（物理化学专业论文）自组装抗体膜igg免疫传感器的研究.pdf

学位论文独创性声明 6 9 0 7 l l 本人声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行的研究工作 及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人 和其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启示和所做的 贡献均已在论文中作出了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：日期 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 既学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文 被查阅或借阅，本人授权辽宁师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书。 学位论文作者签名： 签字目期： 导师签名： 签字日期： 白纰装机休膜l g g 免疫传感器的研究 自组装抗体膜l g g 免疫传感器的研究 研究生辛军华 指导教师冯秤梁教授 专q k ：物理化学 方向：生物传感器 摘要： 州f 】组装单分r 膜( s a l s ) 技术在金片、银丝、金甜等小同的基底上定j g g 抗体， 分别制箭j l h 化j q 无标记l g g 免疫传感器。其中，以金丝为基底制箭的免艘传感器最父敏、 最稳定。 刺以金皇皇为基底制备的免疫传感器进彳j ：了如r _ 三力向的研究。 i 分别s h ( c i i ：) ，, c o o h 雨ie g 6 0 c l l ：c o o h 两种硫薛l 州定抗体制备免疫传感器。其巾 川e g 6 0 c t t ! c 0 0 1 1 制备的免疫传感器埘tg ( ：的响应时间为8m i n ：列 9 6 的测艟范俐为o 0 4 05 0n g m l 。：棚天系数为0 9 9 8 6 ：榆测r 限小r0 0 4n gi n i ，。j tjs h ( c i i 、) w c 0 0 1 1 制符 的免疫传感器对i 酮的响应叫。问为7m i n ，测址范h 司为0 1 0 0 4 0n g m l ，相火系数j i j 0 9 9 8 2 ；检洲r 限小丁0 j 0n g m l 。通过比较可以得 n ，川e ( ；6 0 c i i ! c o o h 制备的免疫1 感器要优_ r 川s i t ( c t ：) m c o o b l 制蒉的免疫传感器。 2 相：小同濡度, f i l 酸度条什r ，研究免疫传感器对 g g 的响麻情况。实验结粜农叫， 在4 0 。c ，p h - 74 条4 1 ：t t t je g 6 0 c h ：c 0 0 1 1 制祷的免疫传感器对 g g 的响庸较好：卉：3 5 ， p t t = 5 ，5 条什r j js i ! ( c h ! ) 。c 0 0 1 t 制籍的免疫传感器对1 9 6 的响应较扑。 3 川循环伏安法对金l u 极表面的白纠装单分r - 膜进行表征，实验果表明陔层膜址尢 “针孔缺陷”的。同时对抗体膜也做r 定性表征。 对以银丝为琏底制矫的免疫传感器进行丁如r 两方而的研究。 1 研究濉度剃酸度对该免疫传感器的影响。实验绱粜表叶j ，在4 0 ，p i l = 5 5 条什f 该免疫传感器对i g g 的响戍较好。 2 研究浚l 毡极的重复使川。 最肝论文还剥也位j w 无标记i g g 免疫传感器的响应机理进行r 艘沦分析。 哭键词 1 绸装单分一f n免疫传感器抗体抗j r , g g 免疫球篮l 1 闩纰裂抗休膜l g g 免疫传感器的究 1 前言 随着牛产力的高艘发展利物质文f ! f ：j 的小断提高，在i ：农业生产，环境保护，临床检验 以及食i - i li ：业等领域，每时每刻都有人越的样品需要分析用l 检验，m jh 往诬要求住很始 f 门 时问内完戒样晶检测，订的甚至要求进行相：线或活体内白：接测定，牛物传感器l l 足适成j 这一要求而发展起米的。 