（神经病学专业论文）利用噬菌体展示技术筛选抗aβ聚集的短肽.pdf

安徽医科大学硕士学位论文 缩写 a n o v 茂 a 1 3 a e h a c h i a d a p p b b b b d n f b f c n b 认 b i o b p i b s a c d k i c n s d a d h e e d 置a e l i s a f d f d 3 g s 薹o g u 中英文缩略语表 英文全称中文全称 a n a l y s i so f v a r i a n c a 方差分析 p - a m y l o i d多- 淀粉样蛋自 a c e t y c h o l i n e 乙酰胆碱 a n t i c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r 乙酰胆碱酯酶抑制剂 a l z h e i m e r sd i s e a s e阿尔茨海默病 a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n 淀粉样前体蛋自 b l o o d - b r a i nb a r r i e r血脑屏障 b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r 脑源性神经营养因子 b a s a lf o r e b r a i nc h o l i n e r g i cn e u r o n基底前脑胆碱能神经元 b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i s 生物分子相互作用分析 n h s l c b i o t i n生物素 b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y 细胞通透性增加蛋白 i n c r e a s i n gp r o t e i n b o v i n es u n la l b u m i n牛血清自蛋白 c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t i o n 周期素依赖性蛋白激酶抑制物 c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 中枢神经系统 d a l t o n道尔顿 d i h y d r o e r g o t a m i n e 二氢麦角胺 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i c a c i d 乙二胺蹬乙酸 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t 酶联免疫吸附剂测定 a s s a y f i l a m e n t o u sb a c t e r i o p h a g e 丝状噬菌体 f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e l a b e l l e d 异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐 d e x t r a n g l y c o g e ns y a t h a s ek i n a s e 3 糖原合成酶激酶 g l u c o s eu s e 葡萄糖利用 1 安徽蹶科大学硕士学位论文 i ( 强i 球t g l s d n g f n f 弧 n m d a o d p b s p c r p e g p h f s p s d r u r p m s a s a p p 旺 s c f v s p s p s s p r 眦 t b s t e t e m x - g a l i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r - 1 胰岛素样生长子1 i s o p r o p y l t h i o 一一d - g a l a c t o s i d e异丙基一多d 。硫代半苷 f i s h e r sl e a s ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef i s h e r 最小意义差异试验 t e s t n e r v eg r o w t hf a c t o r 神经生长因子 n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s 神经原纤维缠结 n - m e t h y l d a s p a r t a t e n 一甲基一d 一天冬氨酸 o p f i c md e n s i t yv a l u e 光密度值 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t s 双殷螺旋细丝 p o s t s y n a p t i cd e n c i t y 突触后致密区 r e a c t i o nu n i t e 反应单位 r o u n dp e rm i n i t e 每分钟转速 s