（植物学专业论文）拟南芥叶绿体deg2蛋白酶功能研究.pdf

国舡巍掌拟南芥光辅，。簖蛋白黼锹 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本声明的法律责任由本人承担。 敝储私r 川一卜冲 9 麓獬囊枣 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 。似幺0 | 、 ，衫 ，何 吞 签，、勿7 师导 麓鳓囊誊 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 中文摘要 光系统i i ( p s i i ) 是叶绿体中由多个亚基组成的色素蛋白复合体，它催化光 驱动的水裂解并释放氧和质子。尽管光是光合作用所必需的，但是如果光强过高， p s i i 复合体中电子传递受阻，就会导致p s i i 发生可逆性失活，进而引发其p s i i 反 应中心d l 蛋白的不可逆失活。当光损伤d 1 蛋白的降解速度超过其从头合成速度 就会产生光抑制，导致光系统i i 最大光化学效率的下降。因此，d 1 蛋白的快速周 转是光系统重要的修复机制，对于植物抵抗高光生长是非常重要的。 叶绿体内有2 0 0 多种蛋白酶，对于这些蛋白酶中哪些参与了d 1 蛋白周转以及 其作用机制仍不清楚。d e 酡蛋白酶是定位于叶绿体类囊体膜非跺叠区的基质侧 的不依赖于a t p 的丝氨酸蛋白酶，体外实验表明，d e 蛇蛋白酶参与了光损伤d l 蛋白的初步剪切。然而这些实验都仅仅局限在体外水平，d e 9 2 蛋白酶在体内的 作用机制目前还不清楚。 为了研究d e 9 2 蛋白酶在植物体内的作用，我们分离y d e 9 2 蛋白酶功能缺失 型突变体。我们的结果显示：在正常的生长条件下，突变体的生长曲线和野生型 基本一致；而且二者的类囊体蛋白的转录、翻译以及色素蛋白复合物组成也没有 明显区别。我们迸一步验证了突变体p s i i 对高光的敏感性以及高光下d l 蛋白的降 解情况，结果表明在相同的高光处理条件下，无论林可霉索存在与否，光系统 的最大光化学效率的变化曲线都和野生型没有区别，同样，蛋白免疫印迹证明光 破坏d l 蛋白的降解在突变体和野生型之间也没有明显区别。因此我们认为：d e 口 蛋白酶对于d l 蛋白的降解以及光抑制情况下对光系统i i 的保护不是必需的，关于 d l 蛋白的首次剪切，不能排除有其他蛋白酶的参与这些过程。 关键词：拟南芥：d 1 蛋白；降解；光保护 囝麓瓣文窖 拟南芥光系统i id e 9 2 蛋白酶功能研究 a b s t r a c t p h o t o s y s t e mi i ( p s i i ) i sal a r g ep r o t e i n - p i g m e n ta s s e m b l yt h a tc a t a l y z e st h e l i g h t - d e p e n d e n to x i d a t i o no f w a t e rt om o l e c u l a ro x y g e ni nc h l o r o p l a s t a l t h o u g hl i g h t i st h es u b s t r a t oi np h o t o s y n t h e s i s ，i tc a l la l s ob eh a r m f u l e x c e s sl i g h tw i l ll e a dt ot h e a r r e s to fe l e c t r o nt r a n s p o r tw i t h i np s i i ，t h er e v e r s i b l ei n a c t i v a t i o no fp s i i , a n d i r r e v e r s i b l ed a m a g eo ft h ep s i ir e a c t i o nc e n t e rd ip r o t e i n w h e nt h er a t ed a m a g eo f d ie x c e e d st h ec a p a c i t yf o rr e p a i r ，p h o t o i n h i b i t i o no c c u r s ，w h i c hr e s u l t si nad e c r e a s e o f t h em a x i m u me f f i c i e n c yo f p s i ip h o t o c h e m i s t r y t h eh i 曲t u r n o v e rr a t e so f t h ed 1 p r o t e i nr e p r e s e n ta ni m p o r t a n tm e c h a n i s mt om a i n t a i np s i ii naf u n c t i o n a ls t a t e m o r et h a n2 0 0p r o t c a s e sh a v eb e e ni d e n t i f