（外科学专业论文）snail在胃癌中的差异性表达及与cox2表达的相关性研究.pdf

j 嬲 s n a i l 在胃癌中的差异性表达与c o x 2 表达 的相关性研究宰 中文摘要 研究背景和目的：胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，发病率及死亡 率均高居全部恶性肿瘤的首位。临床上绝大多数恶性肿瘤患者最终死 于肿瘤转移和术后复发，胃癌也是如此，因此，对原发肿瘤浸润转移 机制的研究一直是肿瘤研究领域的热点。最近研究发现，上皮细胞源 性肿瘤细胞之所以获得局部浸润和远处转移的能力与上皮细胞间质 转化( e p i t h e l i a l m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ，e m t ) 的关系密切。 e m t 是生理情况下，哺乳动物胚胎发育及器官形成的必需过程， 也存在于如：慢性炎症、组织损伤重建、纤维化等多种病理过程，尤 其与肿瘤细胞浸润及转移关系密切。e m t 发生后，以e c a d 为标志 的上皮基因表型丢失，进而获得间质细胞表型，立方形上皮细胞转变 为梭形成纤维细胞样形态，极性丧失，同质粘附连接破坏，细胞骨架 重塑，伪足形成，形成细胞一基质异质粘附，从而获得迁移能力。在 诱导e m t 的转录因子s l a i l 、s l u g 、t w i s t ，以及基质金属蛋白酶( m m p ) 等的共同作用下，导致局部浸润和远处转移。 锌指转录因子一s n a i l 能与e c a d 启动子区的e b o x 结合，抑制 e c a d 的转录，导致e m t 发生，e c a d 下调是e m t 的标志性事件。 正常上皮细胞e c a d 表达稳定，然而在多种上皮源性肿瘤中e c a d 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 3 0 6 7 2 0 5 8 ) 四川省卫生厅科研基金资助项目( 0 5 0 0 7 0 ) 1 则常常表达下调，细胞同质黏附功能降低，肿瘤细胞从原发部位脱落， 从而导致肿瘤转移。 近年实验表明：c o x 2 在食管癌、胃癌及大肠癌等肿瘤中过度 表达，与肿瘤的浸润和转移密切相关。研究发现，e c a d 表达除了受 s n a i l 等转录因子抑制外，也受c o x 2 的影响。在c o x 2 过度表达 的非小细胞性肺癌和小肠上皮细胞中，e c a d 表达下调，上述细胞表 型变化可被硫化舒林酸( c o x 抑制剂) 处理而逆转。因此，c o x 2 在e m t 发生过程中发挥重要作用，联合检测肿瘤中s n a i l 、e c a d 、 c o x 2 的表达，探讨其在肿瘤侵袭转移中的作用。 方法：随机选取术前未进行化疗、放疗及生物学治疗，经外科行 胃癌根治( 或姑息) 性切除术后的标本标本4 8 例，收集其完整的临 床及病理学资料；采用组织免疫组化s p 方法检测4 8 例胃癌组织、 切缘组织中s n a i l 、e c a d 、c o x 2 的表达，探讨其表达与胃癌病理生 物学行为的关系，初步阐明c o x 2 在上皮间质化中的作用。 结果： 1 s n a i l 在胃癌及切缘组织中的阳性表达率分别为8 5 4 2 、 2 7 0 8 。s n a i l 高表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移密切 相关( p o 0 5 ) 。 2 e c a d 在胃癌及切缘组织阳性表达率分别为3 1 2 5 、1 0 0 。 e c a d 表达下调与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床t n m 分期密切相关( 尸 o 0 5 ) 。 3 c o x 2 在胃癌及切缘组织的阳性表达率分别为6 4 5 8 、o 。 c o x 2 表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床t n m 分 期密切相关( 尸 o 0 5 ) 。 4 胃癌中s n a i l 和c o x 2 表达均与e c a d 的表达呈负相关，s n a i l 表达与c o x 2 的表达无相关性。 结论： 1 胃癌组织中，s n a i l 高表达及e c a d 的低表达与胃癌分化程度、 浸润深度、淋巴结转移有关，e c a d 表达下调还与t n m 分期有关。 提示s n a i l 高表达及e c a d 低表达在胃癌演进中发挥重要作用。 2 胃癌组织中c o x 2 高表达，与胃癌分化程度、浸润深度、淋 巴结转移、t n m 分期密切相关，提示c o x 2 参与胃癌的演进。 3 s n a i l 高表达与c o x 2 的高表达无相关性，但二者均与e c a d 的表达呈负相关，提示s n a i l 与c o x 2 在频繁发生e m t 的胃癌中发 挥重要作用，特别是与肿瘤的局部浸润和远处转移密切相关。 