（园林植物与观赏园艺专业论文）草原龙胆的胚胎学研究.pdf

摘要 摘要 草原龙胆是鲜切花中的特优种类，具有极高的观赏特性，并且草原龙胆的子房中胚 珠数量可达2 0 0 0 3 0 0 0 粒，是较好的胚胎学研究试材。其胚胎学研究可为育种工作提供 基础理论的支持。本研究以淡黄色的单瓣花品种4 9 号为实验材料，此品种经过多年纯化， 切花期长，遗传稳定。2 0 0 4 2 0 0 5 年栽种于东北林业大学花卉生物工程研究所温室中，每 年栽种约5 0 0 株。试材播种时问是1 2 月，此时温室内温度7 一1 5 。取材时间为7 8 月， 此时温室内温度1 5 3 0 。实验中采用株高为6 0 c m 左右蕾期及花期植株，取2 3 级侧枝 最顶端的花蕾约5 0 0 个( 花蕾大小0 2 4 c m ，平均分为十个长度区间连续取材) 进行大小 孢子发生和雌雄配子体发育的研究。盛花期丌花后进行人工授粉，然后按照发育的时| 白j 先后顺序取2 3 级侧枝顶端的花柱及子房( 授粉后每隔2 小时取材一次，到4 8 小时，之 后每隔4 小时取材一次，一直到9 6 小时。授粉9 6 小时后，每隔2 3 天取材一次，直至 授粉后6 0 天) 进行受精作用及胚和胚乳发育的研究。将材料固定后用爱氏苏木精整体染 色，常规石蜡切片一法制片，制切片约2 0 0 0 余张( 每张切片中约有1 0 2 0 片切片) 。光学 显微镜观察、统计并照相。其研究结果如下： 1 花药壁 - | j 六层细胞组成：表皮、药室内壁、：3 层中层、绒毡层，为双子叶型。异! 掣 腺质绒毡层。 2 小孢于母细胞减数分裂过程中的胞质分裂为同时型。四分体的排列为j r i 四面体型 或左右对称型。成熟花粉为二细胞型，具有三条萌发沟。 3 予房为二：心皮一室，多胚珠，侧膜胎座，倒生型胚珠。薄珠心、单珠被。珠心表 皮下的孢原细胞直接分化为大孢f 母细胞。减数分裂形成线形或t 型排列的四个人孢予。 合点端的大孢子为功能大孢子。两个极核在受精i ，j 融合为次生核。成熟胚囊为七细胞七 核。蓼型胚囊。 1 湿型柱头。闭合型花牲，花柱中有引导组织。! 刍花粉管卜k 到花柱的r 卜卜部时， 中埔细胞分裂为两个精细胞。珠孔受精。花粉管进入一个助细胞释放两个精予。 一个精 j ij j 卵细胞融合形成合子，合了发育成胚。另一个精子与中央细胞的次生核融合形成仞 7 m 1 1 乳核，初生胚乳核进一步发育成胚乳。精予与次生核融合比与卵核的融合快。受精 作用属于有丝分裂前配子融合类型。 5 合，f 休眠期为1 5 天左右，然后分裂形成二细胞原胚。胚胎发育为茄型。经过棒形 雌、球形胚、心形肌和鱼雷j | 1 1 等阶段发育为成熟_ | 】f j 。成熟种子为鱼雷胚期。胚乳发育是 f 皇，刊 关键词草原龙胆：胚胎发育：受精：胚：胚乳 东北林业人学硕1 ：学位论文 a b s t r a c t e 淞，o m 口g 厂口门d 矽d ，“mg r o 、v na sac o m m e r c i a lc u tf l o w e r h a sh i 曲l yd e c o r a t i v e c h a r a c t e r i s t i c sw i t hav a r i e t yo ff l o w e rc o l o ra n df o r m i t sa g o o dm a t e r i a lf o re m b r y o l o g i c a l s t u d ys i n c et h e r ea r e2 0 0 0t o3 0 0 0o v u l e si na no v a r y t h i sr e s e a r c hp r o v i d e sb a s i ci n f o 肌a t i o n f - o rg e n e t i c sa n db r e e d i n go ft h i sp l a n t ab r e e d i n gl i n e “0 2 4 9 o fe j 呈阳门c z 沙d ，“，”w i t hy e l l o w s i n g l ef l o w e r sw a su s e db e c a u s ei tw a sa l m o s tg e n e t i c a l l yp u r ed u et os e l f 二f e n i l i z a t i o nf o r m a n yy e a r s ，an o w e r i n gp e r i o dw a sl o n ga n dh e r e d i t a 巧t r a i t sw e r es t a b l e i nd e c e m b e ro f 2 0 0 3a n d2 0 0 4 ，s e e d sw e r es o w ni nag r e e n h o u s ek e p ta t7t ol5 0 ca tr e s e a r c hi n s t i t u t eo f f l o w e rb i o t e c h n o l o g y ，n o n h e a s tf o r