蛋白质生物合成

第15章蛋白质生物合成,翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,蛋白质合成的场所是蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是蛋白质合成的原料是,核糖体,mRNA,tRNA,20种氨基酸,(messengerRNA)是蛋白质生物合成过程中直接指令氨基酸掺入的模板，是遗传信息的载体。,原核生物和真核生物mRNA的比较,遗传密码,定义：遗传密码(Geneticcode)是联系核酸的碱基序列和蛋白质的氨基酸序列的方式。由三个碱基代表一种氨基酸，称为密码子(Codon)。遗传密码的发现：性质：简并不同位置的碱基特异性通用与例外阅读方向不重叠无逗点,一、遗传密码三联子,（一）三联子密码定义遗传密码:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码。密码子(codon)：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码(tripletcoden)。,mRNA5GCUAGUACAAAACCU3,(二)三联体密码的破译,1954年Gamov确认核酸分子中三个碱基决定一个氨基酸1961年Crick等用遗传学方法也证实三联体密码子学说是正确的Nirenberg以均聚物共聚物为模板指导多肽的合成,寻找到了破译遗传密码的途径Khorana以共聚物指导多肽的合成，加快了破译遗传密码的步伐,数学的计算：,核甘酸序列,氨基酸序列,缺失或插入核苷酸引起三联体密码的改变,CATCATCATCATCATCATCATCACATCATCATCATCCATCACAXTCATCATCATCAXTXCATXCATCATCAT,-1,-1,+1,+3,以均聚物为模板指导多肽的合成,PolyU为模板，产生的多肽链为PolyPhe,PolyA为模板，产生的多肽链为PolyLys,PolyC为模板，产生的多肽链为PolyPro,以特定的共聚物为模板指导多肽的合成,（1）以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽,如以PolyUG为模板，合成产物为PolyLys-Val。,（2）以多聚三核苷酸作为模板，可得三种氨基酸组成的多肽。,核糖体结合技术,技术要点：,保温,硝酸纤维滤膜过滤,分析留在滤膜上的核糖体-AAtRNA,确定与核糖体结合的AA,以人工合成的三核苷酸为模板+核糖体+AA-tRNA,至1966年，20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清。,遗传密码的破译，即确定代表每种氨基酸的具体密码。,（三）遗传密码的性质,1、简并性与兼职,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymouscodon）。,减少了变异对生物的影响,编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率就越高。Arg例外,Thenumberofcodonsforeachaminoaciddoesnotcorrelatecloselywithitsfrequencyofuseinproteins.,（三）遗传密码的性质,2、普遍性与特殊性,蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,人线粒体中变异的密码子,UGA终止信号TrpAUAIleMetAGAArg终止信号AGGArg终止信号,密码子正常情况下编码线粒体DNA编码,线粒体与核DNA密码子使用情况的比较,在一个支原体中，UGA编码色氨酸；但在某些特殊物种中，如纤毛纲中的四膜虫属及草履虫属，UAA和UAG编码谷氨酰胺。,Changesinthegeneticcodeinmitochondriacanbetracedinphylogeny.TheminimumnumberofindependentchangesisgeneratedbysupposingthattheAUA=MetandtheAAA=Asnchangeseachoccurredindependentlytwice,andthattheearlyAUA=Metchangewasreversedinechinoderms.,Therearesporadicalterationsoftheuniversalcode,（三）遗传密码的性质,3、连续性,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshiftmutation)。,4、方向性从mRNA5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(openreadingframe,ORF)。,5、碱基特异性,一共有8个密码子家族，每个家族的4个密码子的前2个碱基是相同的，而且4个密码子具有相同的意义，所以它们的第3个碱基在识别氨基酸过程中不起作用。一共有7个密码子对，只要在第3个位置上出现的是嘧啶碱基，它们将表达相同的意义。一共有5个密码子对，只要在第3个位置出现的是嘌呤碱基，它们所编码的那个氨基酸将不会改变,（三）遗传密码的性质,6、摆动性,转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，这种现象称为密码子的摆动性。