（分析化学专业论文）用于检测汞离子及腺苷的dna生物传感器研究.pdf

硕士学位论文 摘要 汞离子是一种在环境中普遍存在的污染物，其毒性非常大，不易被降解，并 能通过甲基化作用转化成有机汞，并通过食物链产生富集效果，最终导致在人体 内积累，对人类的健康和生命造成严重的威胁。汞能引起很多严重的疾病，例如： 对d n a 的破坏，对肾和肝脏的破坏，对大脑以及引起中枢神经的破坏、使心肌 梗死的危险增大等。因此，对环境中的汞离子污染进行检测与监控十分必要，而 且有很重要的意义。 近年来核酸适体得到了广泛的研究与应用。利用核酸适体高特异性结合目标 物的特性发展的生物传感器对代谢物、d n a 、蛋白质等物质进行临床疾病的快 速、准确的检测与监控，是分析化学中非常热门的研究课题之一。 在本研究论文中，主要包括以下两方面内容： ( 1 ) 基于t h 9 2 + - t 结构构建的汞离子传感器 在第二章中，我们研制了一种基于t - t 碱基错配特异性键合汞离子的荧光传 感器用于汞离子的检测。该传感器由两条分别标记了荧光基团( f ) 和淬灭基团 ( q ) 的d n a 探针组成，并且含有两对用于结合汞离子的t - t 错配碱基。实验 考察了温度对传感器的影响，以及其它金属离子的干扰。实验结果表明，该传感 器选择性好，动力学响应范围为5 0 n m 到1 0 0 0 n m ，检测下限为7 9 n m 。 在第三章中，结合链置换的原理，研制了一种新型的用于检测水溶液中汞离 子的电化学生物传感器。该传感器的基底是在电极表面利用l ，6 二巯基己烷组 装了一层金纳米颗粒，这种结构可以增加探针在电极表面的固定量，而且，有利 于电子的传递。一条与汞离子特异结合的探针与电极表面固定的探针杂交。在汞 离子存在的情况下，胸腺嘧啶与汞离子形成t h 9 2 + _ t 结构，破坏了两条探针的 稳定结构，使得汞离子特异结合探针从电极表面脱离。因此，吸附在电极表面剩 余d n a 上的电活性指示剂亚甲基蓝会减少，导致了电流信号的减弱。这种氧化 还原电流的改变可以反映被分析物的浓度。而且，在一定范围内，电流信号与目 标物浓度的对数呈线性关系，目标物浓度可达5 0 0n m ，检测下限为0 3n m 。该 传感器有很好的灵敏度、选择性，并且可运用在实际样品的检测中。 ( 2 ) 基于核酸适体检测腺苷的荧光生物传感器 在第四章中，基于核酸适体对目标物的强亲合力和高识别性，研制了一种以 腺苷为分析模型的灵敏、特异的新型荧光分析方法。该方法应用了两种纳米材料 标记的核酸探针一核酸适体修饰的磁性纳米颗粒和核酸探针p l 修饰的金纳米颗 粒。利用腺苷诱导核酸适体的构型转换导致与其杂交的金标核酸探针被置换，置 用于检测汞离了及腺苷的d n a 生物传感器研究 换下来的纳米金标记物进而催化抗坏血酸将铜离子还原为金属铜并沉积在金纳 米颗粒上，使铜离子对钙黄绿素的荧光淬灭得到抑制。由于极少量的纳米金可催 化大量的铜离子还原沉积，使铜离子浓度急剧降低，从而灵敏改变钙黄绿素的荧 光信号。实验结果表明，用这种方法检测腺苷得到的动力学响应浓度范围为 1 o x l o 1 1 到1 0 1 0 一m ，检测限为1 0 1 0 。1 2m 。 关键词：汞离子；朐腺嘧啶；荧光传感器；电化学传感器；核酸适体；纳米颗粒； i l l 硕上学位论文 a b s t r a c t m e r c u r yi o n si sav e r yp o p u l a rt o x i cp o l l u t a n ti ne n v i r o n m e n t ，a n dc a nh a r d l y b ed e g r a d a t e d m e r c u r yi o n sc a nb ec o n v e r t e dt oo r g a n i cf o r mb ym e t h y l a t i o ni nt h e n a t u r a lw o r l da n dc o n c e n t r a t e dt h r o u g ht h ef o o dc h a i n ，c a u s i n ga c c u m u l a t i o no f m e r c u r yi nh u m a nb o d i e s ，c a u s i n gas e r i o u st h r e a tt oh u m a nh e a l t h m e r c u r yi o n s w o u l dr e s u l ti nm a n yd i s e a s e s ，s u c ha sd n ad a m a g e ，k i d n e ya n dl i v e rf a i l u r e ，a n d b r a i na n dn e u r o l o g i c a ld a m a g e ，i n c r e a s i n gr i s ko fm y o c a r d i a li n f a r c t i o n ，a n ds oo n t h e r e f o r e ，i ti sv e r yn e c e s s a r ya n ds i g n i f i c a n tt od e t e c tt h em e r c u r yi o n