4 联合检测胃癌中s n a i l 、e c a d 、c o x 2 的表达可作为胃癌生物 学行为及预后判断的指标。 关键词：e m t ；s n a i l ；e c a d ( e c a d h e r i n ) ；c o x 2 ；胃癌 d i f f e r e n t i a le x p s s i o no fs n a i la n dc o x - 2i ng a s t r i cc a n c e r a b s t r a e t b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e ：g a s t r i cc a r c i n o m ai sf r e q u e n t l y m a l i g n a n tn e o p l a s mi no u rc o u n t r y , a n di t sm o r t a l i t ya r et h eh i g h e s to f o t h e rm a l i g n a n tt u m o r s 9 0 p e r c e n t a g eo fn e o p l a s mi s d i e d b yt u m o r m e t a s t a s i sa n dp o s t o p e r a t i v er e c u r r e n c e ，t h e r e b y , p r i m a r yn e o p l a s mi n v a - s i o na n dm e t a s t a s i sm e c h a n i s m si st h er e s e a r c h i n gf o c u si nt u m o rf i e l d r e c e n tr e s e a r c hi n d i c a t e dt h a t e p i t h e l i a l - - t o m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ( e m t ) p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ed u r i n gp r i m a r yc a n c e rr e g i o ni n v a s i o na n d s e c o n d a r ym e t a s t a s i s e m to c c u r si nn e c e s s a r yp h y s i o l o g i c a ls i t u a t i o n si n v o l v i n gn o r m a l e m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n do r g a n o g e n e s i so fm a m m a l i a n e v o l u t i o n ，b u t a l s oi nm a n yp a t h o l o g i e ss u c ha sc h r o n i ci n f l a m m a t i o n ，o r g a n i z a t i o n a l r e s t r u c t u r i n ga n do r g a nf i b r o s i s p a r t i c l y ，e m ti sc l o s e dc o r r e l a t e dw i t h t u m o ri n v a s i o na n dd i s t a n tm e t a s t a s i s d u r i n ge m t , e p i t h e l i a lc e l l sl o s ec e r t a i ne p i t h e l i a lm a r k e r ss u c ha s e c a da n dg a i nm e s e n c h y m a lp h e n o t y p e c o n s e q u e n t l y , e p i t h e l i a lc e l l si s c h a n g e df r o mc u b i cm o r p h o l o g i c a lf e a t u r e st of i b r o b l a s t i cs p i n d l e a s r e s u l to ft h el o s so fe p i t h e l i a lc e l lp o l a r i t y , c e l la d h e s i o nd a m a g e d b