（森林保护学专业论文）几种真菌对稻草生物降解的研究.pdf

摘要 摘要 运用菌物学、生物化学及生物技术等研究方法对9 个真菌菌株对稻草生物降解进行 研究，筛选出选择性降解稻草木质素的高酶活菌株，对其产漆酶的培养条件进行优化， 对所产漆酶进行分离纯化，测定了漆酶的部分动力学特征。 通过p d a b a v e n d a m m 平板显色反应、p d a r b 亮蓝显色反应、变色豳试验对各菌株对 稻草的生物降解能力进行了定性筛选，利用菌株产生的变色圈直径和菌落直径的大小来 判断各菌株对木质素的优先降解能力。结果表明：糙皮侧耳、彩绒革盖菌、粗毛栓菌： 菌株产漆酶及过氧化物酶能力较强，且优先降解本质素。在对稻草1 5 d 的降解中，彩绒 革盖菌的木质素降解率最高，为2 4 1 0 ；粗毛栓菌次之，为2 0 0 9 。稀硬木层孔菌的 综纤维素降解率最高，为2 5 6 2 ；糙皮侧耳最低，为2 2 3 。糙皮侧耳的s f 指数最 高，为7 3 6 ；粗毛栓菌次之，为2 4 8 。上述3 菌株在对稻草固体基质降解6 0 天内，现 毛栓菌对木质素的相对降解率( 6 8 j 3 ) 最高，彩绒革盖菌对综纤维素的相对降解童 ( 7 84 1 0 。) 最高。粗毛栓菌降解木质素的选择性优于糙皮侧耳、彩绒革盖菌，而彩绒盏 盖菌降解综纤维素的选择性优于糙皮侧耳、粗毛栓菌。 液态、固态培养产酶活性试验结果表明，粗毛栓菌为选择性降解稻草木质素的高酶 活菌株，为i 。a c 、i 1 d 、h c e l 的高产菌株，对天然木质纤维素基质有很强的降解能力，里 分泌漆酶的能力最强。粗毛栓菌产漆酶最佳培养条件为：碳源为蔗糖( j g l ) ，氮源为 蛋白胨( 1 9 l ) ，最适初始p h 值为4 o ，诱导剂为吐温一8 0 ：母液和发酵液的最佳培养方 式均为振荡培养。 运用h 0 硫酸铵盐析、透析、d 卧e s c p h a r o s ef i ：离子交换层析、s e p h 【d o x 【，? j 凝 胶层析方法对粗毛栓菌所产漆酶进行了分离纯化，最终纯化倍数达1 2 1 8 ，活力回收率 为1 14 。该漆酶符合酶促反应动力学特征。粗漆酶最适反应温度为4 ( ) ，纯化漆酶为 ：如；粗漆酶最适反应p h 值为j o ，纯化漆酶为，i j 。金属离子对漆酶活力的影响很大， 当金属离子浓度为j m m o l 儿时，a 一、z n ：、c u 。对漆酶有较明显的促进作用，c n 对漆酶 活力有一定的抑制作用，而f e 对漆酶是完全的抑制作用。该漆酶氧化a b t s 的米氏常数 k m 僮为l j 4 7 啪o ! j l 。 关键词稻草；真菌；生物降解：木质素降解酶类；漆酶 a b s t r a c t t h eb i o d e g r a d a t i o n so f n i n e 矗m g i t 0s t r a ww e r es t u d i e db ym e t h o d so f m y c o l o g y ，b i o c h e m i s t r ya n db i o t e c h i l o l o g y t h es t r a i nw h i c hh a s 圭1 i g he i l z y m e 枷、，i t yo ns e l e c t i v ed e g r a d a t i n g i i g n i no fs t r a ww a ss c r e e n e d t h ec u l t u r a lc o n d i t i o n sf o rl a c c a s ep m d u c i n gw e r co p t i m i z e d t h el a c c a s ew e r ei s o i a t e da n dp u r i n e d ，a n dt h ep a r t so fd y n a m i c a lc h a r a c t e ro fi a c c a s ew a sm e a s u r e d c 印a c i t yo fp r o d u c i n gl i g n o c e l l u i o l y t i ce n z y m eb yn i n ef u n g u sw a sr e s e a r c h e db ym e t h o d so fm e a s u r i n gc o l o 卜z o n eo rt h ed i a m e t e ro fm y c e l i u ma n dt h a to fc o l o r e dz o n eo np d a b a v e n d a m m ，p d a r ba n dc o l o 卜z o n et r i a lw h i c hw e r es h o w e di nt h ec h a r a c t e r i z a t j o ns c r e e n 1 1 坚 t r i a i t h ec o n c l u s i o no f t h et r i a lw a st h a tt h ec a p a c i t yo f p r o d u c i n g l i g n o c e l l u l 0 1 y t i ce n z y m e s i - 1 1 c l u d i n g1 a c c a s ea n dp e r o x i d a s ew a ss t r o n ga n ds e l e c t i v ed e g m d a t i n g “g n i no fs t r a wb yj d ，埘 胛“l 向川“( 0 r 如，z 坩l ，p r s f c o ，。