t r e p t a v i d i n链霉亲和素 s e c r e t e da m y l o i dp r e c u s o rp r o t e k l 分泌型淀粉样肽前体蛋盘q 片段 一a s i n # ec h a i nf r a g m e n tv a r i a b l e单链可变区基因片段 s c a f o l dp r o t e i n 构架蛋白 、 s e n i l ep l a q u e s 老年斑 s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e 表面等离子共振仪 t r i s a c e t a t ee d l ab u r e t ”匹缓冲液 t r i s b u f e r e ds a l i n 盐缓冲液 t r i s h c le d t at e 缓冲液 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e透射电子显微镜 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l 一3 5 一溴4 氯。3 雩l 哚5 - i ) 半乳糖瞢 一d g a l a c t o p y r a n o s i d e 2 学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我 所知，除了文申特捌加以标注静致谢酶地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果。与我一阍工作的离志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了骥确说晓 并表示谢意。 学位论文使用授权声明 、增。g 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保留学位论 文并宓国家主管部门或其指定机祷送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于菲 赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阕，有权将学位论文的内容编入有 关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后 适用本规定。 学位论文作者签名： 】司先嘭 导师签名 日期：工归苫。3 - 2 碧日期：参孑，卜留 安徽嚣科大学硕士学位论文 利用噬菌体展示技术筛选抗郑聚集的短肽 摘要 背景：随着人舀寿命的延长和出生率的逐年降低，我国老龄化问题目趋严重。老 龄入群的高痴呆患病率已成为一个严峻的社会砑题。阿尔茨海默病( a l z h e i m e r s d i s e a s e ，a d ) 是导致老年人痴呆的最常见原因。罄前被批准用于临床治疗a d 的 药物寥寥无几，仅有乙酰胆碱酯酶抑制剂如多奈哌齐和n 甲基d 天冬氨酸盐受体 拮抗剂如美金刚，但这些药物不能根本性逆转a d 病情，其治疗仍处在对症水平。 目前较普遍认同的假设是脑内a b 负荷增大是a d 病理过程的启动因子。因此，抗 a b 相互聚集形成寡聚体、纤丝和老年斑的物质将可能最终成为逆转a d 患者病情 的药物。所以，研发抗a l l 褶甄聚集的药物是未来的发展方向。 目的：以a 1 1 分子上包含影嚼a 蠡分子相互聚集片段的a b l - l o 为靶分子，利用噬 菌体肽瘴展示技术筛选出与该特殊片段簏特异性结合的短肽，在体外观察其特异 性结合a b 、抑制a 8 宣发形成纤丝的能力。 方法：合成包含有e f r h 序列的a b l _ l o ，并将其部分生物素化。以生物素化的 a f l o 为靶分子，用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力噬 菌体。应用b i a c o r e 3 0 0 0 仪器检测所筛得的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关 系；透射电镜下观察特异性噬菌体能否阻止a b 分子相互聚集形成斑块；对特异 性噬菌体随祝挑取单克隆，p c r 扩增后送测序公司测序；根据测序结采合成相应 的短肽，作进一步的功能研究。 结果：经过对靶分子的三轮筛选，筛出了与a b l 啪特异结合的单究隆噬菌体； 生物传感分析技术结果进步表明靶分子( a s l _ l o ) 与所筛选噬菌体之间的结合具 有高度特异性；透射电镜下可观察到特异性噬菌体能阻止a 1 1 分子相互聚集形成 斑块；成功地对特异性噬菌体进行了测序并合成了相应的短肽。 3 安徽缀科大学硕士学位论文 结论：经过三轮的筛选，筛选出了展示特异性高亲和力结合a f t l 1 0 短肽的噬菌 体。该噬菌体所携带的特异性高亲和力短肽能够在体外阻止a 1 3 分子相互聚集形 成斑块。 