e s t r yu n i v e r s i t y n e x ty e a r5 0 0s e e d l i n g sw e r ec h o s e n a n dr e p l a n t e df o rg r o w t h f l o w e r sw e r es a m p l e df r o mp l a n t s6 0 c m h i g hi nj u l yt oa u g u s t w h e nt e m p e r a t u r ei nag r e e n h o u s ew a s15 3 0 m o r et h a n5 0 0n o w e rb u d so rf l o w e r so nt h e s e c o n do rt h i r dl a t e r a lb r a n c h e sw e r et a k e na tl0g r o 、v t hs t a g e sr a n g i n gf o m0 2t o4 c mi nb u d l e n g t h m i c r o s p o r o g e n e s i s ，m e g a s p o r o g e n e s i s ，a n dt h ed e v e l o p m e n to ft h em a l ea n df e m a l e g a n l e t o p h y t e sw e r eo b s e r 、7 e dn l i c r o s c o p i c a l l y a r e rm a n u a ln o w e rp o l i i n a t i o n ，5t o1os t y l e s a n do v a i i e so ni h es e c o n do rt h i r dl a t e r a lb r a n c h e sw e r et a k e na td i f f e r e n td e v e l o p n l e n t a l s t a g e s ：a ti n t e r v a lo f 2h o l l r sd u r i n gn r s t4 8h o u r sa r e rp o l l i n a t i o n ，a ti n t e r v a lo f4h o u r sf o r n e x t4 8h o u r s ，a n da t2o r3 一d a yi n t e r v a lt h e r e a f ! t e rt o6 0d a y sa t 、t e rp o l l i n a t i o n f e r t i l i z a t i o n p r o c e s s a n dt h ed e v e i o p m e n t o ft h ee m b r y oa n de n d o s p e r n lw e r eo b s e r v e dm i c r o s c o p i c a l l y m a t e r i a l sw e r e6 x e di nf a a ( 5m lf o r m a l i n ：6m la c e t i ca c i d ：8 9m l7 0 e t h a n 0 1 ) a f t e rs t a i n e dw i t he h r n c h sh a e m a t o x y l i n ，t h en x e dt i s s u e sw e r ee m b e d d e di np a r a 衢nu s i n ga c o n v e n t i o n a ln l e t h o d a n dc l l ta tat h i c k n e s so f6t o1ou m m o r et h a n2 0 0 0s l i c e sw e r e p r e p a r e dw i t h10t o2 0c o n t i n l l o u ss e c t i o n se a c hs l i c e o b s e r v a t i o na n dp h o t o m i c r o s c o p yo f s c c 【i o n s 、v e r ec a r r i e do l i tu s i l l gal i g h in l i c r o s c o p e ( o l y n l p l l s b x15 ) t 1 1 er e s u l t sa r ea sf b l l o w s 1 a 1 1 t h e r 、- a l l s 、e r ec o n s i s t e do fs i xl a y e r so fe p i d e r n l i s ，e n d o t h e c i u m t h r e en l i d d l el a y e r s a 1 1 dt a p e t u n l f o n l l a t i o no fa n t l