,1966年Crick根据立体化学原理提出：,（2）有些反密码子的第一个碱基（按5-3）决定了该tRNA识别密码子的数目。,（3）当一种氨基酸有几个密码子时，只要他们的第一和第二个碱基中有一个不同，则需要不同的tRNA来识别。,（1）mRNA上的密码子的第一、第二个碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对；密码的专一性主要是由这两个碱基对的作用。,AllofthefourbasesintRNAcanbemodified.,tRNAcontainsmodifiedbasesthatinfluenceitspairingproperties,U,摆动配对,密码子、反密码子配对的摆动现象,ModificationtoinosineallowspairingwithU,C,andA.,二、tRNA的结构、功能与种类,（一）tRNA的结构,1、二级结构：三叶草形,二、tRNA的结构、功能与种类,（一）tRNA的结构,2、三级结构：“L”形,氢键,（二）tRNA的功能,1、解读mRNA的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸,tRNA有两个关键部位：3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。与mRNA结合部位反密码子部位,tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。,1、起始tRNA和延伸tRNA,（三）tRNA的种类,能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。,真核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met，起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。原核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet,2、同工tRNA,（三）tRNA的种类,代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别。,3、校正tRNA,（三）tRNA的种类,无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）,无义突变,错义抑制,tRNA可以影响阅读框信使的阅读框通常是不变的。一个碱基的插入或者缺失可以导致框架转移突变，使得阅读框在突变点之后发生了变化。核糖体和tRNA继续以三联体工作，这样就合成了一系列完全不同的氨基酸。移码抑制恢复了原来的阅读框。最简单的外移码抑制因子修正阅读框的例子是：当在一系列残基中缺失或插入一个附加碱基而发性突变时。例如，G可以插入到一系列相邻的G碱在当中。此移码抑制基因是一个有额外碱基插入到它的反密码环中的tRNAGly。它能转化通常的三联体顺序，这个抑制基因tRNA能识别一个4碱基密码。一些移码抑制基因可以识别超过4个碱基的密码。例如，一种细菌tRNALys抑制因子可以识别AAAA或者AAAU，而不是通常状况下的AAA。另一种抑制基因可以阅读任何一个以ACC为前三位置的4碱基密码子。它与第四位碱基是什么无关，在这里，这第四位碱基不需要符合Wobble规则。这使得在下一个tRNA能够找到一个密码子之前，一个碱基被跳过去。在噬菌体和病毒中，移码经常发生。这也许可以影响蛋白质合成的继续或终止，且是由于mRNA的内在的性质。,A+1frameshiftisrequiredforexpressionofthetybgeneoftheyeastTyelement.Theshiftoccursata7basesequenceatwhichtwoLeucodon(s)arefollowedbyascarceArgcodon.不可靠顺序的行为：核苷酸序列CUUAGGC通常在CUU处被Leu-tRNA识别，这一步紧随AGG被Arg-tRNA识别而发生。然而，Arg-tRNA很少，当它的缺乏导致拖延时，Leu-tRNA就会从CUU密码子越过而到达重叠的UUA三联体。这导致了移码，因为第二个密码子的新配对(GGC)被Gly-tRNA阅读。滑动经常发生在P位点上。,tRNAmayinfluencethereadingframe,三、核糖体的结构与功能,（一）核糖体的结构,表14-7原核和真核生物核糖体的组成及功能核糖体亚基rRNAs蛋白RNA的特异顺序和功能细菌70S50S23S=2904b31种(L1-L31）含CGAAC和GTCG互补2.5106D5S=120b66%RNA30S16S=1542b21种(S1-S21)16SRNA(CCUCCU)和S-D顺序(AGGAGG)互补哺乳动物80S60S28S=4718b49种有GAUC和tRNAMat的TCG互补4.2106D5S=120b60%RNA5.8S=160b40S18S=1874b33种和Capm7G结合,三、核糖体的结构与功能,（二）核糖体的功能：,合成蛋白质,在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。活性位点：1mRNA结合位点位于30S亚基的头部。30S亚基与mRNA的起始结合，必须有S1蛋白。16SrRNA3端富含嘧啶区与mRNA上AUG之前的富含嘌呤区发生碱基配对，是30S亚基与mRNA初始结合不可缺少的。2P位点P位点大部分位于30S亚基，小部分位于50S亚基。