i e di nc h l o r o p l a s t s h o w e v e rt h e p r o t e a s e si n v o l v e di nd id e g r a d a t i o na n dp o s s i b l em e c h a n i s m sr e m a i n e dl a r g e l h y l l n k n o w n d e 9 2 ，ac h l o r o p l a s ts t r o m a lp r o t e i no ft h en o n - a p p r e s s e dr e g i o no f t h y l a k o i dm e m b r a n e ，h a sb e e ns h o w nt op e r f o r mt h ep r i m a r yc l e a v a g eo f t h ed el o o p o f t h ed 1p r o t e i n nv i t r o h o w e v e r , nv i v or o l eo f d e 9 2r e m a i n su n r e s o l v e d t oi n v e s t i g a t et h er o l eo fd e 9 2 nv i v o ，h e r ew ei s o l a t e da l la r a b i d o p s i sm u t a n t p l a n tl a c k i n gd e 9 2g e n e st os t u d yt h ef u n c t i o no fd e 9 2 t h ep h e n o t y p eo f t h ed e 9 2 m u t a n tu n d e rn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n sw a ss i m i l a rt ow i l d - t y p ep l a n t s p s i ia c t i v i t y , t h y l a k o i dp r o t e i nl e v e l sa n dp r o t e i nc o m p l e x e sw e r en o ta l t e r e di nt h em u t a n t d u r i n g t h ep h o t o i n h i b i t o r yl i g h tt r e a l r a e n t , t h ee x t e n to fs u s c e p t i b i l i t yt ol i g h t - i n d u c e dp s i i p h o t o i n h i b i t i o ni nd e 9 2m u t a n tw a ss i m i l a rt ot h a ti nw i l d - t y p ep l a n t si nt h ea b s e n c e o r p r e s e n c eo fl i n c o m y c i n w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er a t eo ft h e d e g r a d a t i o no fd 1p o l y p e p t i d ei nd e 9 2m u t a n t sw a sa l s oe q u i v a l e n tt ot h a to fi n w i l d - t y p e t h u s ，t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a td e 口i sn o t 北贮e s s a r yf o rd 1d e g r a d a t i o n a n dp r o t e c t i o no f p h o t o s y s t e mi if r o mp h o t o i n h i b i t i o n k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ；d e 9 2 ；d 1p r o t e i n ；d e g r a d a t i o n ； p h o t o p r o t e c a t i o n 2 和褒誊 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 缩写( a b b r e v i a t i o n s ) a e r y l a m i d e a s p a s t i ca c i d a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e n n - m e t h y l e n e b i s a e r y l a m i d e b l u en a t i v eg e l c h l o r o p h y l l c y