关键词： 阿尔茨海默氏病p 淀粉样肽噬菌体展示 4 安嫩医科大学硕士学位论文 s c r e e n n i n gt h ep e p t i d ea g a i n s tt h ea g g r e g a t i o no fb - a m y l o i d p e p t i d ev i ap h a g ed i s p l a y a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：b e c a u s eo ft h ei n c r e a s e dl i f ee x p e c t a n c ya n dt h ed e c r e a s e db i r t hr a t e y e a rb yy e a r , t h ea g e dp o p u l a t i o ni sg r o w i n gq u i c k l y h i 曲p r e v a l e n c eo fd e m e n t i ai n t h ea g e dp o p u l a t i o nh a sb e c o m eas e r i o u ss o c i a lp r o b l e m a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) i s t h el e a dc a u s ef o rd e m e n t i ai nt h ee l d e r l yc u r r e n t l y , h o w e v e r , f e wd r u g sh a v eb e e n a p p r o v e df o rc l i n i c a lt r e a t m e n to ft h ea d ，i e 。，a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r s ( e g 。， d o n e p e z i l ) a n dn - m e t h y l d a s p a r t a t er e c e p t o ra n t a g o n i s t ( e g ，s a l tm e m a n t i n e ) 。b u t t h e s ed r u g sc a nn o tr e v e r s et h ep a t h o l o g i cc h a n g e so fa db r a i n u pt o d a t e ，t h e t r e a t m e n to fa di ss t i l li ns y m p t o m a t i cl e v e l a tt h ep r e s e n t ，t h eh y p o t h e s i sa c c e p t e d b yr e s e a r c h e r sm o r ea n dm o r ei st h a ti n c r e a s e da bl o a di st h ei n i t i a t i n gf a c t o ro fa d o n s e ta n dr e s p o n s i b l ef o ra dp a t h o l o 菩ep r o c e s s t h e r e f o r e , t h em a t e r i a l sw h i c h a g a i n s ta ba s s e m b l yt of o r mo l i g o m e r s ，a n dt h es e n i l ep l a q u e sm a ye v e n t u a l l yb e c o m e t h ed r u g so f a dt r e a t m e n tr e v e r s e da d p a t h o l o g y o b j e c t i v e ：t os c r e e na s o m eo l i g o p e p t i d e ( s ) w h i c hc a ns p e c i f i c a l l yb i n da b o ， a n di n v e s t i g a t ew h e t h e rt h es p e c i f i cp h a g e sd i s p l a y i n gt h eo l i g o p e p t i d e ( s ) c a nb i n da 8 a n di n h i b i t ei t sa g g r e g a t i o n m e t h o d s ：a 1 3 1 1 0w h i c hi n c l u d e st h ee f r h ，as e q u e n c ei n v o l v e di na 1 3a g g r e g a t i o n , w a su s e dt ot a r g e tm o l e c u l a r , a n ds y n t h e s i z e da n dl a b e l e db yb i o t i n 。ar a n d o m i z e d 12 一m e rp e p t i d el i b r a r yp r e s e n t e d0 1 1m 13p h a g e sw a su s e dt os c t e e nt h ep e p t i d e s ( p h a g e s ) s p e c i f i c i t yo ft h es e l e c t e dp h a g e st ob i n dt h eb i o a b l 。