P位点能够与起始tRNA(fmettRNA)相结合。3A位点A位点靠近P位点，其确切位置不详。16SrRNA是其构成成份之一。A位点主要在50S亚基上。4转肽酶活性位点位于P位点和A位点的连接处，靠近tRNA的接受臂。肽基转移酶位点，通过结合嘌呤霉素，已被定位于（核糖体）中央隆突处。一组蛋白和23SrRNA与位点形成有关55SrRNA位点在50S亚基上，靠近转肽酶位点。可能与tRNA的进入有关。6EF-Tu位点位于大亚基内，靠近30S亚基，这一位点与氨基酰tRNA的结合有关。7转位因子EF-G结合位点,The30Sribosomalsubunitisaribonucleoproteinparticle.Proteinsareinyellow.鉴定特定位点的一种途径是亲和标记。这种技术利用能与核糖体结合的组份的类似物；这些类似物或者本身具有化学反应性，或者可以被原位激活。例如，利用经过适当修饰的tRNA，有可能鉴定出一种标志转移至哪些核糖体组份。完全亚单位的修饰已广泛使用。一种途径是用损伤蛋白质或RNA的试剂处理亚单位，然后找出特定损伤与特异性功能丧失之间的相关关系。例如，乙氧二羟丁酮（kethoxal）已被用于修饰tRNA的鸟嘌呤，用四硝基甲烷修饰蛋白质。问题是如何限定损伤，以便一个特殊的改变可与某一种功能丧失密切相关。,Ribosomeshaveseveralactivecenters,The70Sribosomeconsistsofthe50Ssubunit(blue)andthe30Ssubunit(purple)withthreetRNAslocatedsuperficially:yellowintheAsite,blueinthePsite,andredintheEsite.16SrRNA是A位点的组成部分。rRNA在3小功能域有两个保守序列，称为1400和1500区，可能与tRNA相互作用。5SRNA整合至体外装配的50S亚单位，依赖L5、L8和L25三种蛋白。这种复合物能够结合23SrRNA。5SRNA位于P位点和A位点附近。正在生长的多肽链，似乎从距肽基转移酶位点1.5nm的50S亚单位伸出，可能作为一条未折叠的多肽链延伸通过核糖体，直至离开出口域，这时才能自动开始折叠。,Theribosomehasseveralactivecenters.Itmaybeassociatedwithamembrane.mRNAtakesaturnasitpassesthroughtheAandPsites,whichareangledwithregardtoeachother.TheEsiteliesbeyondthePsite.Thepeptidyltransferasesite(notshown)stretchesacrossthetopsoftheAandPsites.PartofthesiteboundbyEF-Tu/GliesatthebaseoftheAandPsites.,Somesitesin16SrRNAareprotectedfromchemicalprobeswhen50Ssubunitsjoin30Ssubunitsorwhenaminoacyl-tRNAbindstotheAsite.Othersarethesitesofmutationsthataffectproteinsynthesis.TERMsuppressionsitesmayaffectterminationatsomeorseveralterminationcodons.ThelargecoloredblocksindicatethefourdomainsoftherRNA.,Electronmicroscopicimagesofbacterialribosomesandsubunitsrevealtheirshapes.,核糖体，起初被看作一个具有各种催化活性的蛋白质集合体，这些蛋白质通过蛋白质-蛋白质相互作用以及结合至rRNA上而结合在一起。但是，具有催化活性的RNA分子的发现，表明rRNA可能在核糖体功能中起更为积极的作用。在翻译的每一阶段rRNA都与mRNA或tRNA相互作用，而且蛋白质对于维持rRNA处于一种能够执行催化功能的结构是必要的。若干相互作用涉及rRNA的特异性区域：rRNA的3端在起始处于mRNA直接相互作用；16SrRNA的特异性区域，直接同位于A位点和P位点两外的反密码子区域相互作用；23SrRNA与肽酰tRNA的CCA末端相互作用；尚不清楚缔合是否直接受RNA-RNA或RNA-蛋白质相互作用的介导，但是亚单位相互作用既涉及16S也涉及23rRNA。长期寻求可能具有催化活性的核糖体蛋白质的努力未能奏效。较近期的研究结果发现大亚单位的核糖体RNA具有催化活性。抽提50S亚单位中几乎全部的蛋白质，留下占核糖体蛋白质质量不到5%的蛋白质碎片，大部分与23SrRNA相缔合。这种制品保留了肽基转移酶的活性。损伤RNA的处理能破坏这种催化活性。由于很难制备缺乏蛋白质时仍保留其折叠结构的纯RNA，因此要直接证明23SrRNA提供酶功能尚不可能。实际上，很可能是需要50S亚单位的某些蛋白质以使rRNA形成合适的体内结构。