t o c h r o m e c e t y l t r i m e t h y la n m a o n i t t mb r o m i d e c y t o c h r o m eb 5 5 9 c y t o c h r o m eb 6 f n - d o d e e y l - 3 - d m a l t o s i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 1 1 地m a x i m a lf l u o r e s c e n c el e v e li n d a r k a d a p t e c ls t a t e 1 1 壕m i n i m a lf l u o r e s c e n c el e v e l 1 r i 圮m a x i m u m q u a n t u m em c i e n c y p h o t o c h e m i s t r yo f p s i i a f t e rd a r k - a d a p t i o n g i i l c o s e 6 p p it r a n s l o c a t o r n - 2 一h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n - 2 s u l f o n i ca e i d e t h i a n e h i s t i d i n e 硒1 0 d a l t o n l i g h th a r v e s t i n gc o m p l e xi i 3 - m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i c a c i d o x y g e ne v o l v i n gc o m p l e x 3 丙烯酰胺 天冬氨酸 三磷酸腺苷 甲叉双丙烯酰胺 蓝绿温和胶 叶绿素 细胞色素 溴化十六烷三甲基铵 细胞色素b 5 5 9 细胞色素b 6 ，f 十二烷基麦芽糖苷 脱氧核糖核酸 乙二胺四乙酸 暗适应后的最大荧光 暗适应后的初始荧光 光系统最大光化学效 窒 葡萄糖6 一磷酸磷酸盐转 运蛋白 n - 2 羟乙基哌嗪n 2 一 乙磺酸 组氨酸 干道尔顿 捕光色素复合体 3 吗啉丙磺酸 放氧复合体 b 熨 彰 。 a m s s 腑娜脚羞脒跚哪一删蝴肼一一 陆 【2 一 唧 娜 羞鼢一一咄 蔫滋巍妻 拟南芥光系统i id e 9 2 蛋白酶功能研究 p a g e p b s p c r p h e o p s i p s i i p q p 6 8 0 q a , q b r t p c r r n a s d s s e r t e m e d 州s t r i t o i l x 1 0 0 t y r p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e o p h y t i n p h o t o s y s t e mi p h o t o s y s t e mi i p l a s t o q u i n o n e p s hr e a c t i o nc e n t e rc h l o r o p h y l l p r i m a r ya n ds e c o n d a r y p l a s t o q u i n o n ee l e c t r o n 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸缓冲液 聚合酶链式反应 去镁叶绿素 光系统i 光系统i i 质体醌 光系统反应中心叶绿素 原初和次级醌电子受体 a c c e p t o ro f p s i i , r e s p e c t i v e l y r e v e r s e t r a n s c r i p tp c r反转录聚合酶链式反应 r i b o n u c l e i ea c i d核糖核酸 s o d i u md o d e e y ls u l f a t e十二烷基硫酸 疵 丝氨酸 n , n , n , n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n - 四甲基z , - - - 胺 t r i s h y d r o x y m e t h y a m i n o - m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 t - o e t y l p h e n o x y p o l y - e t h x o ye t h a n o l 聚e , - - - 醇辛基苯基醚 t y r o s i n e酪氨酸 4 囝蔫谶巍窖 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 刖看 生物界利用的能量绝大部分都来自太阳能，光合作用是自然界将光能转换为 生物能够利用的化学能的主要途径。高等植物，藻类和某些细菌都可以进行光合 作用、其中高等植物的光合作用起着最为显著的作用。