si n e n v i r o n m e n t i nr e c e n ty e a r s ，a p t a m e r sh a v eb e e nw i d e l yr e s e a r c h e da n du s e d b a s e do nt h e h i g ha f f i n i t yo fa p t a m e r , m a n yb i o s e n s o r sw e r ed e v e l o p e df o rt h ea c c u r a t ea n dr a p i d d e t e c t i o no fm e t a b o l i n ，d n a ，p r o t e i na n ds oo n a n di ti sa n o v e l ，a t t r a c t i v ea n dh o t t o p i ci nt h ec u r r e n ta n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h es e n s o r sf o rm e r c u r yd e t e c t i o na n da p t a m e r b a s e ds e n s o r sh a v eb e e nt h e s u b j e c t so ft h ep r e s e n tt h e s i s ，t h ed e t a i lm a t e r i a l sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) b a s e do nt - h 9 2 + - tc o n f i g u r a t i o nf o rd e t e c t i n gm e r c u r y ( i i ) i nc h a p t e r2 ，w ed e v e l o p e dah i g h l ys e l e c t i v ef l u o r e s c e n c es e n s o rf o rh g ( i i ) i o n d e t e c t i o ni na q u e o u ss o l u t i o n sb a s e do nt h es e l e c t i v eb i n d i n go fh g ( i i ) i o n sw i t ha p a i r o f t h y m i n e - t h y m i n em i s m a t c h t h es e n s o rc o n s i s t so ft w od n ap r o b e s f u n c t i o n a l i z e dw i t haf l u o r o p h o r e ( f l u o r e s c e i n ，f ) a n daq u e n c h e r ( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，q ) m o i e t ys e p a r a t e l y w ei n v e s t ig a t e da n do p t i m i z e de x p e r i m e n t a l v a r i a b l e s i n c l u d i n gt h et e m p e r a t u r eo fh y b r i d i z a t i o na n di n t e r f e r e n c ei o n s t h e r e s u l t ss h o w e dt h eb i o s e n s o rh a sg o o ds e l e c t i v i t y , a n dt h el i n e a rr a n g ec o v e r s10 0t o 5 0 0n m ，a n dt h el i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) i s7 9n m i nc h a p t e r3 ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f m e r c u r yi o n si na q u e o u ss o l u t i o nh a sb e e nr e p o r t e d t h es e n s i n gs u b s t r a t ew i t ha l a y e ro fg o l dn a n o p a r t i c l e so nt h eg o l de l e c t r o d e s u r f a c ew a sf o r m e dt h r o u g h 1 ，6 - h e x a n e d i t h i o lt r e a t m e n t ，w h i c hc o u l de n h a n c et h es u r f a c el o a d i n go fc a p t u r e p r o b ea n di m p r o