e t w e e nt h eh o m o g e n e o u sc o n t a c t ，c y t o s k e l e t o nr e m o d e l i n g ，p s e u d o p o d f o r m a t i o n ，t h ef o r m a t i o no fc e l l m a t r i xa d h e s i o nh e t e r o g e n e i t y , f i n a l ，i ti s 4 g a i n e dm o t i l ec a p a c i t y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n d u c e d e m ts n a i l ，s l u g ， t w i s t ，m m p ，t o g e t h e rt h ec o m p l e m e n t a r yr o l eo fe m t , l e a dt ol o c a l i n v a s i o na n dd i s t a n tm e t a s t a s i s s n a i l ，z i n cf i n g e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r , a f t e rb i n d i n g e b o xo f p r o m o t e rr e g i o n i nt h e e - c a d ，c a u s et r a n s c r i p t i o no fe - c a da n d o c c u r r e n c eo fe m t ah a l l m a r ko fe m ti st h ef u n c t i o n a ld o w n r e g u l a t i o n o ft h ec e l l - c e l la d h e s i o np r o t e i ne - c a d t h ee x p r e s s i o no fe - c a di ss t a b l e i nn o r m a le p i t h e l i a lc e l l s ，b u te c a dd i m i n i s h e di sf r e q u e n t l yi nan u m b e r o fe p i t h e l i a lt u m o r s d i o r d e rc e l la d h e s i o nr e d u c et h et u m o rc e l l sf r o m t h ep r i m a r ys i t et ot u m o rm e t a s t a s i s i nr e c e n ts t u d y , c o x - 2i sh i g h l ye x p r e s s e di nm a n yh u m a nt u m o r s c o x - 2p r o m o t et u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i sb yi n h i b i t i n ga p o p t o s i s ， e n h a n c e dt u m o rm e t a s t a s i sa n di n d u c t i o no ft u m o ra n g i o g e n e s i s ，a sw e l l a st h eg r o w t ho ft h et u m o r c o x - 2p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ne m t , e c a d e x p r e s s i o nr e p r e s s e db ys n a i l ，b u ta l s ob yt h ei m p a c to fc o x - 2 o v e r e x p r e s s i o no fc o x 一2i nn s c l ca n di n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sc a n i n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fe - c a d ，i tm a yb er e v e r s e db ys u l i n d a cs u l f i d e ( c o xi n h i b i t o r ) c o m b i n i n gd e t e c t i o ne x p r e s s i o no fs n a i l ，e c a