1 0w a se x a m i n e db y b i a c o r e 3 0 0 0i n s t r u m e n t t h es p e c i f i cp h a g e si n h i b i t ea ba g g r e g a t i o ni nv i t r ow a s o b s e r v e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e o l i g o p e p t i d e ( s ) s e q u e n c e s 安徽医科大学硕士学位论文 d i s p l a y e d o nt h es p e c i f i cp h a g e sw e r ea l s od e t 芒杞氏；d r e s u l t s ：t h ep h a g e sw h i c hc o u l db i n dt ot h ea b l 1 。w e r ea c q u i r e da f t e r3r o u n d so f p a n n i n g 。t h es p e c i f i c i t yo fs e l e c t e dp h a g e sb m d m gt oa l h 1 0w a si d e n t i f i e d 。t h 。e s p e c i f i cp h a g ec o u l do b v i o u s l yi n h i b i t e da ba g g r e g a t i o ni nv i t r o 。 c o n c l u s i o n ：t h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ep h a g e sd i s p l a y i n gs p e c i f i c o l i g o p e p t i d e ( s ) c o u l dh a v e b e e na c q u i r e da n dp r o h i b i ta ba g g r e g a t i o n k e yw o r d s ：a l z h e i m e r sd i s e a s e b - a m y l o i d p h a g ed i s p l a y 6 安徽薮斟大学硕士学位论文 1 1 前言 随着人口寿命的延长和出生率的逐年降低，我国老龄化问题日趋严重。老龄 人群的高痴呆患病率已成为一个严峻的社会问题。阿尔茨海默病( a l z h e i m e e s d i s e a s e ，a d ) 是导致老年人痴呆的最常见原因f i 】。在6 5 岁的老年人中，每1 0 人即 有位是a d 患者。据估计，到2 0 2 5 年，全世界的a d 患者将达3 千4 百万人【l 】。迄今 为止，仅有两类药物：乙酰艟碱酯酶抑制帮( c h o l m e s t e r , m ei n h i b i t o r ) 如多奈哌齐 ( d o n e p e z i l 和n 一学基一p 一天冬氨酸盐受体拮抗荆( n - m e t h y l d a s p a r t a t e , 舯如美金剐( m e m a n t i n e ) 被批准用于临床治疗。这些制剂都是在a d 发病机 制的下游水平起作用，实质上是对症治疗，虽然对症改善病人的躁常生活水准， 有一定的帮助，对疾病的进展没有任何延缓作用。此外，乙酰胆碱酯酶抑制剂仅 对痴呆症状较轻的a d 患者有效，且对3 0 - 4 0 的患者没有疗效，约3 0 的患者由于 副反应而终止治疗f i j 。因此，迫切需要寻找延缓疾病进程，乃至治愈该病的药物。 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 又称原发性老年性痴呆瘕，是导致 老年人痴呆的最常见原因。临床上以进行性的记忆和认知功能障碍为特征，以记 忆力、感觉能力、判断力、思维能力、运动能力、情感反应等降低为主。其主要 病理特征为：颡叶和海马皮质等部位神经元丢失；神经原纤维缠结 ( n c u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t s ) ： 老年斑( s e n i l ep l a q u e s ，s p s ) ，主要成分为蠡 淀粉样蛋白多肽( b a m y l o i dp e p t i d e ，a b ) ；脑血管淀粉样病变。其特征性病理 改变为神经元丢失、n f t s 和s p s 【1 幺1 9 1 。老年斑的主要成分是b 淀粉样蛋白 ( b 。a m y l o i d ，a s ) ，以a b l 。4 0 和a b l - 4 2 为主。虽然导致a d 的确切病因不明，但a b 级联反应假说得到了广泛认可 2 】。该假说认为是a 8 启动了a d 的发病过程，并且在 a d 的发生发展中起关键作用。