1 1 生物传感器 1 1 1 ，t 物传感器的简介 ! l - 私j j 传感器( b o s ；e n s o r ) 州被j h 泛地州1 ：描述类川以峪控! i i 命体系或4 j 2 _ 丰父 联的生物基元的器什。l u p a c 委员会将b i o s e n s o r 这一术语保留给类。j 儿仃，t 物活m 杓 酶、抗体、核酸、微中物、及细胞譬相鲇台的传感器新构掣。这一决定通过如c h e m a h s 等数据库的粗略榆索即可被认l 叫。b i o s e n s o r 被定义为通过j ：m 入或简单绌合的途径将q 物 的域由其派生的敏感基元与理化换能器 合柏：一起的小型分析器r l 。生物传感器的- 舭h 标则匙川以产一二l j ：比r 单一被分析物或! ，被分析物栩戈丝团的离散域近续的数7 l 也f 信 号。它地一j 由生物，化学，物理，医学，l br 技术等多种学科儿相渗透成k 起米| j l j 新 学科，这种交义学科矗：理论上和技术i ：均有许多新的问题要进行探索删j 1 ：发。m 物化感器 具有选择性高，分析速度快，操作简易年仪器价格低廉等特点，而m ，j _ 以进行 ：线j 体分 析，此引起世抖栉围的极人笑注。 国际【从8 0 年代起刘生物传感器进行了广泛的删f 究羊探索。近1 0 年多米已经i i 】| = 制 系列扫：环境榆测，临床检验和生化分析笛方面彳丁实川价值的生物传怂器，- - r 以测定糖类、 订机酸、氨基酸、蛋自质、抗原、抗体、d n a 、激素、生化需氧姑以及襞些敛煽物质笛。 辟箭到| | 前为忆真l 【墒r l 化的生物传感器为数不多，仳其删f 究刊开发的势头很人，+ 1 14 d 1 i 久的将来定会：i i ) f 制山更多有川的，卜物传感器。 1 9 6 2 年c ia r k 在氧i u 极的基础上提 u 了u 制葡萄糖酶传感器的砹讨原圳，1 9 6 7 午 u p d k o 研制小i l l ：界上第支葡萄糖传感器，这町称为第一代生物传感器。其厉逐步发腱 小组织、微! i 二物、免疫、酶免疫平细胞等传感器，称为第一代生物传感器。筇- 4 q - 物传 感器是将生物坎术，f 1 1 集成l l l 路技术结台起来，研制成场效应乍物传感器。现曲。虹_ _ r 将生物 传感器和流动注射分析i 【乜腑技术午h 结台，颅汁将发挥哑人的作川。 2 自身【装执4 本膜i g a 免疫传感器的研究 1 1 2 生物传感器的原理” 无沦是基r l 土化学、光。学、热学或压电晶体等不问类) 弘的生物传悠器，其探三【：均n 1 埘 个土要部分纽成， 灶感应器，它足m 对坎测定的物赝( 底物) r 1 y j - 离选择性分f 别j j 能的膜构成。 ：是转换器，它能把膜 二进行的r 化反麻中消耗或生成的化学物质，或j ”r 的毙，热臀转变为l 乜信号，蛀后把所得的i 乜信号经过l u ，技本的处弹后，在仪器l i 小或 记录f 米。其组成i ，形象地示_ 蚓1 - ，。 夸物传戆肄 厂”。- ；一 敞测物臼 舒 糕菇 p 国 弧慰季鼋挺 电予岱c 潞 冠棒 元挣 蹦】生物传感器的组成示意削 1 1 2 。】生物功能物质霸1 分，识别 分子弘w 4 是分了之间的一种独特的功能。我制称r t 仃识别能力的口j 物分f 为! f ：物功能 物质。例如葡萄精氧化酶能从多种分f 的混合溶液中，高选样性地勘 别山铺钧糖，汗扑：它 迅速地氧化为葡萄糖酸内酯。这种葡萄糖氧化酶即称为生物功能物质。剑| 1 i m 为i ，已经 发现的jl 有分f 识刖能力的生物分r 有酶，抗原羽j 抗体，站合蛋白质，植物凝血豢雨j 激袭 受体等。更广义地说，微生物也町以认为是1 种生物功能物质，叫为。e ； f f j i - f e j - ! = 铂商选扦 性地旧化f 搬墩) 桀# 特定有机化台物的能力。如芸苔丝孢酵坶可以同化乙酸，w 此j 以 川术制备乙酸传感器。 