植物在利用太阳能合成有 机物的同时，释放出重要的副产品一氧气，为有机体的呼吸提供源源不断的氧 化力。它为人类、动植物和无数微生物的生命活动提供有机物、氧气和能量，是 地球生命现象的基础。在高等植物中，光合作用的光能吸收、传递和能量转化过 程是在具有一定分子排列及空间构象的色素蛋白复合体及相关的电子载体中完 成的( 图1 ) 。这些蛋白复合体大都镶嵌在叶绿体的类囊体膜中，包括最主要的 四种膜蛋白复合体：光系统i ( p s i ) 、光系统i i ( p s h ) 、细胞色素b 6 f 复合 物( c y t b 6 f ) 和a t p 合酶复合体。 图l 、叶绿体类囊体膜上四种超分子蛋白复合体( p s i 、p s i i 、c y t b da n d a t p a s ec o m p l e x ) 以及电子传递过程。( 引自n i e l d 研究组) f i g l t h ef o u rs u p e r c o m p l e xo nt h y l a k o i d ( p s i 、p s i i 、c y t b 6 f a n d a t p a s e c o m p l e x ) a n dt h ep r o c e s so f e l c c o n 协m s p o r t 除了进行光合作用外，叶绿体还参与氨基酸，脂肪酸，脂类，植物激素， 核苷酸，维生素，以及次级代谢产物等许多重要细胞组分的合成，同时叶绿体也 在氮和硫的同化作用中起着重要用( m o t o h a s h ie t a l ，2 0 0 1 ；l e i s t c re t a l ，2 0 0 3 ) 。 囝麓瓣巍窖 拟南芥光系统i ip e 9 2 蛋白酶功能研究 自发现光合作用以来的2 0 0 多年时间里，通过众多科学家从各个角度的细致 认真的研究，人们对光合作用过程有了相当深入的了解。特别是p s i i 反应中心的 快速周转被越来越多的学者所重视，强光破坏p s i i 反应中心复合体蛋白d l ，导 致p s l l 反应中心失活，破坏的d 1 蛋白被降解；与此同时，d l 蛋白从头合成， 新的d 1 蛋白插入缺少d l 蛋白的p s i i 反应中心复合体，形成新的有功能的p s i 反应中心复合体( p r a s i le ta 1 ，1 9 9 2 ：b a r b e ra n da n d e r s s o n1 9 9 2 ；a r oc ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 通过这种修复过程保持光胁迫条件下d 1 蛋白含量的稳定和p s i i 功能的正常 ( z h a n ga n d a r 0 2 0 0 2 ) 。叶绿体内有2 0 0 多种蛋白酶，对于有一些蛋白酶已经被 证实参与了d 1 蛋白周转，但是其作用机制仍不清楚。 1 、p s i i 的结构及其功能 随着色素蛋白复合物的分离纯化技术的不断完善，迄今已发现组成p s i i 复 合体的蛋白有2 0 多种，多数属于跨膜蛋自。关于这些组分和辅助因子的结构， 功能已有详尽的报告( h a n k a m e r a n d b a r b e r1 9 9 7 ，b a r b e r e t a l ，1 9 9 7 ，r h e e 2 0 0 1 ) 。 组成p s i i 复合体的蛋白分为p s i i 核心( 包括d 1 ，d 2 和c y t b 5 5 9 ) ，核心天线 ( 包括c p 4 3 和c p 4 7 ) ，外周天线( 主要是l h c i i 复合体) 和放氧复合体外周 蛋白( 3 3 k d a , 2 3 k d a 和1 7 k d a ) 以及其它的小分子蛋白，它们可能的空间排布如 图2 ： 图2p s i i 亚基组成( 引自y a m a m o t o ，p l a n tc e l lp h y s i o l2 0 0 1 ) f i 9 2 0 r g a n i z a t i o n o f p s i is u b u n i t s ( f r o m y a m a m o t o , p l a n t c e l l p h y s i o l 2 0 0 1 ) 6 囝麓辩囊寥 拟南芥光系统i id e 9 2 蛋白酶功能研究 p s i i 是执行光诱导电荷分离和电子传递的基本单位( 图2 ) ，所有与这个 过程相关的辅助因子都与p s i i 的核心d 1 d 2 蛋白密切相关。在这个总反应中， p s i 可以看成是一个h 2 0 - p q 氧化还原酶，通过p s i i 的作用，h 2 0 氧化裂解， 释放0 2 ，质醌被还原成还原性的质醌( c r i t c h l e y ，1 9 9 5 ) 推动此反应的原初动力 是太阳光能，光能主要由外周天线中的c h l a ，c h l b ( 每个反应中心与大约2 5 0 个 c h l 分子相联系) 和类胡萝卜素等色素分子吸收，通过c p 4 3 和c p 4 7 传递给p s i 反应中心的色素分子p 6 8 0 。