v et h ee l e c t r o nt r a n s f e rp e r f o r m a n c e a n o t h e rd n ap r o b eu s e da s m e r c u r yi o ns p e c i f i cb i n d i n gp r o b eh y b r i d i z e dw i t hc a p t u r ep r o b e i nt h ep r e s e n c eo f m e r c u r yi o n s ，t h ee a s yf o r m a t i o no ft h y m i n e - h 9 2 + - t h y m i n es t r u c t u r ed e s t a b i l i z e dt h e h y b r i dc o m p l e xa n dc a u s e dm e r c u r yi o ns p e c i f i cb i n d i n gm s bp r o b er e l e a s e df r o m t h ei n t e r f a c e a st h er e s u l t ，t h ea m o u n to fe l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o rm e t h y l e n eb l u e a d s o r b e db yt h er e m a i n e dd n ao nt h ee l e c t r o d es u r f a c ed e c r e a s e d ，l e a d i n gt ot h e i v 用于检测汞离了及腺苷的d n a 生物传感器研究 | e = 自= = | j 目目= e = = e = 目目l l 目自e 自= ! = ! ! ! ! = = = ! = ! = ! = = = g i i l mm m _ 目目l e l l l = ! 自目目鲁目目g 目= g d e c r e m e n to ft h ec u r r e n ts i g n a l t h e r e f o r e ，t h ec h a n g eo ft h er e d o xc u r r e n tc o u l d r e f l e c tt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ea n a l y t e al i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec u r r e n t s i g n a la n dt h el o g a r i t h mo f t h et a r g e tc o n c e n t r a t i o nu pt o5 0 0n mw a so b t a i n e d ，w i t h ad e t e c t i o nl i m i to f0 3n m t h ef a b r i c a t e ds e n s o ri ss h o w nt oe x h i b i th i g hs e n s i t i v i t y ， d e s i r a b l es e l e c t i v i t ya n de x c e l l e n ta p p l i c a t i o ni nr e a ls a m p l ea n a l y s i s ( 2 ) a p t a m e r b a s e df l u o r e s c e n c eb i o s e n s o rf o rt h ea d e n o s i n ed e t e c t i o n i nc h a p t e r4 ，b a s e do nt h eh i g ha f f i n i t ya n ds e l e c t i v i t yo fa p t a m e ra n dt a k e n a d e n o s i n ea sam o d e la n a l y t e ，w ed e v e l o p e dan o v e l ，s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e f l u o r e s c e n c eb i o s e n s o r t w ok i n d so fn a n om a t e r i a l sw e r eu s e di nt h i sm e t h o d ，o n ei s t h ea p t a m e r - l a b e l l e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e ，o n et h ei sd n ap r o b ep 1l a b e l e dg o l d n a n o p a r t i c l e t h ep r e s e n t so fa d e n o s i n ew o u l di n d u c et h ea