d ， c o x - 2i n t u m o r , i n v e s t i g a t eb e t w e e nt h e i rr e l a t i o n s h i p sa n dc l i n i c a l p a t h o l o g i c a ld a t a ，a n de x p l o r ei t sr o l ei nt u m o r i n v a s i o na n dm e t a s t a s i s m e t h o d s ：a l lp a t i e n t st h a tw e r er a n d o m l ye l e c t e di nd e p a r t m e n to f g a s t r o i n t e s t i n a ls u r g e r yi nl u z h o um e d i c a lc o l l e g eh o s p i t a ld u r i n g 5 2 0 0 8 o c t - 2 0 0 9 ，m a y ，t h a tw e r en o tt r e a t e db yc h e m o t h e r a p y , r a d i o t h e r - a p y , a n db i o t h e r a p yb e f o r eo p e r m i o n s p e c i m e n so fg a s t r i cc a n c e ri n4 8 c a s e s ，w h i c he l e c t e dt h ec o m p l e t ec o l l e c t i o no fc l i n i c a la n dp a t h o l o g i c a l d a t a ，d e t e c t e ds n a i l ，e c a d ，c o x 一2e x p r e s s i o ni nc a n c e rt i s s u ea n d i n c i s a le d g eb ys pi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y i n v e s t i g a t i n gc o r r e l a t i o nt h e i r e x p r e s s i o na n dp a t h o l o g i c a lb i o l o g i c a lb e h a v i o r r e s u i t s ： 1t h ee x p r e s s i o nr a t e so fs n a i li n g a s t r i cc a n c e ra n dp e r i p h e r a l t i s s u e sw e r e8 5 4 2 ，2 7 0 8 t h e e x p r e s s i o nw e r ec l o s e l yc o r r e l a t e d w i t hd e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o no f g a s t r i cc a n c e r , d e p t ho fi n v a s i o n ，l y m p h n o d em e t a s t a s i s ( p o 0 5 ) 2t h e e x p r e s s i o nr a t e so fe - c a di ng a s t r i cc a n c e rt i s s u e sa n d p e r i p h e r a lt i s s u e sw e r e31 2 ，10 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ee x p r e s s i o nw e r e c l o s e l yr e l a t e dw i t hd e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o no fg a s t r i ct u m o r , d e p t ho f i n v a s i o n ，g a s t r i cc a n c e rt n ms t a g e ，l y m p hn o d em e t a s t a s i s p 6 0 岁1 5 例，6 0 岁3 3 例。肿瘤组织学类 型按n c c n 分级，归类如下：( 1 ) 根据肿瘤的分化程度：未低分化腺 癌共3 4 例，高中分化腺癌为1 4 例；( 2 ) 按浸润深度分类：t l + t 2 期的2 9 例，t 3 + t 4 期的1 9 例；( 3 ) 转移淋巴结：有淋巴转移18 例， 无淋巴转移3 0 例；( 4 ) p t n m 临床分期：i 期和i i 期共2 7 例，i i i 期和 期共2 1 例。 