形成激发态的p 6 8 0 ，然后激发态的p 6 8 0 释放一个 高能电子给p h e o ，形成p 6 8 0 + p h e o 偶级对。p 6 8 0 + 是p s i i 反应中心最主要的氧 化还原组分，每个p 6 s 0 + 都能接受一个来自d 1 蛋白上t y r l 6 1 的电子，自身重 新被还原为p 6 8 0 。这样在光能的推动下，p s i i 通过p 6 8 0 。- p 6 8 0 p 6 8 0 + 的反复 循环，不断的接受d 1 t y r l 6 1 残基上的电子。当d i t y r l 6 1 把一个电子递给 p 6 8 0 + 后，它又可通过4 个m n 原子组成的锰簇从h 2 0 分子获得电子，使h 2 0 氧 化释放出0 2 。电子被p 6 8 0 + 接受后通过下一轮电荷分离将电子传递下去。p h e o 接 受电子后，把它递给d 2 蛋白紧密结合的初级电子受体质醌分子q a ，q a 再把 电子传递给结合在d 1 蛋白上的次级电子受体质醌分子q b 。这个过程需要一个 位于q a 和q 8 之间的非血红素铁的参与。q b 从q a 处连续接受两个来自h 2 0 的电子以后结合两个来自叶绿体间质的质子，并被质体醌( p q ) 从反应中心替 换下来，本身成为p q h 2 ( h a n k a m e r e t a l ，1 9 9 7 ) 。还原的p q h 2 可以转移到类 囊体的内腔，在氧化时向铁硫中心( f e s r ) 传递电子，并释放矿到类囊体腔 内。跨类囊体膜的p h 剃度( p h ) 伴随着电子传递形成。从h 2 0 分子释放的 矿和p q h 2 氧化时跨膜运输的i - i + 对a p h 的建立都有贡献。在相关辅助因子的 配合下，p s i i 通过产生强氧化态的p 6 8 0 + 把h 2 0 的电子提取出来，释放出质子 和氧气。p s i i 的这种功能为自然界中几乎所有生物的生存提供了所需要的氧气， 并为有机化合物合成所需要的同化力的形成奠定基础。 1 1p s i i 反应中心 所有高等植物的p s i 反应中心都含有两个蛋白d 1 ( 3 2k d a ) 和d 2 ( 3 4k d a ) ， 细胞色素b 5 5 9 ，以及p s b i 组成。d l 、d 2 蛋白分别由叶绿体基因p s b a 和筇6 d 编码。高等植物的d i ，d 2 蛋白和光合细菌的l ，m 亚基大约只有1 5 的同源性， 但是这些保守的氨基酸残基主要是光化学活性辅助因子( 如锰簇，去镁叶绿素分 囝麓檄文害 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 子( p h e o p h y t i n ，p h e o ) ，q a 和q b 等) 的结合部位，因此它们的许多光合特性与 紫色光合细菌的l ，m 亚基非常相似( m i c h e l a n d d e i f e n h o f e r , 1 9 8 8 ，s h a r m a e t a l ， 1 9 9 7 ) ，是原初光化学反应及其推动电子传递的相关部位。d 1 和i ) 2 蛋白本身 也有很多相似性( m i c h e la n dd e i f e n h o f e r ，1 9 8 8 ) ，在高等植物的不同种间，这 两个蛋白的氨基酸序列的差异都非常小，它们的n 端都可被可逆磷酸化，均含 有5 个跨膜a - 螺旋。其n 端暴露于间质，c 端位于类囊体内腔( m i c h e le t a ，1 9 8 8 ) ， 两者可形成一个二维对称的异二聚体。 用定点突变的方法研究表明，p s i 电子传递中具有氧化还原性质的两个酪氨 酸组分y z 和y d 分别在d 1 和d 2 蛋白上( d e b l 】se t a l ，1 9 8 8 ) 。这两个组分及 结合于d l 和d 2 蛋白上的辅助因子在类囊体膜上的分布是不同的。锰簇，y z 和 y d 位于类囊体内腔侧，反应中心叶绿素分子p 6 8 0 和去镁叶绿素( p h e o p h y t i n ) 位于类囊体膜中间，而q a 和q b 则位于类囊体膜外的间质侧，因此反应中心的 电荷分离和电子传递是跨类囊体膜进行的。 细胞色素b 5 5 9 是一个与反应中心紧密结合的血红素蛋白。它含有分子量为 9 k d a ( 含8 3 个氨基酸) 的c t 亚基和4k d a ( 含3 9 个氨基酸) 的p 亚基，分别由 叶绿体基因p s b e 和p s b v 编码。这两个亚基中的2 5 - 2 6 个氨基酸组成疏水区，可 用形成跨膜结构( s t e w a r ta n db r u d v i g , 1 9 9 8 ) ，而且其羧基端都定位于类囊体膜腔 侧，与p s i i 反应中心紧密相连。p s i i 中细胞色素b 5 5 9 的数目还有争议，但已有 许多证据表明，每一个反应中心只要缺失p s b e 或p s b f 的突变体不能形成p s i i 复合物，说明细胞色素b 5 5 9 对于维持p s i i 结构非常重要( p a k r a s ie ta 1 ，1 9 9 0 ； 1 9 9 1 ) 。细胞色素b 5 5 9 在植物体内有两种氧化还原形式，高电位和低电位。