,Ribosome-bindingsitesonmRNAcanberecoveredfrominitiationcomplexes.,Achangeinconformationof16SrRNAmayoccurduringproteinsynthesis.,Codon-anticodonpairingsupportsinteractionwithadenines1492-1493of16SrRNA,butmispairedtRNA-mRNAcannotinteract.,Abasicadeninein23SrRNAcouldacceptaprotonfromtheaminogroupoftheaminoacyl-tRNA.Thistriggersanattackonthecarboxylgroupofthepeptidyl-tRNA,leadingtopeptidebondformation.,原核生物蛋白质生物合成的过程,氨基酸的活化和转运合成起始：起始tRNA与起始密码子的识别起始复合物与70S核糖体的形成SD：AGGAGG延伸：转肽与肽键的形成三种延伸因子，一种为EFTu，一种为EFTs，另一种是依赖于GTP的延伸因子EFG，又称转位因子。移位终止：RF1识别UAA和UAG；RF2识别UGA和UAA；RF3能刺激RF1和RF2的活性。,(一)氨基酸的活化,氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreadingactivity)。氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAlaSer-tRNASerMet-tRNAMet,原核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：真核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：,甲酰甲硫氨酸fMet-tRNAfMet甲硫氨酸Met-tRNAMet,第一步反应,氨基酸ATP-E氨基酰-AMP-EAMPPPi,第二步反应,氨基酰-AMP-EtRNA氨基酰-tRNAAMPE,E,tRNA与酶结合的模型,tRNA,氨基酰-tRNA合成酶,ATP,Anaminoacyl-tRNAsynthetasechargestRNAwithanaminoacid.,Anaminoacyl-tRNAsynthetasecontainsthreeorfourregionswithdifferentfunctions.(Onlymultimericsynthetasespossessanoligomerizationdomain.),tRNAsarechargedwithaminoacidsbysynthetases,CrystalstructuresshowthatclassIandclassIIaminoacyl-tRNAsynthetasesbindtheoppositefacesoftheirtRNAsubstrates.ThetRNAisshowninred,andtheproteininblue.PhotographskindlyprovidedbyDinoMoras.,AclassItRNAsynthetasecontactstRNAattheminorgrooveoftheacceptorstemandattheanticodon.,tRNAsarechargedwithaminoacidsbysynthetases,AclassIIaminoacyl-tRNAsynthetasecontactstRNAatthemajorgrooveoftheacceptorhelixandattheanticodonloop.,tRNAsarechargedwithaminoacidsbysynthetases,Proofreadingreferstoanymechanismforcorrectingerrorsinproteinornucleicacidsynthesisthatinvolvesscrutinyofindividualunitsaftertheyhavebeenaddedtothechain.,Accuracydependsonproofreading,Figure7.15RecognitionofthecorrecttRNAbysynthetaseiscontrolledattwosteps.First,theenzymehasagreateraffinityforitscognatetRNA.Second,theaminoacylationoftheincorrecttRNAisveryslow.,Whenasynthetasebindstheincorrectaminoacid,proofreadingrequiresbindingofthecognatetRNA.Itmaytakeplaceeitherbyaconformationchangethatcauseshydrolysisoftheincorrectaminoacyl-adenylate,orbytransferoftheaminoacidtoRNA,followingbyhydrolysis.,Accuracydependsonproofreading,控制正确性的直接机制是将由A位点的空间化学来决定密码子反密码子的识别地区。核糖体的几何学决定密码子反密码子的结合以这样的方式进行：通过蛋白质S12，S4和S5的结构接受氨酰tRNA使得正确性或强或弱。（或者通过它们对rRNA结构的影响力）正确性是核糖体运动的间接影响。核糖体的速度可以决定tRNA识别的可能性，从而决定此过程的有效性。这个模型解释了改变链延长的动力学可以影响链霉素。相关参数是核糖体运动速度随时间的变化决定了是结合还是分开，如果肽链形成的速度增大，在氨酰-tRNA逃避之前，在键形成中不正确的氨酰决定tRNA识别的可能性，从而决定此过程的有效性。