p t a m e rc o n f i g u r a t i o n c h a n g i n ga n dt h ed i s p l a c e m n e n to ft h eg o l dn a n o p a r t i c l e s u b s e q u e n t l y , t h er e l e a s e d g o l dn a n o p a r t i c l ew o u l dc a t a l y z et h er e d u c t i o no fc o p p e ri o n st oc o p p e r ，a tg o l d n a n o p a r t i c l es u r f a c e i tw o u l dr e s t r a i nc o p p e ri o n sq u e n c h i n gt h ef l u o r e s c e n c eo f c a l c e i n ，t h es i g n a lo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw o u l di n c r e a s es h a r p l y t h e r e s u l t s h o w e da d e n o s i n ec a nb ed e t e c e df r o m1 o lo 1 1t o1 0 10 一m ，w i t ht h ed e t e c t i o n l i m i t1 0 1 0 1 2m k e yw o r d s ：m e r c u r yi o n s ；t h y m i n e ： f l u o r e s c e n c es e n s o r ；e l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r ： a p t a m e r ； n a n o p a r t i c l e v 1 1 生物传感器 第1 章绪论 利用生物特异性识别过程来实现检测的传感器件称为生物传感器( b i o s e n s o r ) 。 生物传感器中的生物敏感元件包括生物体、组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、 抗体、核酸等，生物传感器就是利用这些从微观到宏观多个层次相关物质的特异 性识别能力的器件总称。它涉及生物学、化学、固体物理学、微电子学等等。它 融合了信息技术和生物技术，在临床诊断、食品和药物分析、环境保护以及生物 技术、生物芯片等领域有着广泛的应用前景【2 j 。 1 1 1 生物传感器的结构与原理 一般的生物传感器有以下共同的结构：包括一种或数种相关生物活性材料 ( d n a 、r n a 、多肽、抗体、抗原、酶、蛋白质、生物膜等) ，以及能把生物信号 转换为光、电等信号的物理或化学换能器( 传感器) 。将二者组合在一起，再利用现 代微电子和自动化仪表技术，就可以构成各种可以使用的生物传感器分析装置、 仪器和系统。 生物传感器以固定化的生物敏感元件作为生物敏感单元，与被测目标高度选 择性的发生反应，换能器则能敏感追踪生物敏感单元与目标物之间的作用过程， 并将其表达为可检测的物理信号。当待测物与具有分子识别作用的特殊物质固定 在换能器内( 或表面) 生物敏感单元作用时，产生光学、热学、压电学或电化学等响 应信号，最后把所得的电信号经过电子技术的处理后，在仪器上显示或记录下来， 其信号大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检测。 生物敏感单元是生物传感器的关键部件，由基质和生物敏感元件组成。可做敏感 材料的生物材料有：酶、微生物、生物组织、细胞和d n a 等。由于待测物与生物 组分之间产生可逆识别，因此，传感器在保持生物敏感组分有效活性情况下，可 对同一底物反复多次检测。 1 1 2 生物传感器的优点及分类 生物传感器有以下优点： ( 1 ) 由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，一般不需要样品的预处理， 样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需要加入其他 试剂； ( 2 ) 可以实现连续在线检测： ( 3 ) 响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复使用多次； ( 4 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。 用于检测汞离子及腺苷的d n a 生物传感器研究 生物传感器一般可以从以下3 个角度进行分类：根据传感器输出信号的产生 方式，可分为生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器： 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感 器、组织传感器、基因传感器、免疫传感器、d n a 传感器等；根据生物传感器的 信号转化器可分为电化学生物传感器、热生物传感器、光化学生物传感器、声生 物传感器等。 