ra n dn 口聊p f 已sg 订，nt h eh 追h e s ta b i l i t yo f d e g r a d a t i n gl i g n i n ua s ( 1 d ，。f 。，z s1 汜r ，f c d ，o ，o fw h i c ht h er a t eo fk l a s o ni i g n i nd e g r a d a t i o nw a s2 41o a t t e rl5 d a y sc u l t u r e ，w h i l e 乃d ，”p ，g s 即j c 口w a st h el o w e ll l g n i nd e g r a d e dr a t ew a s2 0 0 9 t h eh i g h e s td e g r a d a t e da b i l i t yt oc e l l u l o s ew a sp 已，咖淞加6 2 盯，“s ，a 矗e r l 5d a y sc u l t u r et h er a t eo f c e i l u l o s ed e g r a d a t i o nw a s2 5 6 2 ：t h ec e l l u l o s ed e g r a d e dr a t eo f 剧p “m f 淞d s f 形“f “sw a s2 2 ：娥) 【h el o 眦s to n et h es e l e c tf a c t o r ( s f ) o fp 尼“，“so s 舱口f 船w a s7 3 6 ，t h eh i g h e s to n ei n9s t r a i n s t h es e l e c tf a c t o r ( s f ) o f 乃“m g f p s g “，捃“w a s2 4 8 一t h ei o w e ro n e a m o n gt h et h r o ef u n g u so rb i o d e g r a d a t i o ns o l i dc u l t u r et os t r a wd u r i n gt h e6 0d a y s ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f1 j g n i nb j 什( 们，p ，p 1 w ，融口w a sh i g h e s t ( 6 8 5 3 ) w h i l et h ed e g r a d a t i o nr a t eo f c e l l u l o s eb ( 0 r ，d n ，v 、。， s i c 咖rw a sh i 曲e s t ( 7 8 4 1 ) ；a n ds e l e c t i 、i t yc o e f i i c i e n tb ym ，m 叭，彤“f 叫w a sh 唔h e 洲j 二1 u h i l es c l e c t i v i t 7c o e f 葡c i e n tb y ( 0 r ，o ，j 獬r 一出d 胁，w a sh i g h e s t ( o 7 8 ) t h er e s u l tb ) 1t h el i g u i do rs o l i dm e d i at r i a lf o rt h ee n z y m e sa c t i v i t j e sp m d u c 曲坚e n z jn l c s a c t i v i t yw a ss h o w e dt h 越t h eh i g he n z y m ea c t i v i t yo ns e l e c t i v ed e g r a d a t i n g1 i g n i no fs t r a uw a s 丹( 姗p ，g s 譬日，i c 甜w j t hh i g h e s te n z y m e sa c t i v i t yo fl a c ，m n pa n dh c e i 什“埘p ，c g “，f c c ，h a d t f l es t r o n g e s tc a p a c i t yo fd e g r a d a t i o nl i 苎n o c e l i u l o s ei nn a t u r ea n dp m d u c i n gl a c c a s ea m o n 坚t h e i h r e e f u n g u s t h ep t i m u mp r o d u c i n g1 a c c a s ec u i t u r ew h i c hw a sr e s e a r