这个模型解释了改变链延长的动力学可以影响链霉素。相关参数是核糖体运动速度随时间的变化决定了是结合还是分开，如果肽链形成的速度增大，在氨酰tRNA逃避之前，在键形成中不正确的氨酰tRNA更容易被诱捕。减慢蛋白质合成的速度将会给修正。,(二)翻译的起始,原核生物（细菌）为例：所需成分：30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、,Initiationrequiresfreeribosomesubunits.Whenribosomesarereleasedattermination,theydissociatetogeneratefreesubunits.Initiationfactorsarepresentonlyondissociated30Ssubunits.Whensubunitsreassociatetogiveafunctionalribosomeatinitiation,theyreleasethefactors.,IF-3,IF-1,翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步：1.核蛋白体大小亚基分离,2、30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合。,S-D序列,Ribosome-bindingsitesonmRNAcanberecoveredfrominitiationcomplexes.,IF-3,IF-1,3.在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。,TheinitiatorN-formyl-methionyl-tRNA(fMet-tRNAf)isgeneratedbyformylationofmethionyl-tRNA,usingformyl-tetrahydrofolateascofactor.,AspecialinitiatortRNAstartsthepolypeptidechain,OnlyfMet-tRNAfcanbeusedforinitiationby30Ssubunits;onlyotheraminoacyl-tRNAs(aa-tRNA)canbeusedforelongationby70Sribosomes.在一个起始复合物中，小亚单位以一种令起始密码子位于亚单位携带的部分P位点的方式，停留在mRNA上。这个可以变成起始复合物一部的，唯一的氨酰tRNA就是起始tRNA。其独一无二的特点是能直接进入部分位点而识别相应密码子,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。,肽链合成的起始,30S亚基mRNAIF3-IF1复合物,30SmRNAGTP-fMettRNA-IF2-IF1复合物,70S起始复合物,mRNA+30S亚基-IF3,IF-1,70S起始复合物,Newlysynthesizedproteinsinbacteriastartwithformyl-methionine,buttheformylgroup,andsometimesthemethionine,isremovedduringproteinsynthesis.大概当新生链达到15个氨基酸长度时，就会相当迅速地发生去除反应。在细菌和线粒体内，甲酰基残基被一种特异性去甲酰基酶去除，产生一个正常的NH2末端。如果甲硫氨酸要成为蛋白质的N-端氨基酸，这是唯一的必要步骤。在大约一半的蛋白质中，末端的甲硫氨酸被氨肽酶去除，造成一个新的R2末端（原来掺入链中的第二个氨基酸）。在两个步骤均属必要时则依依发生。,肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。延伸因子(elongationfactor,EF)：原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)EF-G,(三)肽链的延伸,1、AA-tRNA与核糖体A位点的结合,需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子,通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-TuGTP复合物,EF-Tu-GDP+EF-TsEF-Tu-Ts+GDPEF-Tu-Ts+GTPEF-Tu-GTP+EF-Ts,重新参与下一轮循环,2、肽键形成是由转肽酶/肽基转移酶催化Peptidyltransferaseistheactivityoftheribosomal50Ssubunitthatsynthesizesapeptidebondwhenanaminoacidisaddedtoagrowingpolypeptidechain.TheactualcatalyticactivityisapropertyoftherRNA.,Figure6.24Thestructureoftheternarycomplexofaminoacyl-tRNA-EF-Tu-GTP(left)resemblesthestructureofEF-TuandEF-Gareinredandgreen;thetRNAandthedomainresemblingitinEF-Gareinpurple.,6.9Translocationmovestheribosome,肽基转移酶是大核糖体亚单位的（50S或60S）一种功能。