叶：物功8 物质能够识划桕席的牛物分f ，具彳j 微高的选择 ! ! ! 。犹如铡匙利锁的父系 样，把钥匙只能打开一把锁。冈此所制备n 勺牛物传感器州样贝有很高的选择性，可以从 不经 j ；f 处理的样r 铺。p + 赢接测定出欲测的物质。 3 门f l l 袈抗 丰膜l g g 免摧传感器的州究 j 1 2 2 生物功能物质的刖定化 将具仃分f 识j ；i j 能力的生物功能物质，如酶、抗蟓、抗体等，包藏或吸附j + 柴j 商分 f 利料，l 物高分f 或无机材$ ： 。盘i j 分子筛内制冬成感臆器，这称为! i ：物功能物质的j 州定 化；，这是叶：物传感器的研究和开发中最为m 要的i 。稍：。为了研制廉价，灾敏皮高，选择盹 好列寿命k 的! 物传感器，i 州定化投术已成为干廿：抖各国竟相研究雨l 探索的 | 士，j ；。经过近 2 0 年的小断1 i 作，已经建立了对符种不蜘的分f i 功能物质的1 州定化方法，人破f j 以r 儿 种方法。 ( 1 ) 随接化学结合法 将l 也极表先经过化学处理战修饰，然j 亓将q ! 物功能物质以b 价，离r 或雕何等力一 结合州定1 l 乜极表而。例如在i j 澳化氰处理过的一氧化钛i b 极表面川定抗原或抗体，以制 器免j l = 传感器。 ( 2 ) 架桥化定法 川多功能的试剂，如戊二醛与酶蛋r 1 分子相互结合，赳着桥梁的佧川，从肺使醣川定 丁i u 极农向。返是酶定化州得比较多的方法。 ( 3 ) 。高分。二载体包州法 将乍物功能物质1o 台成高分予n a f o n 城叶i 物痢分子趁索蛋闩经济刹混合j 使酶包蚶! 丁其中，制箭成具彳丁酶征性的感应脱，再把它覆盖刨转换器即1 u 极的表断，构成生物传感 器。 ( 4 ) 高分，麒吸刚法 先也极表而 ：修饰一层合成高分n 戍生物高分r ，然肝将生物功能物质吸i ；f j 到l 锸分 子麒上，制箍成感施腆，再转换器结合，构成传感器。 ( 5 ) i i l 聚合高分子包埋法 将牡体雨j 中物功能物质同时混合丁l u 解液内，通i u 使单体在l _ l 极农腼i 也聚合成苛分 子，j 此i 叫时可以将酶包螂j 高分子膜内亢接闷定1 ：l 乜极表i 嘶，构成q ! 物传感器。 ( 6 ) _ ：6 二机村判吸附结余法 利h j 无机材料如分_ f 筛或氯化钒等f | 】强烈的吸附特性，以此作为载体。先将分于筛川 聚乙烯解凋制后l 叫定1 ：电极表面，然厉使q ：物功能物质吸跗捌定j 分子筛膜山，即u f 构成 生物传感器。 ( 7 ) 分f f | 绸装州定法 狂单品金【u 极表面，先修饰一层硫醇类化合物，这是通过分r i 闸的引力进行n 细裴构 4 口钆【驶抗体膜i “j 免疫传感器的研究 成的单分f - j ，然后阿通过门组装疗法将媒介体雨i 酶。层j z 地修饰j ：l b 板h 构成传感 器。 ( 8 ) 碳糊川定法 将酶川1 l 蜡油等溶剂调匀，洱加入i i 墨粉凋制成糊状物，填充j 玻嫡管内制祷成碳删 l u 极。 1 1 2 3 信号转换 在感应器即具竹生物功能活蜘：的脱内发生的生化反应扎必然会消托或产，1 一一些化 物质，或荷，二一f i 热和光等，这些变化部o z ；i j l 允转变为电信号，然后经过【u 子技术的处理后 才能从仪表l ：显示或记录f 米。i - = 1i j 在生物传感器巾研究得最多的为l u 化学m 物传感器。 它的转换器主要钉i u 流型和电位刑两类。 ( j ) i u 流j 传感器 川氧化酶制箭y i j f # 感器人多为l u 流酗。如葡萄糖传感器它的感臆器址禽订筒恂帮镟 化酶的膜，面转换器是氧电极。当传感器插入待测溶液中f 吼溶液r ，的溶解氧羽l 待测底物 悄萄糖将l , j l l q - 渗入感府器酶膜。葡萄糖遇到酶，) 1 育氧存d i n j l - 便一印催化氧化为筒胡靴i 4 艏，唧时消耗钒气而产! i _ 过氧化氧。这时转换器氧也极即测出氧n 勺还坂l h 流的l - 降，从r 降 l ( j l 嘧度，i lj _ 以求小葡钧精的浓度。 ( 2 ) 。