l e rw a l l s 、a so ft h ed i c o t 7 l e d o l l o l l st ) r 7 p e t h et a p e t l i l l lw a so f h e t e r o n l o r p h i ca n dg l a n d l l l a rt ) 7 p e 2 c y t o k i l l e s i si nt h en l i c r o s p o r o c 7 t en l e i o s i s 、a so ft h es i l l l l i l t a n e o u st y p e m i c r o s p o r e t e t r a d s 、v e r et e t r a h e d r a lo rn l e d i a n i yz ) 7 9 0 m o r p h i c m a t u r ep o l l e ng r a i n sw e r e2 一c e l l e da n dh a d 3g e l 1 1 1f 、l l r r o 、s 3 t h eo 、7 a r 7 、 a sb i c a r p e i l a r ys 7 n c a r p o u sa n dl l n i l o c u l a rh a v i n gp a r i e t a lp i a c e n t a s o 、7 u l e s 、e r ea 1 1 a t r o p o l l s t e n l l i n l l c e l l a t a ea n du n i t e g n l i c t h ea r c h e s p o r eu n d e rt h en u c e l l a re p i d e n m i s d e 、e l o p e dd i l e c 【i ) an l e g a s p o r en l a s t e rc e l l 、h i c hi nt u r l lu n d e r 、7 e n tn l e i o t i cd i 、i s i o nt of i o n l l 41 1 1 e g a s p o r e sa n a n g e di nal i l l eo ra t s h a p e t 1 1 ec h a l a z a ln l e g a s p o r e 、v a so b s e r v e df l l l l c t i o n a l l 绪论 1 绪论 1 1 课题背景 1 1 1 草原龙胆的概述 草原龙胆( e 姗，d 聊口譬阳门删7 d 厂“脚) 又称洋桔梗，龙胆科( g p 玎，f 口门口c p 口p ) 草原龙胆属 ( e 淞f ( ) m 口) ，为一、二年生草本植物。原产于北美洲，主要分布在墨西哥北部，美国的 德克萨斯州、新墨西哥州、亚利桑那州、科罗拉多州、犹他州以及堪萨斯州。 迄今，草原龙胆在世界各地已广为栽培，其株型婀娜，色调清新淡雅，瓣型有单瓣 和重瓣之分。草原龙胆经过育种及人工驯化选育，现在已经成为品种繁多、用途广泛的 新奇花卉，其最大的特点是单株多花，切花期长，鲜花瓶插寿命长达1 0 1 5 天，一花多 色( 花色有白色、粉红色、桔红色、黄色、紫色、双色等) 、花型各异( 其花冠呈美丽的 杯状、钟状、漏斗状、平状) 、单重瓣交相辉映，是鲜切花中的特优种类。同趋受到人们 的喜爱，已经跻身于同本、荷兰等花卉市场的十大切花之列，并有逐渐代替康乃馨的趋 势。成为国际花卉市场上十分流行的一种高档鲜切花种类。 草原龙胆的花为两性花，辐射对称，每朵花下具2 个苞片，苞片披针形至线状披针 形，长约2 5 3 c n l 。一朵完整的花有5 片花瓣，轮生排列，基部合生；有雄蕊5 枚，雌 蕊1 枚。子房上位，二心皮，侧膜胎座。果实长椭圆形，成熟时由绿变黄，沿腹缝线丌 裂，种f 可从中间散出。成熟种子极小，黑色，1g 种子大约2 万到2 力5 千粒i 。 i ，j - ，有关：草原龙胆的生理生态】、繁殖栽培【6 - 9 】、病虫害防治i l o 1 2 1 及花色、花型、株型 f ，种1 3 - 15 l 、采后，l i 理i 1 w 、离体快繁1 8 - 2 2 1 等方面已有研究，在胍胎学方面，龙h h 科一部 分植物1 1 3 之8 1 的胚胎学特征已有报道，而有关草原龙胆的胚胎学研究尚未见报道。 1 1 2 草原龙胆的引种与栽培 f 1 本作为草原龙胆的二王三要育种目，从19 3 5 f 就川：始引入困内，j 于19 4 5 年舀：长野 县j l ：始进行鲜切花的栽培生产。又经过2 5 年的引种栽培及生产实践，民删育种家丌始对 r ji 进的品系进行6 晰r j 改良，5 0 年代后半期，h 本国内的种苗会社已经培育出品质优良的 f 1 代品种并投入市场。随即，草原龙胆的切花生产在全国范围内陆续丌展起来，短时问 i j = 】得到了迅速的发展。特别是这数年来，由民f h j 育种家以及种菌公司培育的新品种已经 多达儿卣种，其中的2 0 3 0 个优良品种已经进i j ：了品种资源登陆。 