2 主要的实验仪器及试剂 2 1 实验仪器 病理组织漂烘仪：常州市中威电子仪器厂 病理切片机及烘片机：德国l e i c ar m 2 2 4 5 超纯水机：p u r e l a bu l t r a 8 0 2 型离心机：苏州手术器械厂 电磁炉及微波炉：格兰仕 电热恒温培养箱：d h p 9 0 5 3 型 电热隔水式恒温培养箱：西安明克斯检测设备有限公司 电子分析天平：日本 c h 2 0 b i m f 2 0 0 型普通光学显微镜：日本o l y m p u s 倒置荧光相差显微镜：l e i c ad m 4 0 0 0 b 4 c 冰箱：新飞冰箱 高压锅：富士宝 2 2 实验药物和试剂 二甲苯、盐酸、苏木素及多聚赖氨酸：购自北京博奥森生物技术 有限公司 多聚甲醛、中性树胶、乙醇、s p 试剂盒及d a b 显色剂：均购自 北京博奥森生物技术有限公司 兔抗人s n a i l 多克隆抗体：购自a b c a m 公司 鼠抗人e c a d 单克隆抗体：购自北京中杉金桥生物技术有限公司 3 实验方法 采用免疫组化s p 法染色分别检测胃癌组织、切缘组织中s n a i l 和 e c a d 表达，阳性对照以已知阳性切片作为参考，以0 0 1 m m o l l 磷 酸盐缓冲溶液代替一抗作为阴性对照，试剂及抗体的配制按照说明 书进行，在充分掌握预实验所得最佳反应条件下，进行s p 染色及操 作，在泸州医学院附属医院中心实验室完成上述操作过程。 3 1 免疫组化缓冲液的配制 柠檬酸缓冲溶液的配制：l o o o m l 双蒸水中分别加入3 4 5 9 柠檬酸 三钠2 h 2 0 、0 4 9 柠檬酸，再搅拌至充分溶解，最后调节p h 值为6 0 。 磷酸盐缓冲溶液的配制：1 0 0 0 m l 9 2 蒸水分别加入8 9 n a c l 、 ? 0 2 4 9 k h 2 p 0 4 、0 2 ，g k c l 、3 6 9 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 ，充分搅拌溶解，以盐 酸调节p h 值至7 4 。 d a b 显色液的配制：避光条件下，l m l 双蒸水中分别滴 j i d a b 显 色液的a 液、b 液、c 液各一滴。 3 2 免疫组化s p 法染色过程如下： 载玻片放入有防脱作用的多聚赖氨酸稀释液中停留3 0 秒，干燥， 室温隔夜，避光条件下保存。石蜡包埋组织经4 1 t m 切片后，置于防脱 处理的载玻片上，6 0 烤片固定4 8 7 2 d , 时。 ( 1 ) 二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，磷酸盐缓冲液冲洗3 分钟， 共三次。 ( 2 ) 倒去磷酸盐缓冲溶液，切片置入柠檬酸缓冲液中，在微波炉 中抗原热修复1 4 分钟，自然冷却至室温，再从缓冲液中取出切片。 磷酸盐缓液冲洗3 分钟，共三次。 ( 3 ) 倾去磷酸盐缓冲溶液，切片滴j i l l 3 过氧化氢溶液一滴，3 7 。c 恒温孵育l o 分钟；磷酸盐缓冲溶液冲洗3 分钟，共三次。 ( 4 ) 倾去磷酸盐缓冲溶液，滴加一滴s p 试剂盒的a 液进行封闭， 并在3 7 。c 恒温孵育1 8 分钟。 ( 5 ) 倾去s p 试剂盒的a 液，每张切片单独、分别地滴加兔抗人s n a i l 多克隆抗体抗体( 工作浓度为1 ：2 0 0 ) 、鼠抗人e c a d 单克隆抗体( 工作 浓度为l ：1 0 0 ) ，3 7 。c 恒温孵育3 0 分钟，以0 0 1 m m o l l 磷酸盐缓冲溶液 替代一抗作为阴性对照；磷酸盐缓冲溶液冲洗3 分钟，共三次。 ( 6 ) 倾去磷酸盐缓冲溶液，切片滴 j f l s p 试剂盒的b 液一滴，3 7 。c 恒温孵育3 0 分钟；磷酸盐缓冲溶液冲洗3 分钟，共三次。 ( 7 ) 倾去磷酸盐缓冲溶液，切片滴j j i s p 试剂盒的c 液一滴，3 7 。c 恒温孵育3 0 分钟；磷酸盐缓冲溶液p b s 冲洗3 分钟，共三次。 ( 8 ) 倾去磷酸盐缓冲溶液，切片加入1 0 0 9 ld a b 显色液，显微镜 下观察染色状况，显色良好立即终止。 ( 9 ) 苏木素复染、酒精分化，氨水返蓝。 ( 1 0 ) 梯度酒精脱水干燥，二甲苯分别浸泡，透明，中性树胶盖 玻片封固。 ( 11 ) 切片自然晾干，最后显微镜下观察判断。 4 免疫组化结果定性判断 在泸州医学院附属中医院病理科由两名经验丰富的诊断医师，采 取双盲法阅片，在病理图像分析仪上观察s n a i l 、e c a d 表达情况，得 出结果。 4 1 s n a i l 阳性结果判定标准 以肿瘤细胞核或细胞质中出现棕黄色染色为s n a i l 阳性细胞( 见 图：2 c ) ，每张切片选择1 0 个高倍视野( x 4 0 0 ) ，按照阳性细胞数占视 野中总细胞数的百分比分为四个等级：无着色及轻度着色( 阳性细胞 数1 3 0 ) 为阴性组，中度( 31 6 0 ) 及重度( 6 0 ) 为阳性 纠2 1 。 