学位论丘第一章练述 3 1 鲁米诺及其衍生物发光体系 1 9 2 8 年，a l b r e c h t 发现了鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 在碱性介质中的化学发光现象， 这是有机化学发光史上的一个里程碑 8 。由于鲁米诺结构简单、容易合成、有 较好的水溶性以及较高的发光量子效率等特点，近百年来，鲁米诺在化学发光分 析中得到了广泛的研究和应用。常见的鲁米诺类衍生物的结构如图i 一2 所示。 i i 图l 一2 鲁米诺( i ) 、 异鲁米诺( i i ) 和氨基丁基乙基萘酰肼( i i i ) 的结构 h h 鲁米诺在碱性条件下能被一些氧化剂( 如h 2 0 2 、0 2 、c 1 0 一、1 2 、0 4 、a u c l 4 + ) 氧化发出蓝色的光。其发光量子产率为o 0 1 0 0 5 1 8 】，在水介质中，最大发射 波长为4 2 5 呦 1 9 。其发光机理如图l 一3 所示： o h - 磊v + 0 h - h 2 0 2 c o o c 0 0 一 图1 3 鲁米诺化学发光反应的简要机理 7 c o o 中国科学技术大学博士学位论文第一章综述 利用鲁米诺化学发光体系，不但可以测定很多金属离子 2 0 2 3 ，还可以测 定很多有机物，如氨基醇类以及带有一n 0 2 、。一n h 2 和一o h 的苯类衍生物 2 4 ， 2 5 和一些还原剂如抗坏血酸 2 6 。由于过氧化氢可氧化含酚羟基的有机物，因 此可以间接测定中草药中的黄酮醇和甾体醇等。庞志功等用1 u m i n o l h 2 0 2 c o ( i i ) 体系测定了穿心莲内酯 2 7 、厚扑酚 2 8 、丹皮酚 2 9 和儿茶酚胺类 3 0 。 同时，些生物物质可以通过酶产生h 2 0 2 ，然后用l u m i n 0 1 化学发光反应来检 测葡萄糖 3 1 、氨基酸 3 2 、胆碱 3 3 和血清及尿液中的尿酸 3 4 等化合物。 r o s w e l l 和v a nd y k e 等人发现鲁米诺