草原龙盹引入同本国内后，主要在长野县的具有冷凉气候环境的地区进行生产，而 且切花的种类也只有夏季采花的紫色品系这一种类型。不久，国内人学的科学试验研究 机掏丌始对草原龙胆的生态习性进行研究，育苗中，心不断的丌发适合h 本栽培的鲜切花 生产技术，种苗会社也丌始大力进行新品种的育种工作：经过备方的努力与协作，具有 丰富花色、大小花型、单霞瓣等特性的多个优良品系被丌发出求并且存全国范围内逐 步 阴，艾了周年生产的鲜切化生产技术和供心体系。 l 绪论 1 2 3 植物胚胎学在国内的研究现状及展望 我国开展有性生殖的研究起步较晚。在2 0 世纪的前半期很少这方面的研究( 参见中 国植物学史) 。自5 0 年代始，植物胚胎学作为植物科学体系中一个重要的分支学科引起 了植物学科研工作者的重视。在其后的十几年时间里逐渐形成了一支专门的队伍，开展 植物胚胎学的研究和教学。进入8 0 年代，我国植物胚胎学科研工作者紧跟国际上植物胚 胎学向植物生殖生物学的发展形势，开展了不少属于学科前沿的课题研究。当今我国植 物胚胎学与生殖生物学在国际上已有一定的影响【2 】。 植物胚胎学在中国的发展大体可划分为三个时期。( 1 ) 初始时期，主要在裸子植物胚 胎发育的观察和实验研究方面开展了一些工作。( 2 ) 在2 0 世纪5 0 年代后的十几年是学科 的建立时期。这期问培养了一些植物胚胎学的人才和丌展了许多胚胎发育的描述性研究， ( 3 ) 近二十几年，随着国际上这一学科的发展，进入植物生殖生物学的发展时期。在这 时期中，以被子植物为对象开展了多方面的研究。第一，在结构与功能关系方面，研究 小孢子发生过程中细胞质改组，雄配子体发育中营养核与生殖细胞的关系：雄性生殖单 位与雌性生殖单位的结构，细胞质遗传的细胞学机理，生殖系统中的细胞骨架和传递细 胞的结构与分布；胚珠中细胞衰退与其物质的迁移【2 卜驯。第二，尘理活动方面，研究钙 在受精过程中的作用，a t p 酶在胚珠物质运输中的参与，受精过程中与识别作用相关的柱 头表膜和精细胞质膜蛋白的分离与组分的分析【2 8 _ 川。第三，与育种相关的胚胎学研究， 包括雄性不育性、无融合生殖及远缘杂交等i j 王j j 】。在以裸子植物为对象的研究中，首先 是对许多我国特有的属种的胚胎发育做出详细的描述，及为讨论系统位置提供胚胎学佐 证。这方面的研究是独具特色的。其次，在受精作用和精细胞的光镜和电镜的研究也获 得了突出的成果。 现阶段高等植物有性生殖的研究，越来越明显地沿着探索生殖发育的机理的方向发 展，分子生物学理论和技术引入植物生殖生物学的研究1 3 4 35 j 是一个明显的发展趋向：为 育种提供基础理论和新途径的研究也受到很大的重视。在二十世纪术，我国植物胚胎学 j l i t 夥h i ：这。t 要方向发展。第十八届植物有性垒：殖国际会议已在2 0 0 1 年在北京召丌，这 标志着我国这一科学已能与当自，j 国际植物生殖生物学的研究接轨和具备一定的实力和水 1 2 4 被子植物胚胎学的热点研究 在被子植物有性生埴过程中，受精作用始终占有中心的位置。目i ，j ，被子植物受精 作 _ f ：j 已是当今植物生殖生物学研究中极为活跃的领域。对这部分研究，胡适宜( 2 0 0 2 ) 在 被j 二植物受精生物学 一书中进行了总结。 1 8 2 4 年，意大利数学家和天文学家a m i c i 在显微镜下看剑在马齿苋雌蕊柱头e 的花 粉粒长出了花粉管，这被认为是认识被子植物受精过程的起始，点：18 8 4 年s t r a b l i r g e r 首 先观祭到了被子植物的受精过程，并揭露了花粉管释放出两个精子，其中之一+ 与卵细胞 结合，但第二个精子的命运还不清楚。18 9 8 年俄国植物学家n a 、 f a s c h i l l 发表了题为 r e s l “t a t ee i n e rr e 、，i s i o nd e rb e f r u c h t l l n g s v o r g a e n g eb e i f n ，7 7 么，( 倡( ) ，7u n d 厅i ，i ，口，。? “ 东北林业人学坝士学位论义 阳行p z 肠l 的论文，报道了欧洲百合和细弱贝母花粉管中的两个雄配子一个与卵细胞、 另一个与2 个极核融合的现象。这一发现，首次阐明了被子植物的两个精子都参与受精。 这推动了有性生殖研究的迅速发展。随后，法国学者g u i g n a r d ( 1 8 9 9 ) 也报道了在百合 和贝母中同样现象。在随后的几年中，人们在其它有花植物中也发现了双受精现象，至 此，人们认为双受精是被子植物普遍存在的一种生物机制。在植物胚胎学史上，双受精 的发现是一个重大里程碑。 在植物界，双受精作用是被子植物自然分类群的独有特征。虽然目前在裸子植物麻 黄属【3 6 3 7 1 和买麻藤3 8 】也发现了有类似的受精作用，但与被子植物双受精的结果是形成胚 和胚乳不同，这类植物的双受精除形成胚外，并不形成胚乳这种特殊的营养组织。被子 植物双受精发现以来的1 0 0 多年的研究历程中，大体上可分为两个阶段。前一阶段是借助 光学显微镜的观察，阐明双受精在被子植物中的普遍性，对涉及受精的雄性和雌性配子 体及雌、雄性配子、以及配子融合过程中的基本特性、变异性和多样性；后一阶段是将 植物胚胎学与与细胞生物学、分子生物学结合，演进为生殖生物学。