两 种电位形式之间的转换可能涉及强光下的保护机制和围绕p s i i 的循环电子流 ( t h o m p s o na n db r u d v i g ，1 9 8 8 ；n e d b a la n dw i t m a r s h ，1 9 9 2 ；b a r b e ra n dd el a s r i v a s ，1 9 9 3 ；w h i m l a r s he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 p s b i 是叶绿体基因编码的跨膜小分子量蛋白，也与d 1 d 2 的异二聚体紧密 结合。蛋白交联分析表明与d ，p s b i2 和p s b e 靠近 1 2 核心天线蛋白c p 4 3 和c p 4 7 在高等植物中，c p 4 3 和c p 4 7 是p s i i 中最大的亚基，分别由p s b b 和p s b c 编码的4 3 和4 7 k d a 蛋白。两者都比较保守，在高等植物中同源性很高( v e r m a a s 8 囝麓瓣磊害 拟南芥光系统i id e 9 2 蛋白酶功能研究 d a 1 9 8 7 ) 。c p 4 3 和c p 4 7 都是c h l a 结合蛋白，每个c p 4 7 结合1 6 个叶绿素 a ( c h l a ) ，c p 4 3 结合1 4 ( c h l a ) ( b i e s i a d k ae t a 。2 0 0 4 ) 。c p 4 3 和c p 4 7 与p s i i 反应中心d 1 ，d 2 紧密结合在一起，其中c p 4 3 与d 1 靠近，c p 4 7 与d 2 蛋白靠近( b r i c k e r 和g h a n o t a k i s ，1 9 9 6 ) ，接受捕光天线l h c i i 复合物捕获的 光能，传递给反应中心，引起原初电荷分离。亲水性分析表明，c p 4 3 和c p 4 7 都 含有六个跨膜螺旋和五段分别位于基质侧和囊腔侧的亲水环，它们的n 端和c 端都位于类囊体问质侧，第五和第六螺旋之间在类囊体腔内形成一个大环。蛋白 交联和免疫标记实验证明，c p 4 7 的大环和3 3k d a 蛋白紧密结合，对保持p s i i 放氧活力具有重要作用( b r i c k e ra n dg h a n o t a k i s1 9 9 6 ) 。并经p s b b 基因突变 体研究表明，c p 4 7 不仅对整个p s i i 复合体组装和功能具重要作用，而且是植物 光自养生长所必需的( v e r m a a se ta 1 。1 9 8 6 ；1 9 8 8 ) 。c p 4 3 和反应中心的结合相 对于c p 4 7 来说比较松散，去垢剂处理和胁迫条件下，c p 4 3 容易从p s i i 核心复 合物中脱离出来。另外在高等植物中，c p 4 3 蛋白n 端的t h r 可以被磷酸化修饰 ( m i c h e le l 甜，1 9 8 8 ) ，而c p 4 7 蛋白n 端的t h r 则不能被磷酸化。突变体研究 表明，c p 4 3 在维持水的氧化裂解过程中有重要作用( v i t r ye ta ，1 9 8 9 ，r s g n e r 甜a ，1 9 9 1 ，c a r p e n t e re t a l ，1 9 9 3 ) ，缺失c p 4 3 的突变体，可以进行正常的p s i i 复合体组装，电子从o 卜t y r l 6 1 到q a 的传递可以正常进行，但却不能进行氧气 的释放。 1 3 放氧复合体( o e c ) p s i i 的一个重要作用就是裂解水释放氧气。水裂解发生的部位在p s i i 近囊 腔侧的放氧复合体( o x y g e n - e v o l v i n gc o m p l e x ，o e c ) 。四个锰原子组成的锰 簇是水裂解的反应中心。在高等植物中，p s i i 的囊腔侧结合有三个表观分子量分 别为3 3 ，2 3 和1 7k d a 的外周蛋白，分别由核基因p s b o 和, p s b p 和p s b q 编码。 这三个蛋白组成的放氧复合体和p s i i 的锰簇紧密结合协助维持放氧。3 3k d a 蛋 白又被称为m n 稳定蛋白( m s p ) ，它的存在对于2 3 和1 7 k d a 蛋白结合在p s 中是必需的，并可能起着维持y d 周围合适的微环境作用，使其免受疏水性小分 子的影响( l ie t a l ，1 9 9 7 ) 。近期的研究结果表明在a r a b i d o p s 妇t h a n l i a n a 中存在 两个p s b o 基因分别编码p s b 0 1 和p s b 0 2 ( t h o m a s 等2 0 0 0 ) ，两者基本结构相似， 仅有1 1 处氨基酸残基不同，但在野生型中，p s b 0 1 是主要的存在形式( m t u a k a m i 9 囝舡文掌 拟南芥光系统i id e 簖蛋白酶功能研究 e ta l ，2 0 0 5 ) 。