i u 纰j p 传感器 川脱氨酶或脱羟酶制备的传感器人多属j 电位小传感器。t ；l i 球袭传感器，它的感府| f 是食确默黔的_ | ；! ，而转换器姓一平面p h 玻填l 也拔。酶膜足蝼贴n ：透氮或透：氧化碳似l i 再覆盖以：玻璃i 也极h 构成生物传感器。当棘索渗入感应器而遇剑脲脯洲，- u 被分俐山 氦，这种新牛的氮通过透氨膜剑达p hl 乜极的表面，引起玻璃膜i u f 口的变化，从i ，hi 川n 勺 幅度，可以求h l 原素的浓度。 i l j ：如l j 抗粥或抗体制器免疫传感器，也是电位础传感；! 。将绒毛麒促r f 腺激袭的抗体 川化。誓i i 合法制定j ：经澳化氰处理过的、氧化钛l u 极的表向，构成生物传感器。原理址抗 原或抗体本身都带= f = l l l 缄负l u 荷，当抗原遇到抗体时，就血即发生1 台反戍，而使i u 州。 中和，从i n i 引起l u 他的变化，指示抗原或抗体的浓度。 1 1 3q i 物传感器的分类。” 其分类有多种，为r 办便起见，我们从构成生物传感器的两部分入r 。 i 1 3 1 根据生物传感器感应器 的敏感物质分类 5 臼盟i 裂机体膜i g g 免疫传感器的研究 牛物传感器的感应器所川的敏感物质订酶、微生物、动植物纠织、细胞器、抗原嗣i 抗 体等。根据所川的敏感物质呵将牛物传感器分为酶传感器、微，f ：物传感器、纰纵传感器、 细胞馋感器、免搜传感器等。 1 1 3 2 擞据牛物传感器的信号转换器分类 q ：物传感器的信口转换器f i ：l u 化学l u 搬、离子敏场效戍品体饽、热敏l 乜m 、光l u 4 换器、s a w 装髓等。据此义将生物传感器分为i 乜化学生物传感器、r 导体生物传感器、删 热】蝉生物传感器、测光刑生物传感器、测j ：j 型生物传感器等。 以l 两种分类方法之问还可相交义，闪而：物传感器的类别就更加增多，例如酶传 感器义分为鹏t u 极、酶热域l 也m 、酶f e t 、酶光极等。为醒目起地，现将，f ：物传感器的分 类1 ij 。h2t h 曩 耋叠、：按蛾感材料分类拧挚识努j 郝努信譬转换部势抟俄蟹转娩嚣分爨 攀；攀蒸茹“蛘f 。l 磊i ；霜i 。 磊磊纛嘉l 爹爹。? | ；1 j 赫掺瓣潞 一 酶l 也纯举溺定装置一! 一 电化学生物磐爨貉l j ，# 一一，一 二一一。 寨霉糍酬一物扣一! 一 砸霹基l 蒺澄醺到懈蝴h 兰桩餐一垂量词 紧蒸磊；磊4 缎鹣器；热敏毫阻! 。 赢主二磊磊。! 笺誊鎏；竺竺竺”l 一缎鹣器 热敏毫阻掣登竺竺竺竺篓； 霪漤至习一邑一竺堕竺兰一一垂至剁 1 2 电化学免疫传感器 近年来。随荷免疫，r 物学的进展，人们发现了免疫反麻所具有的高度特片性，u j j 抗体 对抗原的特异性识别，其争一性可超过酶对底物的识别水平。这一发现橄人地耕i ：础j 免i i 分车厅的发艇，使其逐渐成为一个跨学科的新型分析技术，并己j 泛府川川台i 眯体液分析、 药物分析、环境分析、食，铺分析利! 物化学研究仉这毖。 j 免疫传感器发挥r 巫, 婴- f i q l 6 臼纰裂抗仆膜i g g 免疫 感器的1 l j i 究 它以其随接而快述的测定而越米越受到霞视。奉文所研制的传感器即为免疫传感器的 种 一l u 化学免牲传感器。它是利h 抗体刘棚廊抗原的识别功能和结合功能将抗体或抗j t 雨l i 化学l u 极组而成的捡测装簧。这种生物传感器信号转换简单，删前而1 2 ： 的介 f ， 因此研究此类传感器的厦点足抗原、抗体的1 州定化，抗原抗体的响鹰原理以及影响抗原、 抗体反府的拙冈袭。 1 2 1f 乜化学免疫传感器的分子以别物质一抗体、抗原 1 2 1l 抗腺 ( 1 ) 定义 抗原是类能够剁激动物机体的免疫系统，绣导发生免疫膨答，广。l ? 体液免疫的抗体， 并在体内外与抗体反应的物质。日前，川免疫原性( j i n m ur o g e n i c y ) 平免疫反应p ： ( m m l i l m r e a c t i v i t y ) 米描述l h 抗原引起的免疫反戍的特性。