c h e dw a s ( l ) ：c a r b o n r e s o l l r c e ( s a c c h a r o s e5 ) ，n i t r o g e nr e s o u r c e ( b e e fp e p t o n e1 ) i n i t i a lp h ( 4o ) ，r e l l s a n t ( t w e e n 8 o ) w 亡o b t a i n e da l s ot h eb e s tc u l t i v a t i o nm e a n sw a ss e e da n df e r m e n t a t i o nl i q u i dw e r eg r o n b ys t a t i cm e a n s t h el a c c a s ew a sp u r i f i e db ye m b o d y ( n h j ) 2 s 0 4s a i t i n g o u t ，d ia l y z i n g ，t h e nd e a e s e p h a r o s ef fi o ne x c h a n 坚ec h r o m a t o l o g r a p h ya n dt h e ns e p h a d e g 一7 5g e lc h r o m a t o t o g r a p h y 1 h ei e s u i t st fp u “ c a t i o nm u l t i p i ew a sl2 4 8a n dt h ea c t i v i t yr e c l a m a t i o nr a t ew a s21 4 t h cr c a c i j t ，n p r o c c s sc l l r ：s h l l 、c dt h a tl h i sl a c c a s ea c c o r dt h ed v n a m i c a lc h a r a 咀e ro f c n z ? m ec a t a l j ：i c 7 卜 c t i o n f o i l o w i n gp u r i f l c a t i o n ，t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f c m d ei a c c a s ew a s4 0d e g r e e sa n dt h ep u r i f i e dl a c c a s ew a s3 0d e g r e e s t h eo p t i m u mr e a c t i o np hv a l u eo f c r u d el a c c a s e 、一 a s5 0 ，w h i l et l l ep u r i f i e dl a c t a s ew a s4 5 i m p o r t a n ti n n u e n c et ol a c c a s et l l r o u g hm e t a l i o ni n 、 o i v e dt h a tl a c c a s ea c t i v 时w e r eo b v i o u sp r o m o t e db ys o d i u m ，b i v a l e n tz i n c u h la n dc u p r u mi 蚰 r e s t r a i n e dt h ee n z y m er e a c t i o nb yc a l c i u l l li ns o m ee x t e n t ，w h i l er e s 喇n e de m i r e l yl a c c a s ea c t i v i t yb yb i v a i e n ti r o ni o n t h em i c h a e l i sc o n s t a n tt h a tl a c c a s eo x i d i z e2 ，2 一a z i n o d i 一( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 一6 一s u l p h o n i ca c i d ) ( a b t s ) w a sl5 4 7 啪o l l k e yw o r d ss t r a w ：f u n g i ：i i g n o c e l l u l o l y t i ce n z y m e s ：l a c c a s e 1 绪论 前言 木质素是植物细胞壁的重要组成部分，除苔藓和菌类外，一切植物都含有木质素 ( 约占植物体干重的2 0 ) ，在自然界中含量仅次于纤维素。据估测，全球每年可产生约 6 1 0 ”t 木质素，主要以造纸工业废水和农作物废弃秸杆形式存在，它是一种量大而又 可再生的有机资源。 能源紧张、粮食短缺及环境污染的日趋严重是目前世界各国所面临的难题。通过对 可再生资源的转化利用，能在有利于生态平衡的条件下缓解或解决这些问题。而这些清 洁、环保产业正作为一种新的工业生产方式日益受到技术发达国家的重视。 目前木质素的降解研究主要集中在木质素的生物降解机制、微生物种类及其产生的 本质素降解酶类、微生物的代谢调控机理等方面。