1 2d n a 生物传感器 随着基因组工程的进行，d n a 生物传感器有了很大的发展。d n a 生物传感器 是基于核酸分子杂交和w a t s o n c r i c k 碱基配对原理而发展起来的一种用于核酸序 列识别检测的技术。与其他检测方法如凝胶电泳检测相比，它的出现大大缩短了 目标物的检测时间，而且无污染、操作简单化，既可定量，又可定性，为d n a 序 列检测和单碱基突变的识别提供了新型高效的检测手段，并在基因检测诊断【孓引、 环境监测3 1 、药物机理分析【1 4 1 6 1 及d n a 损伤研究【1 7 棚1 等方面发挥了重要作用。 伴随指数富集配体系统进化技术的发展，核酸适体被筛选出来，并能与各种靶物 质发生高特异性结合，d n a 生物传感器有了更广阔的发展，因此开发d n a 生物 传感器具有很大的发展潜力。 d n a 生物传感器是以d n a 为敏感元件，通过换能器将d n a 与d n a 、r n a 、 蛋白质、小分子、金属离子等相互作用的生物学信号转变成可检测的光、电、声 波等信号的物理装置。 1 2 1 电化学d n a 生物传感器 在生命过程中，人和动物的代谢作用及各种生理现象大都与电流和电势的变 化密切相关，并具体表现为：无论是能量转换、神经传导、光合作用、呼吸过程， 还是基因遗传、疾病防治、药物体内释放等都伴随着电子的转移。作为一门研究 电子( 或半导体材料) 离子以及离子离子导体界面性质变化过程与机理的科学， 现代电化学已把生命过程中的电化学反应作为其重要的研究内容。电化学检测技 术具有很多优点：灵敏、快速、成本非常低廉，而且检测装置轻便、低能耗且易 于微型化和集成化，符合手持式检测装置以及未来的芯片实验室( 1 a b o nac h i p ) 的要求。同时，生命科学也把电化学方法作为重要的实验手段，尤其是伴随着近 期两个学科在一些相关基础理论和实验方法方面所取得的进步，把两者结合起来 进行研究更显出其优势【2 0 之1 1 ，在此基础上就产生了研究生物电化学的新装置电化 学生物传感器。 电化学d n a 生物传感器一般由一个固定d n a 片段( 探针) 的电极和用于检 测的电活性杂交指示剂构成f 2 2 之3 1 。通常是将s s d n a ( 探针分子) 修饰到电极表面 构成d n a 修饰电极，由于s s d n a 与其互补靶序列杂交具有高度的序列选择性， 硕士学位论文 使得这种s s d n a 修饰电极呈现极强的分子识别功能。在适当的温度、p h 、离子强 度下，电极表面的d n a 探针分子能与靶序列选择性地杂交，形成双链d n a ( d s d n a ) ，从而导致电极表面性质的改变，这种杂交前后的性质差异，也可以通过 具有电活性的杂交指示剂来识别，从而达到分析检测的目的。电活性杂交指示剂 一般有四类：( 1 ) 在寡聚核苷酸上标记电化学活性的官能团作为识别元素；( 2 ) 利用酶的化学放大功能，在d n a 分子上标记酶作为识别元素；( 3 ) 一些具有电化 学活性的小分子物质，能与d n a 分子发生可逆相互作用，其中一些能专一性地嵌 入d s d n a 分子双螺旋结构的碱基对之间，这类物质称为杂交指示剂，例如亚甲 基兰等；( 4 ) 最近由于纳米材料的发展，纳米粒子标记也成为一种有效的方法， 例如：量子点、纳米金等纳米颗粒。 1 2 2 光学d n a 生物传感器 光学d n a 生物传感器主要有光纤、表面等离子体共振( s p r ) 和其他发光型 d n a 生物传感器。光纤d n a 传感器【2 4 , 2 5 的工作原理是将杂交分子中的探针标记 物经生化反应产生的特征光学信号，通过光纤探头传递至光检测器，经光电转换 进而实现目标d n a 的测定。这种传感器选择性强，易于排除杂交过程中非特异性 吸附的干扰，测定准确，其不足之处在于选择的发光反应信号较弱，需要加入嵌 合试剂来提高灵敏度。表面等离子体共振( s p r ) d n a 传感器是基于监测传感片 表面液体的折射率变化反映出靶基因的浓度大小设计的，先将单链d n a 分子结合 在金属膜表面，加入与其互补的目标d n a ，杂交反应使金属膜与溶液界面的折射 率上升，导致共振角度发生改变，固定入射光角度，就能根据共振角的改变程度 对目标d n a 进行定量测定。主要集中于基因突变的检测、p c r 产物的测定、病毒 和其它微生物的检测等方面的研究。光学传感器还包括生物( 化学) 发光d n a 传 感器、荧光d n a 传感器、拉曼光谱式d n a 传感器和光寻址电位式d n a 传感器1 2 6 。 1 2 3 压电d n a 传感器 石英类各向异性的晶体受到机械应力后，在相应的面上产生电场，此现象称 为压电效应；相反，在压电材料上施加一电场，则产生机械形变，称为逆压电效 应。压电传感器的传感元件为压电石英晶体，当电流通过石英晶体时，该材料会 出现小的机械变形，在一定频率下就会导致机械共振或声共振，其共振频率随振 荡器表面质量的变化而改变。这种关系可由s a u e r b r e y t 2 7 】方程表示： a f = 2 2 6 x10 7 f 0 2 a m a 其中a f 是由附着质量变化a m 引起的频率变化，f o 为石英晶体的基频，a 为 石英晶体电极区面积。 