转移酶是一个核糖体位点的组成部分，在位点上肽酰tRNA与氨酰tRNA末端被带到一起，彼此接近。rRNA和50S亚单位蛋白质，二者对于这种活性都是必需的。催化活性可能是50S亚单位的核糖体RNA的特性，而不是任何个别蛋白质的特性,3、移位,核糖体向mRNA3端方向移动一个密码子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子,延长因子EF-G有转位酶(translocase)活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。,fMet,fMet,Figure6.23Modelsfortranslocationinvolvetwostages.First,atpeptidebondformationtheaminoacylendofthetRNAintheAsitebecomeslocatedinthePsite.Second,theanticodonendofthetRNAbecomeslocatedinthePsite.,6.9Translocationmovestheribosome,肽链的延长,进位,肽键形成,移位,进位,(TuTs),肽键形成,3,（EF-G）,tRNAandmRNAmovethroughtheribosomeinthesamedirection.脱酰tRNA经另一个tRNA结合位点E位点，离开核糖体。在离开P位点并从核糖体释放至胞质溶胶的中途，该tRNA瞬间占据E位点。因此，tRNA流入A位点，通过P位点，经E位点流出。,原核肽链合成终止过程,（四）肽链的终止,Figure6.28TheRF(releasefactor)terminatesproteinsynthesisbyreleasingtheproteinchain.TheRRF(ribosomerecyclingfactor)releasesthelasttRNA,andEF-GreleasesRRF,causingtheribosometodissocuate.,6.10Threecodonsterminateproteinsynthesis,真核生物只有一个终止因子（eRF）,多多核糖体与核糖体循环,合成完毕的肽链,核糖体循环,真核生物的蛋白质生物合成,合成起始.80S核糖体的解离三元复合物和43S前起始复合物的形成43S前起始复合物与mRNA的结合.起始密码子AUG的选择.43S起始复合物与60S亚基结合延伸eEF1是一种多聚蛋白质，主要负责将氨基酰tRNA转运至核糖体。延伸因子2(Elongationfactor2，eEF2)是单体蛋白质分子。能与GTP结合，GTP为其发挥功能所必需的。能与起始tRNA(MettRNAi)结合。终止,真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物),原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。,真核生物翻译起始复合物形成过程,SeveraleukaryoticinitiationfactorsarerequiredtounwindmRNA,bindthesubunitinitiationcomplex,andsupportjoiningwiththelargesubunit.识别mRNA需要若干附加因子；这些附加因子的重要作用之一，在于去除mRNA中任何二级结构,SmallsubunitsscanforinitiationsitesoneukaryoticmRNA,Eukaryoticribosomesmigratefromthe5endofmRNAtotheribosomebindingsite,whichincludesanAUGinitiationcodon.有时AUG起始密码子位于mRNA5端40个碱基以内，因此帽结构与AUG均位于核糖体结合范围。但在许多mRNA中，帽与AUG距离相当远，个别的甚至远隔1000个碱基.“扫描”模型，假定40S亚单位开始识别5帽结构，然后沿着mRNA“移动”。从5端开始的扫描是一线性过程。当40S亚单位扫描前导区时，就会溶解稳定性小于-30KJ的二级结构发夹，但是稳定性较大的发夹则阻碍或阻止移动。,只有当它处在正确的前后序列中，AUG才能被有效地识别为起始密码子。最佳序列由序列GCCAGCCAUGG组成。AUG密码子前的嘌呤（A或G）三碱基，以及紧随AUG后的G是最重要的，并成10倍地影响翻译效率；其它碱基的影响要小得多。当前导序列很长时，在第一个40S亚单位离开起始位点之前，后面的40S亚单位可以识别其5端，这样就造成一行亚单位沿着前导序列向起始位点前进。结合在起始位点被稳定下来。当40S亚单位同一个60S亚单位连接在一起时，完整的核糖体就被定位于保护试验所鉴定的位点上。一个40S亚单位可保护一个多达60个碱基的区域；而当60S亚单位加入复合物时，被保护区域收缩至见于原核生物的同样的3040碱基长度。核糖体必须在5端起始这一概念，同真核mRNA的单顺反子本质相一致。某些例外的病毒mRNA含有不止一个编码区。但在这类情况下，只有最靠近5端的编码区才能从完整的mRNA翻译。其它的（编码区）只是在mRNA被切割，在内部起始密码子附近，产生一个新的5端，才能被解读。这种性质，支持内部起始位点不可能被直接识别的概念。