应用远紫外c d 和f t i r 光谱分析，l y d a k i s - s i m a n t i r i se ta 1 ，( 1 9 9 9 ) 证实m s p 是一个热稳定的，天然未折叠的多肽，其二级结构中的a 螺旋较少 ( 5 ) ，而b 折叠却很多( 3 8 ) ( z h a n ge t a l ，1 9 9 6 ) 。在溶液中3 3 k d a 蛋白 的结构具有很强的柔性( r u a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 和可变性( e n a m ic ta l ，1 9 9 8 ，h u t c h i s o n 甜a 1 ，1 9 9 8 ) ，这可能和其与膜结合的特性以及在放氧反应中的特殊作用有关。 早期研究曾认为3 3 k d a 蛋白可能直接参与b i n 或c a 2 + 的直接结合，但更多研究 表明3 3 k d a 蛋白脱离后，m n 簇仍可完整结合在膜上，p s i i 也可以保持少量放氧 活力。和用r n a i 技术对拟南芥p s b o 基因干涉后，发现了p s b o 蛋白表达很低 的突变体不能进行光合自养，并且q a 与放氧复合物s 2 态的重组受到抑制，而且 光系统反应中心各亚基含量大大降低( y i 甜a 1 ，2 0 0 5 ) 。可见p s b o 蛋白对维 持放氧复合物的结构和最大放氧活性有重要的调节作用。 p s b p p s b q 是p s i i 两个外周蛋白，分别由p s b p 和p s b q 编码的2 3 和1 7 k d a 蛋白。衣藻中p s b o ，p s b p ，v s b q 可以单独结合到p s h 上，而在高等植物中，p s b p 必须通过p s b o ，p s b q 才可以结合到p s i i 上( t h o r n t o ne ta 1 。2 0 0 4 ) 。s p i n a c h 中2 3 和1 7 k d a 蛋白全链分别包含1 8 6 和1 4 9 个氨基酸残基。实验表明，p s b p 和v s b q 也是放氧所必须的。2 3 k d a 蛋白有个c a 2 + 结合位点，它可以影响c a 的结合动力学，它使p s i i 能在缺c a 2 + 和c l 的环境下放氧，起到c a 2 + ；y 阳c 1 。浓缩 器的作用( m u r a t a a n d m i y a o1 9 8 5 ) 。1 7 k d a 蛋白位于m s p 和锰簇附近，在c i - 与p s i i 的结合上起重要作用。它们为水的氧化提供最合适的c a 2 + 和c l 。浓度 ( d e b u s1 9 9 2 ) 。 另外，在高等植物中还有一个由核基因编码的小分子蛋白p s b r ，可能作为 组装的分子伴侣对放氧复合物的组装起着重要的作用( s u o r s ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。利 用拟南芥突变体研究发现，缺失p s b r 蛋白的突变体其放氧活性大大降低，弱光 条件下，放氧活性更低。 1 4 小分子蛋白 过去通过生化分离对p s i i 复合物亚基组成已基本了解，并利用分子生物学， 生物化学等手段对其功能进行了研究。近些年来，随着分离纯化技术的发展结合 质谱等手段，关于p s i i 复合体结构方面的信息迅速增加。发现p s i i 中还含有一 些新的组分，如小分子蛋白。它们的分子量都在1 0 k d a 以下，构成数量上占p s i 园蔫鹕巍害 拟南芥光系统i id e 蛸蛋白酶功能研究 复合体5 0 以上( o o m e z e ta 1 ，2 0 0 2 ； k a s h i n oe ta 1 ，2 0 0 2 ) ，它们从p s i i 复合体 的核心到外周都有分布( i j a n k a m e re t 甜，2 0 0 1 ) 。 目前所得到的这些小分子蛋白除了p s b e 和p s b f 结合有辅助因子，其余小分子 蛋白都没有发现结合还原性辅助因子或色素，因此它们不大可能直接参与光合电 子传递。综合已有结果，似乎大多数小分子蛋白如：p s b e f 、p s b h 、p s b i 、p s b j 、 p s b k 、p s b l 、p s b w 和p s b z ，都对p s i i 的组装、稳定性和二聚体化起着重要的作用 ( s h il xa n ds c h r o d e rw p 2 0 0 4 ) 。 1 5 外周天线蛋白复合物l h c i i p s i i 周围紧密结合着六个核基因编码的叶绿素结合蛋白( l h c b l 一6 ) ，他 们组成了捕光复合体( l h c i i ) 。在植物类囊体中，l h c b 占总蛋白和叶绿素含量 的一半，是植物进行光合作用的主要能量捕获者。l h c i i 的组分是由核基因l h c b 色素蛋白复合体家族( l h c b ) ，并认为l h c i i 主要由六种色素蛋白复合体组成。它 们是分别由l h c b l 、l h c b 2 、l h c b 3 、l h e b 4 、l h c b 5 、l h c b 6 基因编码的蛋白 l h c b l 、l h c b 2 、l h c b 3 、l h c b 4 、l h c b 5 和l h c b 6 。