压电传感器能将质量变化转化为频率信号，根据其这种特性，首先将单链d n a 探针固定于压电晶体表面，当溶液中的目标d n a 链与之杂交后，会引起晶体表面 用于检测汞离子及腺苷的d n a 生物传感器研究 质量改变a m ，从而导致晶振频率发生改变a f ，可以通过测量石英晶体的频率改 变量实现对目的d n a 链的定量检测【2 引。由于石英晶体对表面物质质量变化非常敏 感，所以压电传感器能灵敏的检测生化反应中寡核苷酸的微量变化，并将质量变 化转化为可以直接定量检测的频率信号 2 9 , 3 0 】。压电d n a 传感器构造简单，成本低， 易于与其他方法联用，可提供实时控制信号，也可用于动力学研究。 1 3 基于核酸适体的生物传感器 1 3 1 核酸适体概念及作用原理 核酸适体是一段由2 0 6 0 个碱基组成的单链寡聚核苷酸。它通过指数富集配 体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技 术从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来，能特异性地结合蛋白质、多肽、 有机物、金属离子等各种配体，其解离常数很d , ( n m 或p m 级) 【3 1 1 。1 9 9 0 年，美国 的s z o s t a k 和g o l d 3 2 3 3 】等实验室各自独立地建立核酸文库，并逐步发展成一种能 从大量核酸分子文库里筛选出与配体高效、专一结合的d n a 或r n a 片段的 s e l e x 技术。筛选出来的d n a r n a 寡核苷酸被称为核酸适体a p t a m e r ，来源于拉 丁字a p t u s ( “适合 之意) 。核酸适体的出现，冲破了传统意义上关于核酸只是遗 传信息存储和转运载体的认识。利用核酸结构的多样性，可使它与各种配体产生高 选择性的结合。由于核酸适体具有易合成、易存储、易修饰等优点，它在核酸结构 的多样性、蛋白质d n a 相互作用等的研究及医学诊断和治疗、传感器、分子开 关等方面的有着极大的应用前景。 核酸适体与其目标物质结合时一般是基于其核酸链的三维结构和本身的柔韧 性。自由的适体在溶液中是朝不同的方向延伸，形成各种各样的杂乱无章的空间 构像。而在与目标物结合时，通常会通过构型适配形成一些稳定的二级结构，如 发卡、假结、凸环、g 四分体等。决定这些结构的碱基往往是与配体结合的重要 位点。核酸适体与配体主要通过“假碱基对 的堆积作用、氢键作用、静电作用 和形状匹配等产生高特异性的结合力。这样形成的适体结构与靶物质之间有较大 的接触面积，能与靶物质紧密结合，具有高亲和力和高特异性。在多数的核酸适 体与配体的结合作用中，尤其是核酸适体与蛋白质复合物，堆积作用扮演关键角 色，其次是氢键作用。有研究表明，精氨酸与其适体识别的主要原因是分子的侧 链进入核酸分子折叠部位的深处，与核酸的碱基形成较强的氢键作用 3 4 1 ；氨基葡 糖苷与其适体识别的主要作用力为形状匹配和静电作用【3 习；孔雀绿与其适体的识 别是相互诱导的适应性识别【3 6 1 。 1 3 2 核酸适体优点 适体的出现使抗原抗体反应发生新的革命性变化，它弥补了现有的抗体的不 硕上学位论文 足。其与抗体相比有很多优点【37 j ： ( 1 ) 体外筛选，人工合成，消除了适体制备的批间误差，更迅速、廉价。适体 由体夕i - s e l e x 筛选获得，较单抗的筛选过程更为简单；筛选出的适体通过化学合 成产生，纯度高、有极佳的准确性和重复性，几乎消除了适体制备的批间误差， 较单抗制备更便宜、快速。 ( 2 ) 分子量小，消除了空间位阻，能结合更多的目标物，有利于提高灵敏度， 构建高密度阵列传感器。 ( 3 ) 适体有良好的可修饰性。适体可经筛选及修饰而使其适合诊断试验的需要， 荧光、酶或生物素分子等功能团可接合在适体的特定位置，也可解离用于检测。 适体经适当修饰稳定性大大提高，且不影响与配体间的亲合力。 ( 4 ) 适用范围广，靶分子多。对动物或细胞不能耐受的病毒或免疫原性很低的 物质也能制备出适体。适体的配体远多于抗体，除了核苷酸序列、蛋白质、氨基酸、 抗体外，还可以是辅因子f m n 、a m p 、和c a m p 等、染料、药物小分子( 如茶碱) 、 生长因子、肽链、类固醇、糖类，甚至可与完整的细胞、病毒、孢子、朊病毒结合。 ( 5 ) 稳定性好，可重复性。 1 3 3 基于核酸适体的光学生物传感器 光学适体传感器是指将适体与目标分子作用的生物信号转换为光信号的传感 器。根据这些光学信号的原理不同，有荧光、化学发光、磷光、反射、折射等， 应用范围很广泛。 发光物质【r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 】2 + 能选择性的嵌入到i g e 适体中，当这种化合物 单独存在于水溶液中时，它是不发光的，而当适体存在时，由于它能嵌入到适体 的三维结构中，与碱基发生相互作用，发出光信号。b a i 3 8 】等将此物质的这一性质 用于检测i g e 。目标物i g e 与其适体结合前后，会引起适体的三维结构发生改变， 从而引起 r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 的发光强度发生相应的变化，信号一般情况下能增 强4 倍左右，成功地检测了i g e 。 