应用电子显微镜、 显微荧光术、细胞化学及分子生物学技术作研究手段，深入到受精作用中有关结构与功 能关系的研列3 9 。4 2 】。二十世纪七八十年代丌展了配子分离技术的研究，并丌辟了体外受 精系统的实验研究的新领域，利用体外受精系统的研究策略，已成为当今被子植物双受 精研究众所瞩目的焦点。 另外，在被子植物的双受精过程中，下面几个发育阶段的研究近年未有了新的进展。 1 2 4 1 花粉管在雌蕊组织中的生长 花粉管是精配子到达雌配子体的载运体。花粉管从柱头的细胞壁之间进入柱头，向 _ 卜生长，进入花柱。花粉管进入柱头和在花柱中生长的通路与柱头、花柱特有的结构及 - j 腺质细胞构成的引导组织有关。在具干型柱头和实心花柱的植物中，花粉管进入柱头 首先需要由花粉管分泌角质酶和壁降解酶，使柱头上的角质层和细胞壁成分破坏，然后 通过柱头与花柱引导组织的细胞间隙生长。引导组织通常具大的细胞问隙及充满渗出物 或细胞具厚的中层，提供了有利于花粉管生长的道路。少数植物花粉管生长是通过纵向 的细胞壁，甚至花粉管可穿人细胞通过细胞腔生长。在具丌放桩头和空心花柱的植物中， 花粉管在花柱道中沿通道表面的引导组织细胞的表面生长。在通道中通常也充满由引导 组织细胞分泌的物质。 11 2 1 4 2 花粉管进入胚囊 花粉管生长经过花柱到达子房后，继续沿胎座向胚珠生长。通常花粉管经珠孔进入 h 1 1 珠，但也可从合点或胚珠中部进入。花粉管进入胚珠后穿过珠心组织进入胚囊。花粉 管定向地生长和从珠孑l 进入胚囊，一般认为是 b 胚囊中助细胞，。：生的向化性物质的作用， 通过丝状器分泌到珠孑l 或相邻的珠心细胞。吸引花粉管生长的物质现在认为至少包括三 类物质：简单的无机盐( 如钙) 、单糖( 如葡萄糖) 和低分子量的酸性蛋白1 43 1 ，钙对于花粉 管径体内的生长是必不可缺少的，并造成一个钙梯度分响门j 导花粉管i 长。花粉管进 胚囊总是首先到达两个助细胞中的一个。接受花粉管的助细胞或迟或早退化，大多数植 i 绪论 物退化发生在传粉后和花粉管在花柱中生长时。通常在受精前后胚囊中的两个助细胞中 仅一个退化，另一个宿存，而花粉管的进入总是到达退化的助细胞中。助细胞的退化与 引导花粉管进入胚囊、促使花粉管释放精子和帮助精子的转移有关【3 9 4 0 1 。在助细胞中含 高浓度的钙及在退化过程中钙浓度增加，超常的钙含量可能是助细胞退化的重要因素。 在受精过程中，助细胞程序性的凋亡有重要的意义。 在胚囊中的两个助细胞哪一个退化，哪一个宿存，在一些植物中表现为有规律的。 例如大麦，退化的一个助细胞多位于近胎座一侧；在向r 葵中，退化助细胞是位于近珠 柄一侧的一个。助细胞退化的这种“位置效应”，推测是由花粉管产生的信号沿珠柄一 侧扩散到胚囊，从而诱导该侧的助细胞退化【4 。不过，有的植物助细胞退化在位置上的 倾向性是不明显的，例如亚麻【4 4 1 ，而在烟草中是随机的【4 5 】。因此，有关为什么仅一个助 细胞退化及选择性的机制仍有待进一步研究。 1 2 4 3 配子的融合 在被子植物独特的双受精中，一个精细胞与卵细胞融合，而另一个精细胞与中央细 胞融合。融合涉及一个花粉管中的一对精细胞，它们哪一个与卵融合，哪一个与中央细 胞融合是预定的还是随机的，以及这两个精细胞之l 白j 是否有分化等问题尚待研究。精卵 识别是了解受精机理的关键问题，也是当前植物生殖生物学研究的前沿课题。 19 8 7 年，k n o x 和s i n g h 对被子植物受精中雌雄配子融合的机制提出了随机假说 ( c l 删1 c eh y p o t h e s s i s ) 和特异受体假说( s p e c i 矗cr e c e p t o rh y p o t h e s i s ) 两种假说。随机假 说址指精子与卵细胞的受精是随机结合，并且一个精细胞与卵结合后随即发生阻止多精 入卵反应；特异受体假说则认为雌雄配子融合是由细胞表面特异的识别因子所预定的， 两个精细胞表面质膜具有不同的决定因子，这种因子或是与卵细胞或是与中央细胞的表 | = f _ i 阳j 以互补。在假定存在精子异型性( 姊妹精细胞之间大小和含细胞器有差异) 和倾向 受精( 即形态不同的姊妹精细胞与卵或与中央细胞融合足预定的) 基础_ j ：，k n o x 和s i n 曲 推导精卵的识别可能存在有三种模式：一无特异性决定因二r 而随机结合：二仪能与卵细 胞结合的“r 州i ”的精予具特异性决定因子，这种凶予与卵细胞表膜上的相列j 亚：三两 个精细胞表膜具有不同的表膜决定性因子，分别与卵细胞和中央细胞的表面特片性决定 j i i l j 、筻。 综上所述，从双受精发现以来1 0 0 余年的研究动态，特别是近5 0 年的研究中不难看 探索受精作用的机制以成为主要研究目标，而且取得了较大的进展。今后的研究会在 现阶段的基础上继续深入，同时将推动性细胞。上程的研究。预计应用新的研究策略，体 内2 j 体外受精实验系统“并驾齐驱”，在本世纪会有重大进展。 1 2 5 龙胆科植物的胚胎学研究现状 龙胆科植物广泛分布于世界各地，约有8 0 个属9 0 0 余种。