通过菌株筛选、人工诱变、基因重 组、克隆技术筛选出特效高酶活降解菌，大规模应用于生物制浆、纸浆的酶法漂自、工 业有机废水的高效处理、生物饲料、生物乙醇应成为木质素微生物降解研究的热点领 域。 1 1 秸秆木质素生物降解的研究 1 1 1 木质素的化学结构 木质素的结构复杂，是一种杂聚物，其基本结构是类苯基丙烷( p h e n j lp 阳m ) i l ：) 多种共价键联成一种不溶性的、异质的、无光学活性的、不规则的、非结晶的、高度分 枝的三维大分子1 2 。3 i 。按照植物种类不同，木质素可分为针叶材、阔叶材和草本植物木 质素三大类。针叶材木质素主要由愈剖木基丙烷单元所构成，阔叶材木质素主要由愈创 木基丙烷单元和紫丁香基丙烷的结构所构成，草本植物木质素主要由愈创木基丙烷电元 和紫丁香基丙烷单元及对羟基苯丙烷单元所构成。这些单元的结构如图1 1 所示1 4 i 。 ；： ( 、 c c r， c e 土 i 3 。呲、跳。卫 6 h ( 、h ( k 盒创术羹丙嚣单元蘩丁看基丙靛单元 对羟基苯丙靛单元 图卜l 草本植物术质素的结构单元 乐北林业大学硕士学位论文 1 1 2 檀物中木质素的存在状态 农作物秸秆是指栽培粮食作物地上部分除籽实以外的部分。主要是碳、氢、氧等元 素组成的一系列有机物质，如纤维素、半纤维素、木质索等三种高分子聚合物，而且含 量高。另外还含有一些少量的营养物质，如单宁、果胶质、树脂、蜡、配糖物以及不可 皂化物等。目前我国秸秆饲料主要分为禾本科和豆科两大类，按产量大小依次为稻草、 玉米秸、小麦秸、豆秸等。秸秆主要成分为粗纤维，包括纤维素、半纤维素、多缩木糖 及镶嵌物质( 木质素、角质) 等1 5 l 。 一般说来，木质素在植物结构中的分布是有一定的规律的，胞间层的木质素浓度最 高，细胞内部浓度则减小，次生壁内层又增高。如用紫外显微分光法测定花旗松的胞间 层木质素为6 0 9 0 ；细胞腔附近为1 0 2 0 1 6j 。胞问层的木质素浓度虽高，但宽度 窄而容积小，因而胞间层的木质素占全部木质素的比例，春材为2 8 ，秋材为1 8 。木质 索和半纤维素一起作为细胞间质时，填充在细胞壁的微细纤维之间，加固木化组织的细 胞壁；当木质素存在于细胞间层时，把相邻的细胞粘接在一起，如图l 一2 所示i ”，木质化 的细胞壁能阻止微生物的攻击，增加茎干的抗压强度。木质化能减小细胞的透水性，对 植物中输导水分的组织也很重要。 p 罐麓 震辩解约书襄，铃子! l ：= 雄 图l - 2 木质素存在状态示意图 f i gl 一2s k e t c hm a po fe x n gs t a t e 仔o mi j g n i n ( 引白宋哲玉，1 9 9 6 ) 1 1 3 木质素生物降解的微生物 ( 1 ) 真菌 在自然界中，木质素的降解是真菌，细菌和其它微生物群落共同作用的结果，其t p 真菌起主要作用。人们根据木材的腐朽类型把这类微生物分为3 个主要的类型：白腐 菌使木材呈现白色腐朽的真菌：褐腐菌使木材成褐色腐朽的真菌；软腐菌 使木材成黑色腐朽的真菌。前两者属于担子菌和子囊菌，软腐菌属于子囊菌或半知菌 类。白腐菌产生细胞外过氧化物酶分解木质素，其降解木质素的能力优于其降解纤维袭 的能力，这类菌首先使木材中的木质素发生降解而不产生色素，白腐菌具有强，- 的，群 水质亲的能j ，因此被认为是最主要的术质素降解微生物，自然界中木质鬃的降解! ：妥 绪论 靠白腐菌来进行【3 】。 到目前为止，人们发现并已研究的白腐菌有很多种，主要包括拟革盖菌( c b r f ，o 肼西 g 口，f 耙口) 、黄孢原毛平革菌( 肋伽，d 曲删船曲唧d ，f “，z ) 、豹斑革耳菌( 心s ，逛y 加淞) 、 异担子菌( k f p ，d 6 船触。聊口朋d s “m ) 、多孔菌( p d 厶p d r 淞p f 珊f f 蚶) 、黄迷孔菌( d 口p 幽尼d 肋v 胁) 、浓烟管菌( 毋盯妇”出m 日批曲、血红显毛菌( p 幻疗鲫c 触p 把船鸺 加8 、绒毛革 盖菌( c l o r f o 胁v f ，z 淞) 、变色栓菌( 7 砌m p f p jv e 搿耙o ，d ，) 、贝壳状革耳菌( 忍n 淞邶 口，淞) 、彩绒革盖菌( c o ，f d ，“s 如“以) 、射脉菌( p 拓6 血r 口砒m ) 、风尾菇( 肌“阳f “sp “加d n 口”螂) 、朱红密孔菌( 户弦h 印o ，淞c 加m 6 口，j ”“s ) 等等。白腐菌属子囊菌和担子菌，经其腐朽的木 材成白色，菌丝沿着细胞腔蔓延，主要集中在纹孔处，白腐菌能把木质素和纤维素彻底 降解为二氧化碳和水。发生白腐时，木材表面直接与真菌菌丝接触后才被分解。自腐早 期的变化是紫丁香基和愈创木基上甲氧基的脱甲氧基作用，形成儿茶酚后再在真菌加氧 酶作用下使芳香环破裂形成脂肪酸。自腐菌亦能氧化分解木质素的侧链，使其变短一一 驯。 除白腐菌外还有褐腐菌和软腐菌，但降解木质素的程度都不完全。褐腐菌主要为担 子菌，常见的有拟管革裥菌( 三p m f ，p sn 6 ) 和卧孔菌( p o r 妇d ，f c o 胁) 等l8 种真菌= 它们对木质素分解能力较弱，但是能有效地降解木材中的纤维素和半纤维素1 2 “。