u e y a m a 3 9 1 等报道了一种用于检测k + 的荧光方法( 图1 1a ) ，作者将k + 核酸适 体的两端分别标记了f a m 和t a m r a ，没有k + 时，核酸适体是杂乱无章的自由状 态，f a m 与t a m r a 相互远离，不能发生荧光共振能量转移( f r e t ) ；加入k + 后，k + 与核酸适体结合，形成一种四股螺旋的结构，将f a m 与t a m r a 拉近，使 得两个荧光团之间距离足够近，可以发生f r e t ，从而能够实现定量检测k + 。l i l 4 0 j 等报道了一种用于检测a t p 的荧光传感器( 图1 1b ) ，文中比较了两种不同检测 方案，一种是将适体先和一条在中间标记了荧光基团的核酸链杂交，由于碱基自 身的淬灭作用，荧光团的荧光被淬灭；而当加入目标物后，与适体互补的荧光链 被置换下来，消除了碱基本身的淬灭后，荧光基团的荧光恢复。另一个方案是将 与适体杂交的核酸链在两端分别标记荧光基团和淬灭基团，且两端有一定长度的 用于检测汞离子及腺苷的d n a 生物传感器研究 碱基互补，当目标物存在时，核酸链被置换下来，互补端结合成双链，荧光淬灭。 这种荧光检测方法被广泛应用与生物检测中，在对a t p 和凝血酶，p d g f 等物质 都的检测中取得了很好的结果。由于光学染料很容易获得，信号大部分是在均相 中检测，灵敏度高，检测下限低，光化学技术的应用越来越广泛。随着纳米材料 的发展，量子点的出现给荧光生物传感器的发展带来了更广阔的空间。 h v _ _ a p t a m e t ；t 茗i 辫 蕊s i g n a l 4 ：) n 、掣 t a ；r g e t 嚣 够 f 曩蔓。； 鎏一 “麓 扩i g 蕊f 窝 警s 嘲国盼夕 i ； ，k a ，、 a )b ) 图1 1a ) k + 荧光生物传感器，b ) a t p 荧光生物传感器 1 3 4 基于核酸适体的电化学生物传感器 以电化学免疫传感器的研究工作为基础，人们已研制了多种新型的电化学适 体生物传感器，其中既有源于免疫传感技术的“三明治型电化学适体生物传感 器，也有基于适体结合目标分子前后结构变化的“电化学开关 等。电化学适体生 物传感器可检测的目标分子很多，如凝血酶( t h r o m b i n ) 、血小板源性生长因子 ( p d g f ) 、三磷酸腺苷( a t p ) 、腺苷( a d e n o s i n e ) 和药物分子，如可卡因( c o c a i n e ) 等。 电化学适体传感器的分类很多：根据是否应用标记物产生检测信号，电化学 适体传感器可大致分为标记型与非标记型；根据检测信号的不同电化学适体传感 器可分为电流型、电位型和阻抗型等。在这些方法中，电流型适体传感器由于检 测的电信号灵敏、易获得，是研究中比较活跃的一个领域。 对于电化学适体生物传感器，探针的高效是一个关键步骤。目前，用于固定 适体的工作电极主要有：常规金电极、玻碳电极、金阵列电极、金芯片电极和铟 锡氧化物( i t o ) 电极等。一般适体在电极表面的固定技术有：5 巯基化的适体自 组装至金电极或金纳米颗粒基底、酰胺化或戊二醛交联、将生物素功能化适体固 定至修饰有亲合素的基底表面等。 电化学适体传感器的定量测定方法也有很多种：如差分脉冲伏安法、交流伏 安法、循环伏安法、方波伏安法、溶出伏安法和法拉第阻抗谱等。 电化学适体传感器设备简单、能耗低，使用方便、方法灵活多样、易微型化 等优点，一直是分析化学工作者重点研究的领域。近年，报道了许多快速、灵敏 的、高选择性的电化学适体传感器。p l a x c o 4 1 】等报道了一种基于适体分子开关类 ，殳卫 叫 y 硕士学位论文 型的检测方案( 图1 2a ) ，快速、方便，用以检测小分子物质可卡因。当没有目 标物时，亚甲基兰标记的适体处于打开状态，电活性物质远离电极表面，没有电 信号产生。而当目标物存在时，适体与目标物结合，电活性物质接触电极表面， 产生电信号。z u o 等【4 2 】将两端分别修饰了巯基和二茂铁基的a t p 适体与其互补链 杂交形成双链结构，然后自组装至金电极表面，构建了s i g n a l o i l 型a t p 适体传感 器( 图1 2 b ) 。由于双链结构足够刚性，使得电活性物质远离电极表面，因此， 电活性标记物二茂铁无法与电极交换电子，只能检测到极微弱的电流信号。当加 入目标分子a t p 后，a t p 与适体结合，使原有的双链打开，并使适体折叠，适体 末端的二茂铁同时被拉近至电极表面，实现与电极间的电子传递。 务 、 锄脚糌蛹黜糍黜豁蜊稚编织糍甥艄抛 - 4 ：c_ a t p 镪踏蝴黼蹦簖蝴喘鲤栅 拈莽黼。蝴# 懈g a )b ) 图1 2a ) 可卡因电化学生物传感器b ) a t p 电化学生物传感器 1 3 5 基于核酸适体的压电生物传感器 基于核酸适体的压电生物传感器是一种以非标记为主的质量响应型传感器， 它是以检测物质本身质量变化而产生相应的信号变化，响应灵敏。压电传感器可 用于气相与液相检测，其中压电液相传感技术能直接于液相中进行测定，并能实 时、连续检测适体一目标物反应的动态过程，在临床疾病标志物的定量分析中获 得了非常广泛的应用。