对其胚胎学研究的重视是 、龙胆亚科及睡菜哑科的分类学研究丌始的： 迄今为止，龙胆科植物在胚胎学方面的研究包括，线叶龙胆h 、条纹龙胆h 川、东北 尔北林业人学 畎i j 手位论义 龙胆【4 8 4 9 1 、秦艽【5 0 1 、黑边假龙胆【5 l 】等，且主要集中在大小孢子发生、雌雄配子体发育阶 段，对于双受精过程的研究还很少。 d a v i s 在被子植物系统胚胎学一书中系统地总结了龙胆科植物胚胎学特征。汇总 前人的观察结果，龙胆属的胚胎学特征，尤其是与确定该属系统与进化位置有关的胚胎 学特征，可以总结如下：花药是四分孢子型。在s w e n i ac a r o l i n e n s i s 中花药壁是双子叶型 的。药室内壁纤维加厚，但在c o t y l a n t h e r a 和e x a c 啪中出现孔裂。在e x a c u mb i c o l o r ， e p e t i 0 1 a r e 及s w e i r t i ac a r o l i n e n s i s 中，中层平周分裂最终形成3 4 层。绒毡层是腺质的， 而在c a n s c o r as p p 和g e n t i a n ad i f m s a 中是原生质型的。在e x a c u m 中报道有乌氏体颗粒， 然而在g e n t i a n a 和s w e r t i a 中每个小室可被不育细胞形成的隔膜再分隔丌。小孢子母细胞 减数分裂时同时进行胞质分裂。小孢子四分体是四面体型或对称型的。花粉粒释放时是2 或3 细胞的( 在c a n s c o r ad i 觚s a 中同一花药中这两种情况均存在) 。胚珠是倒生的，单珠 被，薄珠心。胞原细胞直接行使大孢子母细胞的功能，减数分裂同时进行胞质分裂，之 后形成的线形四分体中合点端的大孢子发育成蓼型胚囊。助细胞呈梨形，极核在受精i ，j 融合，三个反足细胞在胚囊成熟期退化，只是在s w e r t i ac a r o l i n e n s i s 中出现二次增殖。 c a n s c o r a 胚囊中存在淀粉粒，有报道说在e x a c u mp u m i l u m 中发现内皮。胚乳的形成通常 是核型的，在向心的细胞壁形成后变为细胞型的。在v o v r i ac o e m l e a 和v o y r i e l l ap a r v i f l o r a ，报道是细胞型的。 1 3 本实验研究的目的和意义 草原龙胆其最大的特点是单株多花，切花期长，鲜花瓶插寿命长达1 0 1 5 天，一花 多包、花型各异、单重瓣交相辉映，是鲜切花中的特优种类，具有极高的观赏特性。由 j 二草原龙胆的子房中胚珠数量巨大，是较好的胚胎学及遗传育种研究试材。目6 ，j ，有关 争原龙胆的生理生态【2 5 1 、繁殖栽培【6 - 9 】、病虫害防治 1 0 - 1 2 1 及花色、花型、株型育种旧1 5 l 及其相关基因的遗传转化17 1 、离体快繁陋2 2 1 等方面已有研究，但在基因遗传转化方面 的报道都是通过组织培养与农杆菌介导的方法进行的。由于其生殖期较长，而且组培幼 f 肖很容易受培养环境的胁迫，因此通过组织培养体系进行遗传转化，并选育新品种有很 人斟难。在模式植物拟南芥中己成功的用f 1 0 r a ld i p 法遗传转化，即幼蕾期通过农卡1 j 菌介 导遗传转化，第二代即可分离遗传转化的纯合体，是简单高效的遗传转化体系。目i ，j i 泛应用于转基因、功能基因组研究、基因定位、t - d n a 插入突变体的获得等方面。采用 此方法对萝卜、甘蓝型油菜等植物的遗传转化方面也获得了成功。草原龙胆子房与拟南 芥相似，子房中胚珠数目很多，可达3 0 0 0 个，而且可以人工控制花芽的分化，可周年丌 化结果。本研究为建立草原龙胆f l o r a ld i p 遗传转化体系，首先进行火小孢子发生及雌雄 配f 体发育的基础研究，提供具体的转化时问，为f l o r a ld i p 法在园艺植物中的应用提供 借鉴。对花发育过程中花蕾、花中子房的形态特征和数量特征进行了观察和统计，有助 于通过其外部形念来估计其内部的胚胎发育时期。丌展草原龙胆双受精过程的细胞学观 察、阐释双受精及胚胎发生细胞学特征，也为草原龙胆的遗传转化提供时问参考。f c _ 利 l 绪论 用花粉管通道法等利用花器官进行外源基因转导时【5 2 巧引，可依据研究结果确定最佳处理 时间，提高转化率。与此同时，通过与其相关近缘类群的胚胎学特征进行的比较，为探 讨和阐明龙胆科的系统学位置提供胚胎学证据。 深入研究草原龙胆的胚胎学特性，可以为植物生殖生物学在基础理论研究方面提供 相关资料。对受精生物学前沿问题的研究提供相关的理论依据，同时对草原龙胆的遗传 育种工作提供基础理论的支持。其中研究花粉的发育也为研究细胞命运，细胞模式，细 胞极性及细胞信号转到等方面提供了可能，还能为今天的生物学家解决感兴趣的问题时 提供一个微型的研究体系。另外雌配子体作为植物生活史中的重要成员，联系着几个重 要的发育阶段，包括花粉管的引导，受精，种子发育的诱导及种子发育的母本调控等。 