脑中a b 水平增加与认知能力下降正相关f 3 】。已有的 证据提示可溶性a 多原纤丝厂寡聚体疆嗣和不溶性a p 纤丝随甚至斑块7 都有神经毒性 作焉。因此，任何降低脑i 勾a 1 3 负荷的方法都哥达到延缓或终止疾病进展的香的。 可采取的手段包括：减少a 生成；防止a b 聚集翟形成纤丝；增加a 清除 ( 包括清除寡聚体和已形成的斑块) 。 安徽医科大学硕士学位论文 国内外很多学者在降低脑p 畸a 1 3 负荷方面进行了许多探索，代表性的工作集中 于两大方面。首先是调节分泌酶的表达和活性以减少a b 生成。a b 由淀粉样前体蛋 自( a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ，a p p ) 先詹经蠡一和分泌酶岱一8 e c l e t a s e , 了- s e c r e t a s e ) 裂解 面成。但在正常情况下，a p p 主要先后经* 和了。分泌酶裂解，产生具有神经保护效 应和增强记忆能力的可溶性片段( s a p p e r ) 【s 】。若通过增加仅分泌酶的表达和活性 或抑制b 分泌酶( b a c e l ) 的表达和活性，可减少a d 脑中a 6 产生。但是，无论是 a 分泌酶还是b 分泌酶，都有其它许多生物学功能，抑制它们的活性都可能导致不 良后果，甚至癌症【9 】。其次是免疫学方面的探索。这方面的工作开始于上世纪8 0 年代。在不同的a d 转基因小鼠模型上，用a j 3 2 e 动免疫或用a p 单克隆抗体被动免 疫治疗都获得了较好的结果，鄄淀粉样斑块鹗显减少、有效地降低- j a j 3 负荷、缓 解了记忆绗为损害防1 钔。但因在i l 鑫期l 瞄床实验过程中出现了严重并发症脑膜脑 炎 1 5 , 1 6 1 ，导致免疫治疗实验终止。虽然后来仍有零星研究f 1 7 1 ，但是都没有进展到 临床实验层次。因此，必须开发既可以与a b 特性性结合，又不具有免疫原性、不 导致抗原抗体介导的补体炎症反应，且能快速透过血脑屏障的a d 治疗新药。 目前的研究结果表明，a b 聚集沉积形成淀粉样斑块涉及多个相互作用位点。 已知a b 分子的第3 6 ( e f r h ) 与a b 聚集有关。e f r h 是a b 分子的抗原表位， 可能涉及到a b 分子的聚集过程。f 确【l l 【e l 【i s , 1 9 等用抗a b 氨基端的直接位点单克隆 抗体( m a b ) 6 c 6 和1 0 d 5 作为靶分子，用展示1 5 肽的噬菌体肽库进行筛选，所得 到的阳性克隆与6 c 6 或1 0 d 5 有较高的亲和力。阳性克隆噬菌体表面展示的肽段的 氨基酸序列均为e f r h 。提示e f r h 力a b 分子的抗原表位，可能涉及到a b 分子 的聚集过程，并且是a b 分子溶解和解聚的调节位点。若能够找到其相应的配体， 将其封闭，便可以干扰a b 分子的相互聚集。如果将a b 分子相互聚集的关键调节 位点成功干扰，必然会达到抗a b 聚集的目的，从病因上治疗a d 。 发展小肽是个很好的选项。肽药有如下优点【2 0 】：相较于抗体，制造成本低； 在同等质量下活性高于抗体；稳定性较好，便于常温保存；与免疫系统发生意外 相互作用的机会小( 抗原性低) ；穿透性强( 便于穿过肠道和b b b ) ；没有抗体特 8 安徽孤辩大学硕士学位论文 有的f c 片段，不能激活t 细胞或补体，所以导致脑膜脑炎或脑出血的可能性极小； 可以大瓶模生产。露前，噬菌体展示技术已成为筛选特异性结合多肽的有力工具。 展示在噬菌体表面的肽库可以含有l x l o m 个不同的短肽。著以上述的功能片段为 靶分子，利用噬菌体展示肽库筛选出相应的配体，再对配体作必要的基团修饰， 从而进行抗a b 聚集。 总之，本课题圈的在于以a b 分子上包含影响a b 分子相互聚集片段的a f t h 8 为靶分子，利用噬菌体肽库展示技术筛选出与该特殊片段能特异性结合的短肽， 在体外观察其特异性结合a b 、抑制a f t 自发形成纤丝的能力。首先，合成包含有 e f r h 序列的a b i - l o ，并将其部分生物素化。再以生物素化的a b l 1 0 为靶分子，采 用噬菌体展示技术中的液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力强的噬菌体。应用 生物分子相互作用分析仪( b i a e o r e 3 0 0 0 仪器) 检测所筛得的噬菌体与靶分子之间 的亲和动力学关系；透射电镜下观察特异性噬菌体能否隰止a b 分子相互聚集形成 斑块；对特异性噬菌体隧机挑取单克隆，p c r 扩增后送测序公司测序；根据测序 结果合成相应的短肽，作进一步的功能研究。 9 安徽医科大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 主要仪器 主要仪器设备见表2 。 表2 实验中涉及的主要仪器设备 仪器、设备名称生产商和型号 立式压力蒸汽灭菌器y x q - l s 5 0 s l l 上海博讯实业有限公司 离心机 c e n t r i f u g e a n k e - t d l - 5 0 b ，c e n t r i f u g ea v a n t ij - 2 0 x p b e c k m a n 电热恒温鼓风干燥箱y 【a 2 0 0 0 山东潍坊精鹰医疗器械有限公司 数显恒温水浴锅h h 6 江苏省金坛市荣华仪器厂 7 2 1 分光光度计7 2 3 0 g 上海精密科学仪器有限公司 紫外分析仪 w d 。