4 2e c a d 的阳性结果判定标准 以细胞膜和( 或) 胞质出现棕黄色染色为阳性细胞( 见图：4 c ) ，每 张切片选择l o 个高倍视野，按照阳性细胞数占视野中总细胞数的百分 比分为阳性与阴性：无着色或阳性细胞数 9 0 为阳性2 1 。 5 统计学处理 所得数据采用s p s s1 7 0 统计软件包，计数资料以阳性率表示， 组间比较采用# 检验分析，相关分析采用s p e a m a n 相关分析，p 0 0 5 表示有统计学意义。 结果 1s n a i l 、e c a d 在胃癌、切缘组织中的表达状况 1 1 s n a i l 蛋白的表达状况 表1 示：4 8 例胃癌组织中有4 1 例s n a i l 表达，阳性率为8 5 4 2 ， 对应切缘组织中仅有1 3 例s n a i l 蛋白表达，阳性率为2 7 0 8 ，两组 比较有显著性差异，具有统计学意义( p o 0 5 ) 。在高、中分化腺癌，s n a i l 阳性表达率为6 4 2 9 ， 明显低于差分化型腺癌( 低分化和未分化腺癌) 的阳性表达率9 4 1 2 ， 差异有统计学意义( 尸 o 0 1 ) 。在浸润深度超过浆膜层的1 9 例胃癌中 s n a i l 均为阳性表达，2 9 例未超过浆膜层组中仅有2 2 例表达，有显著差 异( 尸 o 0 5 ) 。大于6 0 岁的1 5 例患者中，e c a d 表达4 6 0 ，阳性率为2 6 6 7 ； 小于6 0 岁的3 3 例患者中，e c a d 表达1 1 例，阳性率为3 3 3 3 ，两组比 较无差异( 尸 0 0 5 ) 。在分化型胃癌中e c a d 阳性表达为5 7 1 4 ，差 分化型癌中e c a d 蛋白阳性表达为2 0 5 9 ，两者比较有显著差异( 尸 0 0 5 ) 。在无淋巴结转移组中，e c a d 阳性率( 5 0 ) 明显高于有淋巴 结转移组( o ) ，有显著性差异( 尸 o 0 0 1 ) 。e c a d 在临床分期中i + i i 期的表达率为4 4 4 4 ，在i i i + i v 期仅为1 4 2 9 ，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。e c a d 表达下调与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移 及临床分期有关，而与患者的性别、年龄无关。 3 胃癌中s n a i l 表达与e c a d 表达的相关性 在4 8 例胃癌组织中，s n a i l 和e c a d 表达均为阳性6 例，均为 阴性1 0 例；s n a i l 表达阳性而e c a d 表达阴性的有3 5 例，s n a i l 表达 阴性而e c a d 蛋白表达阳性的有9 例，s n a i l 和e c a d 的表达呈负相 关( 以= 0 3 5 2 ，p 6 0 岁 耋6 0 岁 性别 男 女 肿瘤分化程度 1 5 1 2 ( 8 0 o o ) 3 3 2 9 ( 8 7 8 8 ) 2 8 2 4 ( 8 5 7 1 ) 2 0 1 7 ( 8 5 o o ) 高中分化 1 4 9 ( 6 4 2 9 ) 低分化 浸润深度 t 1 t 2 1 3 j 1 4 临床分期 i + n 期 + 期 淋巴转移 有 3 4 3 2 ( 9 4 1 2 ) 2 9 2 2 ( 7 5 8 6 ) 1 9 1 9 ( 1 0 0 ) 2 7 2 3 ( 8 5 1 9 ) 2 1 1 8 ( 8 5 7 1 ) 1 8 ( 1 0 0 ) 0 0 0 50 9 4 5 7 0 8 50 0 0 8 5 3 6 9 0 0 2 0 0 0 30 9 5 9 4 9 1 7 0 0 2 7 4 ( 2 6 6 7 ) 11 ( 3 3 3 3 ) 0 6 2 3 0 4 3 1 0 ( 3 5 7 1 ) 5 ( 2 5 o o ) 6 1 6 80 0 1 3 8 ( 5 7 1 4 ) 7 ( 2 0 5 9 ) 14 ( 4 8 2 8 ) 1 ( 5 2 6 ) 12 ( 4 4 4 4 ) 3 ( 1 4 2 9 ) 0 ( 0 ) 9 8 8 5 0 0 0 2 5 0 0 1 0 0 2 5 l3 0 9 10 0 0 0 无 3 0 2 3 ( 7 6 6 7 ) 15 ( 5 0 0 0 ) 一一 1 7 图1 a 高分化腺癌中s n a i l 表达1 0 0 f i g lat h ee x p r e s s i o n o fs n a i li n w e l l d i f f e r e n t i a t e dg a s t r i cc a r c i f l o m a10 0x 图1 