2 材料方法 2 1 实验材料 实验材料来源于东北林业大学花卉生物工程研究所温室中的草原龙胆的单瓣花4 9 号 ( 图版x v i 3 ，4 ) ，黄色花品种。此品种经过多年纯化，遗传稳定。实验中采用株高为6 0 c m 左右的蕾期及花期的植株，耿二级或三级侧枝最顶端的花蕾和花中的子房做为实验材料。 试材播种时间是1 2 月此时温室内温度7 1 5 。取材时间为7 月，此时温室内温度1 5 3 0 。 2 2 实验方法 2 2 1 取材 1 实验初期采用4 9 号品种草原龙胆进行预备实验，摸索实验条件，实验方法，并初 步预测不同蕾期的发育状态。 2 花药壁的发育、大、小孢子发生及雌、雄配子体发育过程的研究中取材方法是， 在2 0 0 4 年7 8 月草原龙胆蕾期的不同时问，取不同发育长度的花蕾分别固定，花蕾长度 由0 2 4 c m 平均分为十个长度区问连续耳义材，每个等级大约取材5 0 个朵蕾，固定并保存 备用。 ：j 在受精作用的研究中取材方法是，在2 0 0 4 年和2 0 0 5 年的7 8 月草原龙胆盛花期 选择即将丌花且雄蕊尚未散粉的花蕾去雄并套袋，待其雌蕊丌放并且颜色变黄时，取异 株雄蕊为其授粉，授粉时l 、白j 为上午6 时，共授粉约1 8 0 朵花，授粉后前4 8 小时每隔2 小 时取材次，每次取5 个子房( 含花柱) 固定；在授粉4 8 h 至9 6 h 的期间内，每隔4 小 时取材1 次放入f a a 固定液中保存，每次取5 个子房。两年重复取材二次。 4 胚和胚乳的发育过程的研究中取材方法是，将授粉套袋的子房于授粉后9 6 h 之后每 隔2 3 天取材一次，放入f a a 固定液中，直至授粉后6 0 天。每次取2 3 个予房。 2 2 2 固定与保存 吲定采用f a a 固定液，固定液同材料的比例般不少于2 0 ：1 。同定后町直接放入 - ；l 。c 冰箱保存2 4 小时以上待用。f a a 固定液配方见表2 1 ： 表2 1f 从固定液配方 试剂 用量 福尔马林( 3 8 甲醛) 冰醋酸 7 0 或5 0 酒精 0 n l l 5 m l 9 0 m l ：钊镻 謤竴瞼謤蟺 1 染色：取已固定保存的材料，用爱氏苏木精染液染色1 0 1 2 d 。爱氏苏 配方如表2 ： 表2 2 爱氏苏木精染配方 用量 苏木色晶体 钟矾( 硫 9 0 9 1 m 1 1 m l 1 m l 爱氏苏木精：放置23个月，直至溶液氧化，变为紫红色，然后将原液按2的比例加入4 5 的冰醋酸进 2 蓝化：用自来水流水冲洗4 3 脱水：5 0 一5 0 一8 5 一9 5 一1 0 0 一1 0 0 梯度酒精，每级停斟时问为2 4 透明：1 2 纯酒精+ 1 2 二甲苯( 2 h ) 一二甲苯i ( 1 h ) 一二甲苯i i ( 5浸蜡：二甲苯ii+13碎蜡，三次(45温箱)，每次4h一(60温箱)混合物h)一纯蜡i ( 4 h ) 一纯蜡i i ( 4 h ) 6 切片：切片机，连续切片，切片厚度6 1 7 贴片：4 5 4 8 展片台操作，明胶粘贴剂贴片。明胶粘贴剂配方见表3 ： 表2 3 明胶粘配方 用量明胶( g e l 馏水石炭酸( p h e g 1 2 材料方法 2 2 5 照片放大倍数的计算 本实验采用的是1 3 5 胶卷，下面主要介绍利用1 3 5 胶卷边缘上的穿孔计算放大倍率 的方法汹31 3 5 胶卷边缘上的穿孔其长为3 咖，宽为2 姗，这是统一标准。 设目镜为1 0 倍与2 0 倍物镜组合的物相，将此胶卷置放大机上调焦后，用米尺在放 大板上测定孔宽的投影长度，若为1 0 咖，则此胶卷的画面放大率为1 0 0 0 。 放大后的孔宽 照片的放大倍数= 目镜倍数物镜倍数 即1 0 2 0 x1 0 2 = 1 0 0 0 倍 原孑l 宽( 2 咖) 匀、0 l 中卜“人字坝i j ：位论义 3 结果和分析 草原龙胆的花为两性花，辐射对称，每朵花下具2 个苞片，苞片披针形至线状披针 形，长约2 5 3 c m 。一朵完整的花有5 片花瓣，轮生排列，基部合生；有雄蕊5 枚，雌 蕊1 枚。子房上位，二心皮，侧膜胎座。果实长椭圆形，成熟时由绿变黄，沿腹缝线丌 裂，种子可从中间散出。成熟种子极小( 图版x v 工一1 ) ，黑色，1 9 种子可达2 万到2 力5 千粒【2 】o 3 1 花药壁的发育、小孢子发生及雄配子体发育 3 1 1 花药壁的发育 草原龙胆的花为两性花，雄蕊先成熟，每朵花有5 枚雄蕊，每个花药为四室( 图版 卜1 ，2 ) 。花药发育的早期，雄蕊原基在花瓣内侧基部突起。随后，在其横切面的四个角 隅处的表皮细胞下方，各分化出一列孢原细胞( 图版l 一3 ) ，为多胞原。胞原细胞比其他 细胞大，细胞质浓厚，具有明显的细胞核。孢原细胞进一步发育，行平周分裂( 图版卜4 ) ， 形成外面的初生壁细胞，罩面的初生造胞细胞。初生壁细胞再一次平周分裂和多次垂周 分裂形成两层次生壁细胞( 图版i 一5 ) ，次生壁细胞经过多次分列( 图版卜6 ，7 ) 形成5 层细胞，连同最外层的表皮构成花药壁。此时，花药壁共有6 层结构，出外到内依次是： 表皮、药室内壁、3 层中层、绒毡层( 陶版卜8 ，9 ) 。初刍! 造胞细胞经过我次分裂形成很 多小他子母细胞( 图版卜2 ) 。