9 4 0 3c 北京六一仪器厂 脱色摇床t y - 8 0 b 南京新校园生物技术研究所 电子天平 j y l 0 0 0 1j y 2 0 0 2 上海精密科学仪器有限公司天平 仪器厂 ， 豪华型超净工作台j i a c h e n g 上海成顺仪器仪表厂 - - 8 0o c 超低温冰箱 a d v a n t a g e 美国 - - 2 0o c 冰箱 b d 1 9 8 s 海尔集团青岛电冰柜总厂 美的微波炉小康星p j 2 3 c s c i 电泳仪d y y - 1 0 北京六一仪器厂 电泳槽3 3 a 北京六一仪器厂 l “ 安徽趿科大学硕士学位论文 制冰机 纯水机 精密p h 计 a f l0 意大利s c o t s m a n 公司 h b r o 0 5 杭州惠邦净水设备有限公司 p h s 3 c 上海雷磁仪器厂 磁力搅拌器 i k ar h 。k t c 德国 生化培养箱s p x 8 0 上海跃进医疗器械厂 荧光显微镜 o l y m p u si x 一7 0 透射电子显微镜t c c n a i2 0 美国f e i 公司 温控培养摇床 r o e k i n g - i n c u b a t o r - z h w y - 2 11bz h c h e n g ) 生物分子相互作用分b 敞c o 糟3 。 析仪 2 1 2 主要耗材 e l i s a 聚苯乙烯微孔实验反应板 短肽a 1 3 l 邶及b i o t i n a b l 1 0 由西安华辰公司合成 链霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ，s a ) 购囱美国s i g m a 公司 生物素( n h s l c b i o t i n ) 购自美国s i g m a 公司 2 1 3 主要试剂 2 1 3 1 培养基及配方 见表3 。调p h = 7 0 ，加蒸馏水定容，t1 2 1 c ，p0 1 0 3x 1 0 6p a ，高压灭菌 3 0 m i n 。 安徽溪祷大学硕士学位论文 表3 培养基及配方 培养基成分浓度 l b 固体培养基 t o p 培养基 y t 培养基 y e a s t e x t r a c t n a c l t r y p t o n e a g a r a y e a s t e x t r a c t n a c l t r y p t o n e a g a r a y e a s t e x t r a c t 5g l 5g l 1 0g l 量2 影l 5g l 5g l 1 0g l 6g l 5g l n a c l5g l t r y p t o n e 1 6g l 一i t 一 一丛蝗1 2 。! ：互型垦 2 1 3 2 溶液 p 嚣g ，n a c l ：2 0 p e g ，1 5 0m mn a c l t 嚣a ：0 1m t r i s - h c l ：lm m t r i s ，h c l 调p h 至7 。4 t b s ：5 0m m 曩i s 量 c l 与1 5 0m mn l 加水定容，0 1 0 3x 1 0 6p a 高压灭菌 3 0 m i n i p t g x g a l 1 2 5gi p t g 和1 9 x g a l 溶于2 5m l 二甲基甲酰胺 p b s ：先分别配o 2m 的n a h 2 p 0 4 溶液和0 2mn a 2 h p 0 4 溶液，常规灭菌， 然后每取1 9m ln a h 2 p 0 4 溶液和8 lm 1n a 2 h p 0 4 溶液，混匀后即为1 0 0 m lp h7 4 ，0 2mp b ( 4 * c 下贮存) ，加入o 8 5gn a c l ，即为o 2mp b s ， 如配制o 0 lmp b s 则取5 0 m lo 2mp b ，加8 5g n a c l ，用双蒸水定 容至lk 即为0 0 lm p b s 乙酸钠：3m m ，p n5 2 t e 缓冲液：1 0m m t r i s 。h c i ，p n 8 0 ，lm me d t a 电泳缓冲液( w 岖) ：4 0m mt r i s 一乙酸盐，1m m e d t a 1 2 安徽医科大学硕士学位论文 琼脂糖凝胶：1 2 溶于电泳缓冲液( t a e ) 中，加热溶解 p h a g eb u f f e r ：1m mc a c h 、1m mm g c l 2 、1 0m mh e p e s 加蒸馏水，调p h 至7 碡，灭菌，冷却蜃加入0 。5 b s a 无水乙醇：9 9 纯度 p c r 试验用试剂：高保真即用p c r 扩增试剂盒 2 1 4 菌株 弛。d 。c 7 c 噬菌体展示文痒试剂盒( n e we n g l a n db i o l a b s ) e 。c o l ie r 2 3 7 8 宿主翦( n e we n g l a n db i o l a b s ) 2 2 实验步骤 、 2 2 1 噬茵体文库的扩增 2 2 1 1e c o l ie r2 3 7 8 的扩增 e r 2 3 7 8 甘油菌划线接种l b t 戡平板，倒置平板3 7 。