b 高分化腺癌中s r l a i l 表达2 0 0 f i g lbt h ee x p r e s s i o no fs n a i l i nw e l l 图1 c 高分化腺癌中s n a i l 表达4 0 0 f i g lct h e e x p r e s s i o no fs n a i li l l w e n d i f f e r e n t i a t e dg a s t r i cc a r c i i l o m a4 0 0 1 8 图2 a 低分化腺癌中s n a i l 表达l o o x f i g lat h ee x p r e s s i o no fs n a i l i 1 1 p 0 0 r l y d i f f e r e n t i a t e dg a s t r i cc a r i n o m a10 0x f i 9 2 bt h ee x p r e s s i o no fs n a i l i i l p o o r i y d i f f e r e n t i a t e dg a s t r i cc a r c i n o m i t2 0 0 x 图2 c 低分化腺癌中s n a i l 表达4 0 0 x f i 薛ct h ee x p r e s s i o n 。fs n a i l i l l p 。硎y d i f f e r e n t i a t e d g a s t r i cc a r c j l l 伽1 1 a4 0 0 jjjjjjjijjiljlljiiiiliii-ii-_ 1 9 ：擎暴蠢黧燃 讨论 e m t 发生后，立方形的上皮细胞转变为梭形成纤维细胞样形态， 获得迁移能力，基因表型发生改变，上皮细胞表型e c a d 、a c a t e n i n 、 f l - c a t e n i n 、角蛋白、黏蛋白等表达下调，其中e c a d 表达下调是e m t 的特征性事件【3 1 ；间叶表型标记物如纤连蛋白、v i m e n t i n 、a s m a 等 表达上调，以及诱导e m t 的细胞因子和转录因子如v e g f 、t g f 1 3 、 s n a i l 、t w i s t 、s l u g 、p r l 3 表达上调和具有辅助作用的基质金属蛋白 酶如m m p 2 、m m p 9 等表达上调。上皮细胞极性丧失，粘附能力下 降，与周围细胞和基质的接触减少，细胞松散，细胞骨架重建，迁移 和运动能力增加。研究表明，e m t 的特征性变化在肿瘤的原位病灶 中频繁发生，细胞形态的改变及粘附能力的下降，在肿瘤的原发部位 的局部浸润和远处转移以及新的转移灶的形成过程中发挥了重要作 用。正常上皮细胞基因突变后，细胞转化形成原位癌，癌细胞通过 e m t 形成侵入基底膜，进入淋巴管和血管，发生转移。在继发转移 部位，癌细胞经过e m t 的逆向过程，最终形成具有原发灶特征的转 移癌，因此，普遍认为e m t 是以动态演变过程【4 1 。 研究表明，e c a d 在口腔癌、肝癌、胃癌、食管癌等多种上皮源 肿瘤中表达下调，与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关，并且表达水 平与肿瘤转移潜能成负相关，e c a d 被视为肿瘤抑制因子，因此，对 e c a d 表达的调控成为研究肿瘤侵袭转移机制中的热点，s n a i l 正是 导致e c a d 表达下调的原因之一。 1 e c a d 的生物学特性及作用 e c a d 是一种介导同质细胞间粘附作用的i 型钙依赖性跨膜糖蛋 白，广泛存在于各类上皮细胞中。e c a d 分子胞外结构域与相邻的细 胞以同质粘附结合；胞内部分则分别与a c a t e n i n 、声c a t e n i n 以及 口一s m a 形成复合物，从而实现同型上皮细胞间强大的黏附连接，在 维持正常上皮细胞形态，细胞极性和组织结构完整性中发挥重要作用 【5 1 。e c a d 表达下调，复合物中的f l - c a t e n i n 游离并与细胞核l e f 结合， 激活间质细胞特异性基因如s n a i l 2 转录抑制e c a d 表达，导致e m t 发生。 2 e c a d 在胃癌的表达及在肿瘤浸润转移中的作用 实验证实，e c a d 粘附能力的丧失是上皮细胞获得去分化和 具有侵袭表型的第一步，相反具有侵袭性的肿瘤细胞重新表达 e c a d 后，则侵袭能力丧失，e c a d 的表达与肿瘤的侵袭能力呈负 相关【5 】，抗e - c a d 则破坏细胞间粘附连接，诱导e m t 发生。资料显 示，在肺癌、乳腺癌、胃癌和结直肠癌等恶性肿瘤中，常检测到e c a d 基因突变或其蛋白水平下调，显著低于癌旁组织或正常组织，并且与 肿瘤的分化程度相关。