在降解 木质素时，主要是使木质素发生氧化性的脱甲氧基作用，一般不能有效分解芳香环，很 难进行进一步代谢。同白腐菌一样，在有些褐腐菌，如凡o 伊o ，“s 肿和，博也能发现 降解木质素所需的过氧化物酶，但降解能力与自腐菌相比，有很大差距【”。 软腐菌主要是一些子囊菌和半知菌，软腐菌只有在那些不适合白腐菌和褐腐菌生长 的条件下才能占据主导地位，如极端干旱和潮湿的环境，而且软腐菌与白腐茵和蝎腐 菌相比，能忍受更加广泛的生长温度、湿度、p h 和氧气条件，特别是在适宜耕种豹十 地中，软腐菌是最重要的木质素分解菌群1 2 “i 。与白腐菌相反，在氮源充足的条件下， 软腐菌可更加有效的降解木质素。常见的软腐菌有：拟青霉属( p 口p f f 如脚 p s ) 、粘束绝 属( g ，“，) ，z ，) 和梭孢壳属( 砌f p ，h v 妇) 中的菌类。由于软腐菌在降解木质素的同时篚 分解纤维素，所以应用范围不十分广泛。软腐菌分解木质素主要是脱甲氧基作用，对软 腈菌降解木质素的机理研究较少。 ( 2 ) 细菌 在降解本质素的细菌中，主要有假单孢杆菌属l p “咖彻珊) 、诺卡氏菌属( m 蛾m “ ( 小巨大芽孢杆菌( b 川wm 馏“f p ，m m ) 、黄杆菌属( 爿口阳6 “c ，e ，f f m ) 、气杆菌属( 爿p ，”m c “) 和黄单孢菌属( 皿j ， o m d ”哪! 等。不同细菌对木质素的降解途径也不一样1 2 。 ( 3 ) 放线菌 降解木质素的原核微生物以放线菌为主，如链霉属( & f 印胁叼，v ) 、节杆菌属( 。 ，m ，“，) 、小单孢菌属( 蜥c m m o d j p o ，“) 等。a n t a i sp 等人研究了绿孢链霉 1 研比，f 砂，j ，。f m 甲w z “j 和余氏链霉，y ，m m m c x p f f f ) 对木质素的降解，结果证明这 阿株简能使z 杉、漆树中的木质索降解j ! 4 4c k ；j 。“”，这对放线菌在该领域的应 量 东北林业大掌硕士学位论文 到了很大的鼓舞作用。放线菌虽能降解木质素，但只是发生脱苯环和脱甲氧基作用，降 解能力较弱，主要的作用是使其结构改变，更易于分解。 “) 其它 此外，很多植物病原微生物，如肋泐肌坍缸s 础碱尼删f 泐肠等也具有分解木质素 的能力，可能与它们侵染寄主的能力有关，但这类微生物在处理植物残体上的应用前景 不大川。 1 2 白腐菌的研究进展 1 2 1 白腐菌的生物学背景 白腐菌( w h i t em tf u n g i ) 是一类丝状真菌，它可以真接入侵木材质的细胞腔内，释 放降解木质素和其它木质组分( 纤维素、半纤维素、果胶等) 的酶，导致木材腐烂成白色 海棉状团块，故因此而得名。分类上，白腐菌属真菌门，绝大多数为担子菌纲 ( b a s i d i o m y c e e s ) ，少数为子囊菌纲，包括多孔菌、侧耳、香菇等2 0 0 多个品系。 | d “”p m c 胁p 佗c l 脚印d r m 朋是其典型种、属非褶菌目，中文名黄孢原毛平革菌，已成为 研究木质素降解的模式菌。 白腐菌最突出的功能在于，它是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物，可 彻底降解木质素为c o ! 和水，在自然界的碳素循环中起关键作用| 8 0 2 蚓。而褐腐菌、软 腐菌、放线菌、细菌等一般认为在木素降解中仅起二次性作用瞄4 ”j 。白腐菌分泌木质素 降解酶系的同时，还有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等活性，因而比木霉、曲霉等更 适合分解天然的木质纤维素物质旧”】。 在基础领域方面，多数研究者以美国麦迪逊国家林产品研究所的黄孢原毛平董蓥、， ( 协j ”d 妒c r m 卅) 为研究对象，并从中分离出与木质素降解相关的酶系木质素过氧化物酶 ( 1 i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 和锰过氧化物酶( m n - p e m x i d a s e ，m n p ) ，并对这些酶的分毒提 纯、特性、生物催化机理、分子生物学和产酶最适培养参数等方面作了大量研究“， j o n a l l s s o n 等人曾报道，7 砌，”p 据j1 ，p s f c d ，0 r ，上p ，加“肠c 幽如和尸 止 胁，( ，肼c ，似也能产锰 过氧化物酶，秦小琼等也报道了红栓菌( j d 弦月d 阳sc j 胛h 6 “r j w ) 等能产胞外漆酶陋： 在研究白腐菌降解木质纤维素的次序问题上，e r i c k s s o n 和h i g h l e y 等人的研究发现在 白腐菌腐朽木材时，菌丝体先穿透多聚糖层( 半纤维素) ，然后才开始降解木质素和纤 维素。在应用研究方面，白腐菌应用于环境治理等方面的研究较多，张晓昱等人将自腐 菌技术应用于造纸工业、饲料工业、发酵食品工业、生物肥料和环境保护等领域的研究 取得很好的成果【4 “”j 。 1 2 2 白腐菌对木质素的生物降解 白腐菌除对木质素有降解作用以外，还对众多结构各异的有机物大分子物质如多且 芳香族化合物，氯化芳香族化台物，农药，染料等表现出独特的降解敏感性，出j 。