c 培养过夜，封口膜 封闭平板后4 。c 避光保存。 由平板上挑取单克隆菌落接种到3 0 0m l 含o 2 豳环素的培养基 中，在3 7 4 c 摇床上培养4h ，生长到对数早期( o d6 0 0 。0 0 5 ) ，j 以备噬菌体扩 增用。 2 。2 1 。2 噬菌体扩增 在超净工作台中，取一定量的噬茵体( 数量少于e c o l i ) 接入到3 0 0m l 的 上述大肠杆蓥液中，在3 7 。c 摇床上培养5h 左右( 至看到溶液混浊为盘) 。 2 2 1 3 噬菌体回收 将上述含噬菌体与大肠杆菌的溶液倒入5 0m l 的离心管中，天平上配平 屠，在4 c 、8 0 0 0 r p m 的离心机中离心1 0 m i n ，沉淀e c o l i ，取上清。再重复离 心一次。 在上清中加入六分之一体积的p e g ，4 c 过夜沉淀，孬以1 7 0 0 0r p m ，离 1 3 安徽嚣辞大学硕士学位论文 心1 0m i n ，沉淀噬菌体，弃上清。 焉t b s 悬浮沉淀物，再加入六分之体积的p e g4 c 下沉淀2 - - 3h ，再 以1 7 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。沉淀用t b s 重悬浮，1 5 m le p 管分装，封 口膜封闭4 c 保存。 2 。2 。1 4 滴度测定 镛l b 平板：将西体l b 培养基餍微波炉秀嚣燕溶化，稍冷却后( 温度约 7 0 c 时) ，在超挣工作台蠹，加入四环素( 5 0 0 ：1 ) ，将液体l b 倒入培养板中， 每板约l o m l 。 倒t o p 管：将锥形瓶中的t o p 培养基事先在微波炉中预热、溶化，然后 在超净工作台内将其倒入1 5m l 的t o p 离心管中，每管约3m l ，然后放置恒温水 浴锅内( 维持在5 5 左右) 备用。 取9 9 0i l ly t 培养基放入1 5m 1 的离心管中，共1 2 管，分别编号：a 1 、 a 2 、a 3 、a 4 、a 5 、a 6 、b 1 、b 2 、b 3 、b 4 、b 5 和b 6 。 先分别取1 0 瘴噬菌体放入a l 、b l 中，混匀稀释l 铲，然后分剃从a l 、 b l 中取l om 噬菌体加入对应的她、b 2 ，混匀稀释至l g - 4 ，依此类推，依次稀 释直到到a 6 、b 6 稀释到1 0 - 舱。 分别从a 4 、b 4 ( 1 0 - 8 ) ，a 5 、b 5 ( 1 0 - 1 0 ) ，a 6 、b 6 ( 1 0 - 1 2 ) 中取l o 出、 1 0 0m 两个梯度加入含有i p t g x g a l 的e c o l i 菌液中( 3 0 0 “1 ) ，再将其加入t o p 离心管中，混匀，并一起倒入l b 琼脂平板顶层，待其冷却凝固。 将l b 琼脂平板倒置，放入3 7 c 生化培养箱中过夜。 次西数噬萤体蓝斑形成单位( p f u ) ，计算滴度：滴度一p f u 稀释倍数， 比如1 0 瓣a 5 和1 0 0 一b 5 ( 1 0 - o ) 铺板的分剃有l o 与9 0 个噬菌斑，则含的噬 菌体数分别记为：1 0 x1 0 1 0 l o 与9 0 x 1 0 1 0 l o om ，则滴度分别为lx 1 0 1 3 m l 和 9 x1 0 1 2 m l 。 2 。2 。2 体外筛选 1 0 0l a g m ls a o 1m o l l n a h c 0 3 ( p h8 6 ) 1 0 0 越包被聚苯乙烯微孔板，4 c 1 4 安徽医科大学硕士学位论文 过夜； 将生物素化短肽1 0 0 肛g m lb i o t i n 。a b l 1 0 、1 0m ( 2 0 x 1 0 bp f u m 1 ) 的噬菌体 与4 0 0mp b s t 混合加入e p 管内，室温孵育6 0m i n ，然后4 c 反应过夜，使噬菌体与 短肽结合； 将噬菌体短肽加入洗涤过的板孔，室温6 0m i n ； p b s t 振洗5 次，髯用0 2m o l l 甘氨酸。盐酸( p h 3 5 ) 加入板孔振洗5 次，洗 去未结含的噬菌体； 加入0 。lm m o l l 生物素孵育两次，每次5r a i n ，使与s a 结合的噬蓥体解离； 10 0p 1 含lm g m lb s a 的0 2m o l l 甘氨酸盐酸( p h 2 2 ) 力n a 板孔，轻摇10m i n ， 吸出洗涤液后用1 5 “11m o l l t r i s h c l ( p h 9 1 ) 中和； 扩增洗脱液中含有的噬菌体：将洗脱液加入生长至对数早期的e e o l i 2 5 3 7 培 养液中，3 7 。c 高速振荡培养5h 。将培养液离, l , 1 0m i n ( 1 0 0 0 0r m i n ) 取上清，加 入1 6 体积酶p e g n a c l4 c 过夜沉淀噬菌体； 检测扩增的噬菌体的滴度，网2 。2 。l 。4 节； 第二三轮筛选：当第一轮不同时间点的脑内得到的噬菌体数量稳定在一 定的数量级水平时，开始进行第二轮的筛选。