我们的研究结果表明：e c a d 在胃切缘组织中 呈高表达，以胞膜着色为主，而在癌组织则以胞质着色为主，并表现 为浅染色或无着色，在胃癌组织中，e c a d 表达显著下调，与切缘组 织相比有显著性差异，并有统计学意义。提示e c a d 蛋白下调或丢失 与胃癌的演进有关。z h o n g l 6 1 等分析3 3 例口腔癌e - c a d 表达水平发现， 癌组织中e c a d 表达低于肿瘤周围组织；侵袭性肿瘤边缘低于肿瘤中 心。e c a d 表达还与胃癌的临床病理性质有关，在弥散性胃癌中，常 有c d h l 的突变，e c a d 表达降低，然而在肠型胃癌中没有此现象【8 l ， e c a d 表达水平与肿瘤的分化程度有关，e c a d 低表达组的肿瘤与 e c a d 高表达组相比肿瘤的浸润能力更强，这与我们研究的结果一 致，即：e c a d 在浸润深度超过浆膜组和有淋巴结转移组中的表达率 显著低于未侵及浆膜组和无淋巴结转移组，并且具有统计学意义。 g a b b e r t t 7 1 在研究4 1 3 例胃癌中e c a d 的表达发现，e c a d 低表达与胃 癌浸润深度、淋巴结转移、临床分期以及生存期显著相关，e c a d 阳 性表达组3 年、5 年生存率均显著高于阴性表达组，这提示，e c a d 可作为一个独立的预后因子1 9 1 ，其表达降低的频度可作为肿瘤不良预 后的生物学指标。 3 s n a i l 的生物学特性及作用 s n a i l 属于s n a i l 超家族成员之一，在s n a i l 突变的果蝇胚胎呈原 肠胚缺陷的表现型，经研究证实与e c a d 下调有关，是其的转录抑制 因子。s n a i l 家族具有相似的结构，s n a i l 相关基因的一致结合位点都 包含有一个6 碱基的基序，该基序与c d h l 的e b o x 完全相同，e b o x 与b h l h 转录因子具有一致的核心结合位点，表明s n a i l 蛋白能与其 竞争相同的结合序列e 1 0 这是导致e c a d 表达下调的根本原因之一。 在胚胎发育时期，s n a i l 能够诱导中胚层及神经嵴的前体发生 e m t ，促使它们分别自原条和神经管分层和之后的移动，从而形成 中胚层和神经嵴，s n a i l 突变或缺失常导致中胚层和神经嵴的障碍形 成。因此，s n a i l 是中胚层及神经嵴的发育过程所必须的i 】。 4 s n a i l 在胃癌的表达及意义 体外实验【1 2 1 将反义s n a i l 转染人结肠癌细胞h t - 2 9 后，h t - 2 9 细 胞伪足缩短，呈现间质细胞样表型转变的特征。研究证实，在肿瘤中， s n a i l 可以通过调控e c a d 的表达参与e m t 的发生，作为肿瘤转移 发生过程中重要的调节因子【1 3 】，s n a i l 能与促肝细胞再生磷酸酶3 ( p r l 3 ) 基因的启动子结合【1 4 】，使p r l 3 转录上调，从而发挥其促肿 瘤转移的作用【1 5 1 。提示，s n a i l 可以反映肿瘤细胞的侵袭能力，是上 皮源性肿瘤演进过程中的一个重要调节因素。 临床研究表明，s n a i l 在胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中 高表达，并且与肿瘤组织分化程度、淋巴结转移及远处转移有关。本 实验结果表明，胃癌中s n a i l 主要表达于肿瘤组织的细胞核，阳性表 达率为8 5 4 2 ，显著高于切缘组织的2 7 0 8 ，具有显著性差异，提 示s n a i l 在胃癌组织中的高表达，参与了胃癌的发生。另外，s n a i l 在高中分化型胃癌的表达率为6 4 2 9 ，在差分化型胃癌的表达率为 9 4 1 2 ，差异具有统计学意义；在t l 厂r 2 和t 3 爪两组间、有淋巴 结转移组和无淋巴结转移组两两比较均有显著性差异，而与临床分 期、年龄及性别无关。金耐1 6 】等在研究s n a i l 在胃癌中的表达发现， 在胃癌的阳性表达率为8 9 6 ，而正常胃黏膜为2 9 1 ，差异有显著 统计学意义。s n a i l 表达与胃癌的临床病理性质有关，r o s i v a me 【1 研 究也证实s n a i l 高表达与胃癌组织学分级、淋巴结转移及临床t n m 分期有关。这提示：胃癌中s n a i l 高表达是肿瘤演进的重要原因。 5 胃癌中s n a i l 参与下调e c a d 的机制 研究口腔鳞状细胞癌中发现，侵袭力强的e c a d 阴性克隆细胞呈 现s n a i l 的高表达，而在侵袭力弱的e c a d 阳性克隆细胞中几乎没有 s n a i l 的表达【1 8 1 。更多研究表明，胃癌患者e c a d 表达下调与c d h l 基因突变或缺失、启动子甲基化，以及s n a i l 或s i p l 等对c d h i 的 转录抑制有关【1 9 1 ，这与h i r o h a s h i1 2 0 1 的实验结果一致。发生c d h l 基