乓毽 特的降解能力，吸引入躬去进一步提示其机制的奥秘科学家们经 儿年系统寞芑哆毫 绪论 己在整体上对白腐菌的降解机制作了阐述，它们的主要规律及相关概念如下： ( 1 ) 降解启动条件 自腐菌的降解活动只发生在次级代谢阶段，与降解过程有关的关键酶只有当些主 要营养物，如氨、碳、硫限制时才形成，产生酶的这种营养限制称为木质索降解条件 f l i g n i o i v t i cc o n d i t i o n l 【2 9 j b3 川。 ( 2 ) 降解的主要酶系统 白腐菌在对营养限制作应答反应时形成一套酶系统陋3 6 跬5 6 】： 产生h ! 0 2 的氧化酶：细胞内葡萄搪氧化酶和细胞外乙二醛氧化酶。它们在分子氧 参与下氧化相应底物而形成h 2 0 2 一激活过氧化物酶，启动酶的催化循环。 木质素过氧化酶( l i g n i np e r o x i d a s e l i p ) 一胞外酶，需h 2 0 2 ，含血红素，氧化还原 电位很高( 可氧化电离能达1 5 v 的非酚环坏) ，催化非酚类芳香族底物。 锰过氧化物酶( m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ，m n p 卜胞外酶，依赖m n ( i i ) ，需h 2 0 ! ，含血 红素，氧化还原电位较l i p 低，催化酚类、胺类及染料等依赖m n 的氧化。 需0 2 的多酚氧化酶：漆酶( 1 a c c a s e e c1 i o 3 ! ) 一胞外酶，需o ：作为氧化剂，含 c u 的氧化酶，氧化还原电位更低，催化木质素相关酚类的电子氧化，尤其是丁香型本 质素，形成酚氧基，导致ce l 氧化芳香基一c 断裂以及侧链上c 吐一c d 之间断裂。 还原酶、甲基化酶、蛋白酶、纤维素酶及其它酶。 以上酶的全部或部分共同组成白腐菌降解系统的主体。 ( ： j 降解是以自由基为基础的链反应过程 过氧化物酶是反应启动者，先形成高度活性的自由基中间体( 如黎芦醇离子、氧离 子、羟基自由基等) ，继而以链反应方式产生许多不同自由基，促使底物氧化。这种自 由基反应是高度非特异性和无立体选择性的，致使降解对象并非是酶于底物的一一对立 关系，而是一类乃至多类底物的关系口二”】。 ( 1 ) 降解活动是细胞外送行的 细胞学定位表明，降解发生在细胞外，这种细胞外降解系统为众多不可水解的异 质的，结构复杂的大分子有机物提供更易被处置的调节环境。l i p 和m n p 只有在深度 脱木素后，才能渗入木材纤维的s ! 层陋。利用抗血清及免疫金标记技术，在细胞壁降 解阶段对l i p 、m n p 和l a c 进行定位，发现这些酶并不进入完好的、未被降解的术材 内。而且在木腐的初期阶段，细胞壁内也未发现降解木素的酶p ”。研究证明：大分子的 蛋白，例如分子量大于4 0 0 0 0 d a 的降解酶类，明显地不能穿过完整木材中的微孔结构。 只有当细胞壁发生了深度破坏，才在次生壁胞间层中发现了酶。f l o u m o v 等f 对细胞 壁空隙容积及大小进行研究发现：完整木材表面微孔的最大直径为2 n m 。在木材白腐过 程中，当失重达4 0 时，孔径也仅为2 5 n m 。这说明，在降解初期，白腐菌降解发生 在细胞外。余惠生卜叫以稻草生物降解为例进行电镜分析的结果显示，白腐菌通过臣 ： 表面的气孔或端部侵入稻草内部，并在薄壁细胞和细胞腔内部繁殖，通过纹孔或在争：也 建造j i ；询两周蔓延，在稻蕈组织冈矗嚣，薄蹙细胞酋先被菌破坏分斛，然后腱：【j j 堪物，l ，兰 东北林业大学硕士学位论文 渐分解，导致纤维解离。在上述过程中，白腐菌首先选择性攻击稻草纤维细胞壁中木素 浓度最高的胞阀层部位，然后逐渐分解纤维次生壁木素，但未见白腐菌降解木材纤维 时，发生纤维细胞壁交薄直至破坏的现象。上述降解稻草的微观过程与一般报道的白腐 菌降解木材的微观过程差别较大。 所以从总体上看，白腐菌的降解机制是：依赖一个主要由细胞产生分泌的酶系统组 成的细胞外降解体系，需氧并靠自身形成的h 2 0 2 激活，由酶触发启动一系列自由基链 反应，实现对底物无特异性的氧化降解，主要包括单电子氧化、酯质氧化、共代谢等过 程 删。 1 2 3 木质素降解尊 1 2 3 1 木质素过氧化物酶( l i p ) ( 1 ) 分布及种类 【i p 是第一个从黄孢原毛平革菌发现的木质素降解酶，在木质素降解中起关键性作 用。l i p 的产生菌在自然界分布相当广泛，许多腐朽木材的自腐菌、褐腐菌都可以产生 l i p 。 ( 2 ) 结构及特点 l i p 代表一系列含f e ”、卟啉环( i x ) 和血红素附基的同工酶，由不同微生物产生啬勺 酶的种类和理化性质各不相同。 l i p 的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化台物，在通过电子传递体攻击 木质素时，它能从苯酚或非酚类的苯环e 夺取一个电子，将其氧化成自由基，继而以链 式反应产生许多不同的自由基，导致木质素分子中主要键断裂。 ( 3 ) 基因结构及表达 在分子生物学领域，已经克隆出的l i p 基因家族，同源性很高。核型分析表明，异 源真核菌株约含l o 个染色体，而l i p 基因至少被分布在两个染色体上。