其中由l h c b l 、l h c b 2 和 l h c b 3 组成大量l h c i i ，由l h c b 4 ( c p 2 9 或l h c i i a ) 、l h c b 5 ( c p 2 6 或l h c i i c ) 和l h c b 6 ( c p 2 4 或l h c i i d ) 组成微量l h c i i 。在高等植物中，l h c i i 天然生理状 态主要是以三聚体形式存在的( d r e y f u s sa n dt h o r n b e r1 9 9 4 ) 。h o b e 等人证 明，其中l h c i i 的1 6 到2 1 个氨基酸残基肽段与三聚体形成有关( n o b ese ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。其中每个l h c i i 单体含有1 2 个叶绿素分子，即7 个c h l a ，5 c h l b ，2 个类胡萝h 素分子和2 个叶黄素分子组成。它在类囊体膜中除了进行光能的吸收 和传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能在p s i 和p s i i 之间的分配， 光保护以及各种环境的适应过程中起着重要的作用。 2 、p s i i 光抑制 光作为光合作用的能量来源是植物生长的必要因素，但它也是植物生长的 重要限制因子之一。但是过强的光会抑制光合作用的进行，导致光合速率的下降 甚至引起光合机构的光氧化损伤。所以，人们将这种光合机构所吸收的光能超过 光合作用本身所能利用的能量而引起光合作用速率下降的现象称为光合作用的 光抑制( p o w l e s1 9 8 4 ) 。 鹄娥巍李 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 当光强太高或持续时间过长，特别是有其它胁迫因素同时存在时，叶片的 光合机构就会遭到破坏，这种光抑制主要发生在p s i i ，主要是由于复合体中电子 传递受阻，导致p s i i 的可逆性失活，如果这种损伤得不到缓解，就会进一步造 成p s i i 反应中心蛋白可逆的损坏( c r i t c h l e y1 9 8 8b a r b e ra n da n d e r s s o n1 9 9 2 ； p r a s i le ta 1 1 9 9 2 ) 。p s i i 的功能降低甚至丧失，如不能进行有效的电荷分离， 减少放氧，p s i i 的最大光化学效率f v f m 降低等。 在长期的进化过程中，植物体形成了一系列的适应机制，以利于将强光伤 害减少到最低限度。许多研究表明，除了一些形态上的适应机制外，在光合机构 内也存在多种保护其免受强光破坏的生物物理和生物化学机制。从而使植物在自 然界能够灵活的应付各种复杂多变的光胁迫，如减少光吸收、提高光合能力、过 剩光能的热耗散、光呼吸、清除活性氧及反应中心的修复。 早在本世纪初，光抑制现象就已引起人们的注意。目前，光抑制的研究已 成为光合作用研究中的一个热点。 2 1 p s i i 的两种光破坏 p s i i 的不可逆破坏往往是在强光下发生的。至少有两种途径，分别为受体 侧和供体侧引起的破坏( a r oe ta 1 ，1 9 9 3 ，o h a de ta 1 ，2 0 0 0 ，a n d e r s s o na n da r o 2 0 0 1 ) 。在长时间的强光照射下，光破坏起始于原始醌受体的不断还原。受体 侧引起的光破坏是由于受体侧电子传递受阻。q a 的电子不能足够快的传递给 q b 。导致q a 再接受一个电子，形成q a 2 - 。q a 2 的存在，导致p 6 8 0 + 和电子重 新结合，产生三线激发态p 6 8 0 ，它和0 2 反应产生单线激发态氧，单线激发态 氧能够破坏p s i i 反应中心复合体，在光抑制过程中，有典型的受体侧光破坏产 生的d 1 蛋白片段存在于植物体内，如p 6 8 0 的强氧化作用或单线态氧的破坏， 使d l 蛋白的d e 环结构发生有利于蛋白酶识别的变化，进而使d 1 蛋白降解( a r o 甜a 1 ，1 9 9 3 ，a n d e r s o ne t a l ，1 9 9 8 ) 支持关于植物体内发生起源于p s i i 受体侧光 破坏的观点。 供体侧光破坏主要是由于供体侧电子传递受阻，p 6 8 0 + 的寿命加长。p 6 8 0 + 是具有高氧化还原电位( 超过+ 1 v ) 的残基，能从周围夺取电子，引起蛋白或色 素的氧化破坏。这个过程在有氧和无氧的条件下都能发生。目前，还没有植物体 内发生供体侧光破坏的直接物证据，但j a m e sb a r b e r 等人利用p s i i 中心复合物 o 篱嬲文害 拟南芥光系统i id e 醇蛋白酶功能研究 已经证实了供体侧受到光抑制引起d 1 蛋白快速周转动证据。可以肯定，旦植 物体内供体侧电子传递受阻，p s i i 对光更加敏感，光对p s i i 的破坏也会更加迅 速。这种情况可能在类囊体腔内p h 值很低，或高温，低温引起的