为了提高噬菌体的特异性，降低非 特异性噬菌体的扩增，可以适当控制洗脱的条件，可将洗脱液中的t w e e n 2 0 浓 度分别调整为0 1 _ 0 5 ，0 5 - 1 o ，其余不变，如此重复。当第二轮 出现富集效瘦的噬菌体稳定在菜一水平时( 至少较第一轮的高l o 倍左右方可) ， 再进行第三轮的筛选。体外筛选的步骤圈第一轮，但第三轮的豹洗脱物不必弄扩 增，滴度测定时，平板培养的时闻不超过4 8h ，避免培养时间过长出现缺失。其 余洗脱物4 贮存。 2 。2 3 用生物分子相互作用分析仪( b i a e o r e 3 0 0 0 ) 鉴定所筛选的噬蘸体与a b i 。1 0 结 合的特异性 2 2 3 1 仪器b i a e o r e 3 0 0 0 所采用的b i a 技术简介 b i a ( b i o m o l e e u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i s ) 技术是基于一种表面等离子共振( s p r ) 的物理光学现象的生物传感分析技术。不必使用荧光标记和同位素标记，从而保 1 5 安徽医科大学硕士学位论文 持了生物分子的天然活性。当入射光以临界角入射到两种不同透盟介质的界面时 将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层 金属薄膜后，由于入射光可以引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一 定的角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金 属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变。折射率的变化( 即反应单位 r e a c t i o nu n i t ) 又和结合在金属表砥靛大分子质量成正比。因此，b i a 技术可以通 过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始的数据，并经相关处理获得结 果即传感图。b i a c o r e 系统的3 个核心部分是传感器芯片，s p r 光学检测系统，微 射流卡盘。其中传感器芯片是实时信号的传导载体。芯片是在玻璃片上覆盖了一 层金膜，在金膜的表面连有不同的多聚物以形成不同的表面环境，以利于固定不 同性质的生物分子。每个芯片表面有4 个通道( f c ) ，可以独立做4 个不同的实验， 也可以傲实时的对照实验。s p r 光学检测系统，收集反应全过程中各种分子反射 光的吸收僮，获得初始的数据，并经相关处理获得结果一传感图。微射流卡盘，是 ，一个液体传送系统，通过软件的控制自动地传送一定体积的样品至传感器芯片表 面的不同通道。甚至自动进行样品的回收。 2 2 。3 2 操作流程 l 、样品准备样品包括耦联到芯片表面的分子( 1 i g a n d ) 和在溶液中流过的样 品，称作a n a l y t e 。如果l i g a n d 是小分子，要检查该分子结构上是否有可供耦联的 俄基团，如果没有需要考虑对分子进行修饰。 2 、缓冲液准备该实验要求所有缓冲液都经过过滤和脱气处理。如果缓冲液 能够耐受高温的话，可以对缓冲液进行灭菌处理。这样灭菌有脱气的效果，同时 也能保存更长的时闻。 3 、耦联参照耦联的具体方法。 4 、测试将分析物用合适的缓冲液稀释处理，上样。要尽可能让样品缓冲液 与系统载流缓冲液一致， 5 、再生再生是指将结合到芯片表面的分析物洗脱掉，以便芯片的重复使用。 2 2 3 3 本实验采用的具体鉴定方案 l 、以s t r c p t a v i d i n 和b i o t i n 为对照的结合特异性实验，以排除所筛选出的噬菌 1 6 安徽医科大学硕士学位论文 体与上述物质有亲和性关系 将1 0 0p g m ls a + 0 1m m o l lb i o t i n 的混合物预先偶联到传感器的第一通 、 点 遭； 将1 0 0l _ t g m ls a 与1 0 0i t g m lb i o t i n - a f l l 1 0 的混合物预先偶联到传感器的第 二通道； 用筛选到的第三轮噬菌体( 1 0 x 1 0 9p f u p 1 ) 先后流过第一通道和第二通道， 流速5p l m i n ，进样6 m i n ； 比较第二通道和第一通道的反应单位值( 翘) ，值越大提示两分子之闻摆互 作用力越强，若两者之差为正值，提示第二通道上的b i o t i n - a b l 1 0 与第三轮 噬菌体有特异性结合。值越大，结合越多。 2 、短肽竞争性抑制实验 将1 0 0 “g m ls a + o 1m m o l lb i o t i n 的混合物预先偶联到传感器的第一通 道： 将1 0 0 _ t g m ls a 与1 0 0 t g m lb i o t i n a l h 1 0 的混合物预先偶联到传感器的第 二通道； 用预先与a b l _ l e 结合的第三轮噬菌体( 1 0 1 0 9p f u p 1 ) 先后通过第一通道和 第三通道，流速5l 上l m i n ，进样6m i n ，比较第二通道和第一通道的反应单 位值( r u ) ，若两者之差为正值，也说明筛选到的噬菌体与a b l 1 0