l i p 序列排列紧 密且高度保守。在异源表达上，已得到许多重组l i p ，但重组l i p 的功能有所改变，虹 催化能力改变，不再受m n 抑制等。 11 2 _ 3 2 锰过氧化物酶f m n p ) ( 1 ) 分布及种类 m n p 与l j p 一样，都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶，因二者都含有立红 素，又称血红素过氧化物酶。m n p 的主要产生菌主要是些白腐真菌，多属担子菌亚 门，无隔担子菌亚纲，非褶菌目的多孔菌科。 ( 二) 结构及特点 m n p 的晶体结构中包括1 7 的中性糖类和大量酸性氨基酸，血红索上仅有一个 m n 二+ 的结合位点，m 1 1 p 在木质素降解过程中，m n 0 2 可保护l j p 免受h 2 0 ! 的损伤。；丘 在【肛n p 组合酶体系中，高浓度的m n 或m n 。，加上合适的螯合物，会导致l j p + 丘 抑制，1 n p 的诱导。可见，m n 对【，i p 和m n p 部具有重要的作用，且作用大小j 锰焉i 的浓度及添加时间有关1 6 “。 m n p 的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中，m n p 和h 2 0 二的启动 下，氧化m n 2 + 为m n 3 + ，然后，m n ”氧化苯酚生成苯氧残基。这与l i p 氧化苯酚的方式 有明显不同。 ( 3 ) 基因结构及表达 从胞外液中分离出至少m n p 的同工酶，均有多基因编码。m n p 基因有6 或7 个内 含子，n 端有2 1 或2 4 个氨基酸的信号肽，但无前体肽。启动区包括大量热休克元件和 序列，这些元件与哺乳动物金属硫蛋白基因中的金属调节元件相同口。3 1 。在基因表达方 面，m n p 的产生明显依赖m n 浓度、培养基、热休克、c 和n 源变化，且调节是在转 录水平上。 1 _ 2 3 3 漆蕊( l a c ) f 1 ) 分布及种类 漆酶存在于自然界的多种植物和菌类分泌物中。按其来源主要分为漆树漆酶 r s l a c c a s e ) 和真菌漆酶( f u l l g a ll a c c a s e ) 两大类。根据研究资料介绍，漆树、野漆树、芒果 等漆树科植物和桃树、苹果、银杏、牛蒡、毒常春藤、马铃薯等植物中富含漆酶；在真 菌中，漆酶广泛存在于担子菌( b a i d i m y c e t e s ) 的多孔菌( 肋o p d m v ) 、子囊菌( q _ n ，砂删f p j ) 的 脉孢菌( 舰2 f u 印d r “) 和柄孢壳菌( 尸d 如印o m ) 及半知菌( d 蹦，p ，d 研伽，f ”a ) 的曲霉菌 ( 一4 f p p 馏f ，) 等h 。“。g i v a u d a n 等还从稻根中分离出产生漆酶的细菌一生脂固氮螺菌 ( a z o s p j r i l i u mi i p o e r u m ) 【6 ，这是第一个从细菌中发现的漆酶。d i a m a n t i d i s 等( ：0 0 0 ) 还从根际土壤的生脂固氮螺菌( 爿，咖q ，吝r “m ) 中提纯漆酶，并测定和分析了漆酶的特征 。最近很多报道表明漆酶广泛存在于细菌中1 6 8 7 ”，在昆虫体内也发现了漆酶的存在i 。 “。，甚至在些动物肾脏和血清中也陆续发现了漆酶陋“j 。但目前最主要的生产菌仍是 一些大型真菌。 ( ：) 结构与特点 漆酶是一种铜蛋白，一般以单蛋白体的形式存在。不同来源的漆酶蛋白质表观分子 量有很大的差异，从5 9 3 9 0 k d a 不等，但组成漆酶的数种同工酶皆为糖蛋白( 含有 1 0 8 0 糖残基不等) ，都为单体酶，酶分子中一般都含有4 个铜离子。这4 个铜离子 处于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。由光谱和磁性特征分析得漆酶的结构 如图1 3 ：一个i 型c u ”和氨基酸残基结合成单核中心，它使酶表现为明显的蓝色且在 6 0 0n m 处有吸收。一个i i 型c u 和两个i i i 型c u 4 + 构成三核中心，两个i i i 型c u 。偶连 于一个羟基桥，形成了双核，这种结构引起了电子顺磁共振效应的消失1 7 。l 。 ( ： ) 漆酶催化氧化反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应机理主要表现在底物自由 基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。底物结合于酶活性中心的i 型n 位 点，通道c y s h i s 途径将其传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中 心的筇：底物氧分子，使之还原成水。整个反应过程需要连续的单电了氰化作用来满j i 埘嘶s 、，一 怂曲h h i s 秽 h i s c u 。| 。、 图卜3 漆酶结构图示 f 唔l 3p i c t o r i a lm o d e lo fl a c c a s e ( c o p p e rc e n t e r s ) ( 引自谭东，1 9 9 4 ) 漆酶的充分还原，还原态的酶分子再通过四电子转移传递给分子氧。