l i s s 等【4 3 】采用基于核酸适体的压电技术实现了i g e 适体对 i g e 的实时检测，由于适体的尺寸小和非蛋白本质，他们在基质表面能组装成一层 致密的、高定向的分子层，与用i g e 抗体检测相比，用适体组装能将线性范围扩 展1 0 倍，并且在数周内都能保持它的活性，稳定性好，且容易再生，具有很大的 应用前景。 1 4 纳米科技与纳米材料 纳米技术是研究结构尺寸在0 1 至1 0 0 纳米范围内材料的性质和应用。纳米技 术是一门交叉性很强的综合学科，研究的内容涉及现代科技的广阔领域。纳米科 学与技术主要包括：纳米体系物理学、纳米化学、纳米材料学、纳米生物学、纳 米电子学、纳米力学等相对独立又相互渗透的学科。 纳米材料是指基本单元的颗粒或晶粒尺寸至少在一维以上小于1 0 0n m 的材料 矿羚戮蒸基 臻兰 堡，；j j 艮蒹 用于检测汞离子及腺苷的d n a 生物传感器研究 【4 4 1 。它具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应【4 5 1 。这四种 效应是纳米粒子、纳米固体材料的基本特性，也是纳米材料的性能与常规材料有 很大差异的原因，这些效应使得纳米材料呈现优良的光学、电学性质和良好的生 物亲合性。纳米材料所具有的表面效应和体积效应，使其与其它原子结合时表现 出很高的化学活性，很容易与外界原子结合，而使纳米粒子的比表面积、表面能 及表面结合能都迅速增大。另外，纳米粒子具有良好的生物相容性，能提供一个 类似生物分子本体环境的微环境，可以很好地保持生物组分的活性，因此纳米粒 子非常适合用于构建性能良好的生物传感器。 1 4 1 纳米材料在生物传感器中的应用 不同结构的纳米材料如纳米颗粒、纳米管、纳米线具有良好的化学稳定性和 生物相容性，而且大的表面积能提高生物分子的固定量并有效保持其活性，能用 于构建理想的生物传感界面，所制备的生物传感器具有灵敏度高及稳定性好等特 点 4 6 - 4 8 】。将纳米材料应用于传感器界面的构建，纳米材料的组装和生物分子的有 效固定是获得性能良好的生物传感器的重要步骤，也是传感器研究工作者探索的 主要目标之一。 1 4 2 金纳米粒子在生物传感器中的应用 金纳米粒子( a u n p ) 是指直径在1 1 0 0m i l l 之间的金微粒，它以稳定形 式存在于溶液中。它是通过氯金酸( h a u c l 4 ) 在还原剂作用下所形成的一定大小 的金颗粒。由于纳米金颗粒具有独特的物理、化学性质及生物相容性【4 9 1 ，因此在 许多领域它具有重要应用价值。它具有比表面积大，表面反应活性高、表面活性 中心多、催化效率高、吸附能力强等性能。纳米金粒子因为尺寸效应所造成的表 面原子配位不足，亏电子严重，而对于生物大分子有很强的吸附能力，能高效地 固定生物大分子，因此它在设计和制备各种具有特定功能的化学传感器中具有重 要意义。1 9 7 1 年f a u l k 和t a y l o r 首次采用免疫金染色将纳米胶体金应用于直接免 疫组织化学检测沙门氏菌表面抗原【5 们，这成为纳米金颗粒应用于生物检测的里程 碑。至1 9 8 1 年免疫金染色与银显染增强技术结合形成免疫金银染色【5 l j 后，纳米金 颗粒得到了更为迅速的发展和广泛应用，已被应用于生物学和医学的众多领域 【5 2 ，5 3 】 o 由于大多数生物活性酶的氧化还原中心深埋于分子内部，其氧化还原中心与 电极表面的距离超过了电子能以足够速率进行转移的距离，因而很难在电极上实 现直接的电子传递。金纳米颗粒加入过程中，和酶分子的活性中心结合，可以加 速酶分子到电子中间体的电子传递过程。唐芳琼等【5 4 】制备了纳米颗粒增强的葡萄 糖氧化酶( g o d ) 传感器，得到响应迅速、灵敏度高的直接电子转移的酶电极。 1 4 - 3 碳纳米管在生物传感器中的应用 自从i i j i m a 在1 9 9 1 年发现了碳纳米管( c n t ) 后，掀起了一股研究碳纳米管 的热潮【55 1 。碳纳米管( c n t ) 是由单层或多层石墨片围绕中心轴按一定的螺旋角 卷绕而成的无缝、中空的“微管，每层由一个碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个 碳原子完全键合后所构成的六边形组成的圆柱面。根据形成条件的不同，碳纳米 管存在多壁碳纳米管( m w n t s ) 和单壁碳纳米管( s w n t s ) 两种形式。m w n t s 一 般由几层到几十层石墨片同轴卷绕构成，层间间距为0 3 4n m 左右，其典型的直径 和长度分别为2 3 0n m 和o 1 5 0i im 。s w n t s 由单层石墨片同轴卷绕构 成，其侧面由碳原子六边形排列组成，两端由碳原子的五边形封顶。碳纳米管是 一种具有特殊结构( 径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量级、管子两端基本 上都封口) 的一维量子材料。碳纳米管独特的原子结构使其表现出金属或半导体 特性，利用这种独特的电子特性，可以将碳纳米管制成电极。碳纳米管的表面效 应，即直径小、表面能高、原子配位不足，使其表面原子活性高，易与周围的其 它物质发生电子传递作用【5 6 1 ，在电催化和电分析化学领域中具有广阔的应用前景。 可用于显微镜探针针尖、气相传感器、分离检测等，在修饰电极上的应用尤为广 阔。 报道了多种碳纳米管固定到电极上催化电活性物质的氧化还原反应。碳纳米 管复合膜制备的