,AtleasttwofeaturesareuniquetotheinitiatortRNAiMetinyeastithasanunusualtertiarystructure;anditismodifiedbyphosphorylationofthe2ribosepositiononbase64(ifthismodificationisprevented,theinitiatorcanbeusedinelongation).SotheprincipleofadistinctionbetweeninitiatorandelongatorMet-tRNAsismaintainedineukaryotes,butitsstructuralbasisisdifferentfromthatinbacteria.,Ineukaryoticinitiation,eIF-2formsaternarycomplexwithMet-tRNAf.Theternarycomplexbindstofree40Ssubunits,whichattachtothe5endofmRNA.Laterinthereaction,GTPishydrolyzedwheneIF-2isreleasedintheformofeIF2-GDP.eIF-2Bregeneratestheactiveform.,在真核细胞质中的起始，几乎总是使用AUG作为起始密码子。起始tRNA虽然是不同种的分子，但其甲硫氨酸不被甲酰化。这种tRNA被称为tRNAiMet。因此，起始与延伸Met-tRNA之间的区别仅在于tRNA部分。在酵母中，起始tRNAiMet至少有两个特征是独特的，它有一种罕见的三级结构；在64号碱基处通过2核糖位置的磷酸化而被修饰，(假若这种修饰被阻止，该起始密码子则可用于延伸)。起始与延伸Met-tRNA之间区别的原理在真核生物中被维持下来，但其结构基础则与细菌不同。除了这一区别之外，真核生物的起始过程，一般说来似乎同E.coli中的过程类似。起始因子有多种，在网织红细胞（未成熟红细胞）中至少已发现了9种并进行大量的研究。这些因子与细菌的相似，有时通过模拟细菌因子而命名，并加上前缀“e”表明来源于真核生物。真核生物的翻译起始，首先形成一个含有Met-tRNA、eIF-2和GTP的三元复合物。复合物分两个阶段形成，首先GTP结合至eIF-2；而GTP同eIF-2的结合提高了eIF-2对Met-tRNAi的亲和力，然后同其结合。三元复合物直接与游离的40S亚单位缔合，反应不依赖mRNA的存在。Met-tRNAI起始因子必需存在，40S亚单位才能结合至mRNA上。,eIF-4因子是一个识别帽结构的多聚体，eIF-4A则能解开mRNA前15个碱基中存在的任何二级结构。解旋所需能量由ATP水解供给。沿着mRNA更远的结构解旋，则由eIF-4A同另一因子eIF-4B一起来完成。40S三元复合物同mRNA的结合依赖eIF-3，而eIF-3直接与mRNA结合相关。和（包括eIF-4A和eIF-4B在内的）其它因子也有关系。需要eIF-3和eIF-6因子维持亚单位处于解离状态。eIF-3是一极大的因子，具有810个亚单位，eIF-3结合小亚单位，（具有大部分抗缔合活性的）eIF-6则结合大核糖体亚单位。当大亚单位加入起始复合物时，eIF-6被释放出来。eIF-2和eIF-3从起始复合物中释放出来之前，60S亚单位不可能同起始复合物结合，这是一种eIF-5，即GTPase介导的功能。当完全的80S核糖体形成时，其余所有的因子可能都被释放。,蛋白质分子中硒代半胱氨酸的掺入硒代半胱氨酸(Selenocysteine)在真核生物和原核生物的蛋白质分子中均有发现，被认为是第21种氨基酸，由UGA所编码。在大肠杆菌中，有四个基因的产物参与了硒代半胱氨酸的掺入。其中一个基因(SelC)编码tRNA；两种基因(SelA和SelD)编码两种酶，这两种酶能将丝氨酰tRNA转变为硒代半胱氨酰tRNA；第四个基因(SelB)的产物为一种延伸因子，能特异的识别硒代半胱氨酰tRNA。mRNA中的UGA是代表终止密码子还是掺入硒代半胱氨酸，受mRNA结构的控制。在UGA下游140NT处，有40个NT的序列对硒代半胱氨酸的掺入非常重要，该区域的缺失突变会影响硒代半胱氨酸的掺入。另外，该区域还存在一短的茎环结构，茎环结构的破坏也影响硒代半胱氨酸的掺入。在真核生物的三个mRNA分子中，发现3非翻译区有一茎环结构，虽远离UGA，但是硒代半胱氨酸的掺入所必需的。这一序列称为硒代半胱氨酸插入序列(Selenocysteineinsertionsequence，SECIS)。,蛋白质生物合成初始产物的后处理,肽链中氨基酸残基的化学修饰肽链N端Met或fMet的除去信号肽的切除肽链的折叠切除前体中功能不必需肽段二硫键的形成多肽链N端和C端的修饰,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构肽链一级结构的修饰高级结构修饰,（一）多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1.分子伴侣(molecularchaperon)2.蛋白二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)3.肽-脯氨酰顺反异构酶(peptideprolylcis-transisomerase,PPI),1.热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)HSP70、HSP40和GreE族2.伴侣素(chaperonins)GroEL和GroES家族,分子伴侣,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质