在此过程中，氧还 原很可能分两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体在另外两单电子作 用下被还原成水。例如：当漆酶催化氢醌氧化时，首先是底物氢醌向漆酶转移一对电 子，生成半醌一氧自由基中间体。其次是不均等非酶反应，二分子半醌生成一分子对苯 醌和一分子氢醌| 7 ”。漆酶催化底物氧化和对0 2 的还原是通过四个铜离子协同地传递电 子和价态变化实现的，其过程如下图【： q 】：- ( 1 u 2 ( ：u ，“ h lj l 一钮化悫) t t i 惫急j 篓；彗斗c u ：弋p c u ，：+ 三生+ i -c u ：+ c u ：+ c u ，：+ _ 三+ 电r 转移 一 蠊吻 罢裂+ c u ：c 。：+ i c 。， 一h ，o 性 。 c u 2 呵u 2 c u ，4 r i l i l i l 一复化态、 r ”漆酶基因的克隆 运用p c r 技术和c d n a 文库技术，越来越多的漆酶基因被克隆，许多来源的基蜀 都是以家族形式存在于染色体上的。这些来源不同的基因表现出较高的同源性。目f 狐将 近3 0 种不同来源的漆酶基因已被克隆和测序，包括r 舭j o c ，mms d 肠 妒、( f 删4 、r 、d ，y ? f d ，d ，7 8 。8 州、户r 西讲口f 8 、r v 删o s 一8 2 8 引、厅“s f 加删w p 伦p m l f 84 | 、6 珊胁d 卅r ( f ，一f 6 2 ( c e c t2 0 19 7 ) 、p c 加盯“6 口厂f 玎w 、州j s j “和 4 5 胛馏i ，船门f 如胁行8 s i 等等。但 是，并不是所有的产漆酶菌株都能克隆到相应的p c r 产物。随着在这一领域的深入研 究，将有助于揭示漆酶的表达本质并实现对其的人为控制。 r j ) 漆酶基因的异源表达 对漆酶基因的克隆和序列分析，实现其高表达并得以应用是一个重要的目的。吩i 多 种漆酶自身的表达量很低，在异源宿主上表达重组漆酶蛋白是解决这一问题的。、仃夏 途径，吲此青：有人研究凛酶的异源表达二1 9 9 f j 年k o i i l l l a 首次将( 枷j ? t ，：t 丧 卢 绪论 降解酚氧化酶进行了克隆和在酵母系统龇c 施m 栅”p sc p 坨v 括胁p 中表达l7 6 l 。随后人们研 究不同的表达系统来实现漆酶高效表达。甲基营养酵母p 七 胁口甜f d r 时系统成功表达了 若干种不同来源的漆酶，如zw 坶f c d 胁、r 鲫犯砌p 日和pc m 棚6 d ，胁“s 。除此之外 s c p 胛v 打缸p 、7 = 比聊f 、一印p ，鲥船。叫掰p 、a 打趣y 和一疗磁j 肠珊1 8 卅也成功地应用于真菌漆 酶的异源表达宿主。最近细菌b 伽珊淞s 曲r f f 西漆酶基因c o 认在西c 盯肼曲c o f f 中成功 地进行了表达【9 。使漆酶的大规模工业生产和应用成为了可能。 ( 6 ) 漆酶的测定方法 漆酶酶活的平板分析法：用这种方法可以快速检测臆外培养中是否含有漆酶，一 般用于粗筛产漆酶菌种。刘尚旭等以b a v e n d a m m 反应来检测漆酶，主要是把白腐菌 产生的漆酶与本质素降解能力联系起来。由于漆酶有广泛的底物作用范围，在 b a v e n d a m l n 反应的基础上发展了许多检测漆酶的方法，其原理和方法基本与 b a 、e n d 姐1 m 法类似。如蔡磊等报道的用丁香醛连氮法检测漆酶f 9 1 l ；朱显峰等利用漆酶 与三种不同底物的颜色反应定性的检测1 1 种白腐菌是否产漆酶( 愈创木酚与漆酶反应 显浅红色、联苯胺与漆酶反应显黄色、a 一萘酚与漆酶反应显紫色) ，其中愈创木酚和d 萘酚两种方法检测结果较为统一和准确p “。 一些底物由于自身的原因限制了与之相关检测方法的广泛使用。如，愈创木酚反 应对术质氧化酶专一性不强；联苯胺有一定的致癌作用；c 【一萘酚对皮肤有刺激作用并对 环境不友好。赵敏博士一4 j 总结并改进了前人的丁香醛连氮法，一次检测了3 4 个菌种， 确定了】3 个菌种有漆酶活性。s o u z a 等以a b t s 为底物，甘氨酸l i c 【为缓冲液( p l l = 、) 、 分别将胞夕卜液、煮沸的胞外液及漆酶溶液放入无菌的琼脂糖培养基的小坑中，用煮沸的 胞外液及漆酶溶液对底物的反应分别作为正、负对照，如果胞外液所在的小坑边缘有类 似漆酶溶液所在小坑边缘的那种强烈的蓝绿色，则此胞外液呈漆酶的阳性反应，表示有 漆酶俐。 用分光光度计测定漆酶活性：由于不同来源( 植物、细菌、昆虫、真菌) 的漆酶 与底物反应的亲和力是不一样的，即使是同一来源的漆酶，反应的底物不同，反应的亲 和力也不同；酶活测定方法中所用的反应底物、反应条件以及酶活单位的定义对漆酶酶 活的测定结果也有很大的影响。 以a b t s 为底物，用分光光度计测定漆酶酶活。以a b t s 为底物测定漆酶酶活是目 前图外最为常见的方法之一。它有如下优点：( 1 淤b t s 易溶于水，在室温下放罱6 个月 仍较稳定。f 2 ) 其反应只有一步，即从a b t s 到它的阳离子自由基a b t s 的阳离子