初生造胞细胞的分裂效快，使雄蕊原基横切面逐渐由圆形 变为近四边形( 图版卜1 ) 。 药室内壁是由初生壁细胞发育而来的，它只有一层细胞，当药室发育成熟后，药室 内 羹的细胞径向延长。 层由初尘壁细胞经一次平周分裂和i 多次垂周分裂形成的内层次l 三壁细胞发育来 的。中层细胞为短命结构。小孢子母细胞时期，其内含有少量淀粉粒；减数分裂期，药 室内壁细胞体积的不断增大，中层细胞被挤压。小孢子单核靠边期时，中层逐渐解体。 ：细胞花粉形成以后，中层细胞完全解体。 绒毡层是由初生壁层衍生的，小孢子母细胞时期，绒毡层细胞体积增大并液泡少而 小，细胞核为圆球形或椭球形，单核，内含多个核仁，细胞质浓厚，且形状不规则( 图 版卜8 ，9 ) ，属于分泌型绒毡层( 又称腺质绒毡层) 。小孢子母细胞减数分裂接近完成时， 药隔一侧的绒毡层细胞径向延伸( 图版卜9 ) ，为异形绒毡层。其功能是就近为小孢子母 细胞以及花粉的发育提供营养。因此，草原龙玎日的绒毡层属于异型腺质绒毡层。 综上所述，花药壁的形成遵循取子口f 型发育顺序。 3 1 2 小孢子发生 花药壁形成的同时，初生造孢细胞( 图版卜1 ) 进行多次有丝分裂形成多个次生造孢 细胞，次生造孢细胞进而发育成为小孢子母细胞( 图版一1 ) 。小孢子母细胞形态显著的 3 结果和分析 与周围的药壁组织不同，他们的体积大，细胞核也大，细胞质浓厚，没有明显的液泡。 小孢子母细胞排列紧密，并有胞间联丝互相联系。随着小孢子母细胞进入减数分裂，它 们逐渐积累胼胝质的壁。 每一个小孢子母细胞经过减数分裂，使二倍体的孢子体细胞转变为单倍体的配子体细 胞，这次分裂是一个连续的过程： 在减数分裂i 的前期经历了：( 1 ) 细线期( 图版i i 一2 ，3 ) ：细胞核内出现螺旋状细 长如线的染色体，核的体积增大而细胞体积不变。( 2 ) 偶线期：各同源染色体配对，出 现联会现象，染色体明显增粗，而且松散。( 3 ) 粗线期：配对染色体螺旋化加强，明显 缩短变粗，形成两条姊妹染色单体，配对的两条染色体共有四条染色单体，是二价体。( 4 ) 双线期：染色体进一步变粗缩短，核仁体积缩小。( 5 ) 终变期( 图版i i 一4 ，5 ) ：二价体高 度浓缩，交叉端移，中间交叉数目减少，核仁变小并逐渐消失，二价体分散于核膜内缘。 第一次减数分裂的中期( 图版i i 一6 ) ，核仁和核膜消失，出现纺锤体。纺锤丝与各染 色体的着丝点连接，二价体分散排列在赤道板上，二价体的两个着丝点分别向着相对的 一极。随后进入后期和木期，各个二价体各自分开，二价体的两个同源染色体分别向两 极拉丌，松散变细，又聚集成两个不规则的子核( 图版i i 一7 ) 。这次分裂不伴随有胞质分 裂( 图版i i 一7 ) 。紧接着就进入下一次分裂。 经过短暂的分裂间期后，第二次减数分裂丌始，在前期i i ( 图版i 卜7 ) ：每个染色体 有两条染色单体，着丝点连接在一起，相互缠绕于核膜内，但染色单体彼此分散。进入 中期i i 后( 图版工i 一8 ，9 ，1 0 ) ，每个染色体的着丝点整齐的排列在各个分裂细胞的赤道板 上，着丝点丌始分裂。后期时两组染色单体分丌，分别移到两极，与f 常有丝分裂相同。 拉到两极的染色体形成新的子核。因此，小孢子母细胞经过两次分裂，形成四个子细胞 都只含有单倍数的染色体，即“四分体”或“四分孢子”( 图版i i 一11 ，1 2 ) 。四分体的排 列大多数为四面体型，也有少数左右对称型的。刚形成的四分体外面被较厚的胼胝壁包 围。 山：f i 在减数第一次分裂后不伴随有胞质分裂，在减数第二二次分裂后同时进行胞质分 裂，形成四分体，因此小孢子母细胞减数分裂过程中的胞质分裂为同时型。 3 1 3 雄配子体发育 四分体的胼胝质壁溶解后释放出4 个小孢子( 图版i i 一1 3 ) ，刚释放的小孢子，细胞 质浓厚，细胞核位于中央。很快小孢子变得不规则，花粉壁收缩，成为收缩期的小孢子 ( 图版i 卜1 4 ) 。随着花粉壁的逐渐加厚，收缩期的小孢子花粉壁又重新变圆，细胞核仍 位于中央，核周围出现许多小液泡，即形成单核小孢子。成为游离的小孢子有明显的壁， 同时体积迅速增大。随着体积的增大，小孢子的细胞质发生液泡化，周围出现小液泡。 随着进一步的发育，小液泡融合形成大液泡，核靠近壁的一例，将此时期称作单核靠边 期( 图版i 【一15 ) 。 小孢予的有丝分裂是细胞核贴近花粉壁的位置进行。细胞核内的染色质凝聚并沿核 东北林业入学硕士学位论文 膜分布，核仁明显可见，单核小孢子进入有丝分裂前期。中期时( 图版i i 一1 6 ) ，染色体排 列于赤道面上形成赤道板，两组子染色体移向两极，染色体解旋，核膜、核仁形成，通 常生殖核的形成稍晚于营养核。由于核分裂是均等的，而细胞质的分裂却有高度的不均 等性，则所形成的两个细胞的大小差别很大。分裂完成时，营养细胞和生殖细胞之间的 壁非常明显( 图版i i 一1 7 ) 。大的为营养细胞，它包括了原来小孢子的大液泡和大部分细 胞质，而小的的生殖细胞只含有少量的细胞质。发育过程中营养细胞和生殖细胞之间的 壁逐渐消失，不久生殖细胞脱离花粉壁，游离于营养细胞的细胞质中( 图版ii 一1 8 ，1 9 ) ， 散粉时花粉为二细胞，生殖细胞逐渐变