免疫姊喇：怂j 目抗蟓引起钯 疫戍答( j m r n u n o r e s p o n s e ) 、产生抗体的能力；免疫反麻性义称见疫特异性( a n l ig e n s p e c i f i c i t y ) ，足 抗原，免疫庵咎的，。物一抗体，相i ! _ f = 超反鹰的能j 。既县仃免疫_ ! ! ； 忡 义具有免疫反廊性的物质称为( 完全) 抗原，义称免疫原；仪儿有免艘反应性而缺乏免疫 原性的小分，物质称为、_ 抗原( h u p t , e n ) ( 2 ) 抗原的分炎 根据抗原f 米源萃制符方法，通常将抗原分为- 类：夫然抗原、人i ：抗原 lj 合成抗坛。 大然扰原楚指c 1 然界存在的细凶、病毒、篮闩质、多糖j 手l 悖 台蛋白；人i 抗原地十r 迎过人 一合成的方法。将、卜抗原( j f 机，j 、分子) 结合剑坐期质上形成鲫完全抗蟓；合成抗j l 划指 人i ：合成的多肚类抗原。 ( ： ) 影响免疫原性的i 土1 素 a ，片物性 实验结果走删，动物种属关系越远，其化学纲成年l l 鳃纵结构差别越人，则免疫原性越 强。例如鸡卵消蛋门对家禽是弱免疫原，而刑家兔则是一种强免疫坂。 b 分r 人小 般说术，抗原为人分r 物质。分r j ：越人，其免疫原性越强。抗原，抗体的结构1 i 。 相对分子质鼙人r1 0 。的甾向矮才是较强的免疫原。相对分f 质艟小j 1 0 1 帕物质通常怂 弱的免疫躲。a 协s s i 等人l j 不列k 度的2 ，4 - - l t t 接苯( d n p ) 一寡聚糊氨酸做实验，绌粜 表明，婴求多肽分f 人数足八个以j 二氨赫酸残苍。杠：犬然多肽中，能1 j i 起免疫心符的最小 7 门灿杖抗体膜i g g 免疫传感器的 f ；| f 究 分，是升由糖豢，其枷删分子质茸为：f 4 8 0 。 c 化学组成和结构 抗厥除篮求人的分f i d ：外，还必颈仃一定的化学纠成羽j 绌构( 也把化。基川剐构象) 。 相对分r 质越愈人，结构愈复杂的j 溶性蛋白质，其免嫂原性就会愈灶。如纤维裘、糖原 等，虫i 赴高分子蛙的物质，彳u 卸无免疫坂性，而杂多精却订免疫原性。许多抗坂分r ， 易受酶、加热、辐! ：| 、j 及化学试剂的影响，导致立体结构的政变，从而是抗原的免疫原性改 变。堂n 质变性后免疫嫩性会人人降低。 d 物理状态 球形篮n 比线性蚩自免疫缎性姒：凝聚颗粒状抗原比溶解的抗原免疫原惟强。 ( 1 ) 影响免疫反应性的闪桑 m ；尖定簇 抗原分f 表的菜些化学基啪称为抗原决定簇。它d 接决定免疫化。学反应的特异。r 卜。 其特黠性的强删，赴随着抗原分子j ! 利暴露_ i ，| ：其分。f 表决定旗的拦，以段求水肚能的馊 化而变化的。抗原分r 鼙越人，暴露在其分r 表面的决定簇就越多、求水性能越女r ，特绅 性就越姒。反之，0 特异性就越弱。原网是，抗坂巾帕每个决定簇”n 导一个特片的免疫 化学反麻，井i i 只能0 此反应所十成的特异性抗体起作川。抗体豫酶。样，jl 自特殊f n 维结构，以适应抗原决定簇的要求。如粜抗体结合抗原的部位在结构j 。发中政变，就不能 满足抗原决定簇对形状的要求，从而娃并地降低或完全妨埘r 与抗原的结合( 址俐： ) 。 抗原，抗体的结构 完全h 补状态时，即，“生最高结台量。m 币充令l 补状态i i 、| ，亦能 产生定的结介疆。 ；一盒藉 确 一。 部分结合 h ：j 抗原与抗体的决定簇4 i 同互补群度绡合的示意图 b 构蒙 抗原的审问结 _ f ：| 对免疫化学反麻的特异性有叫显的影响。特抗原一蚩一质变。队、或 8 门赶i 挑抗件脱i g g 免疫传感器的”究 构松散，都会使抗原的性质发生很人变化。例如肌红蛋l 。i 质巾的辅摹一上| 三铁曲红素，皿然 不是浚出闩质的个决定簇，似除去之后，i j 引起其空问构象发生较人变化，从而使其免 疫特异性改变。 c 电荷 抗原分f 上分布宵一定数罐的f u 荷。它可使抗原的亲水性增强，促使抗原7 j 抗体之| i | j i 的离子之间相h 结合，以利下增加抗原的特片性。 ( 5 ) 、r 抗原和载体敛应 实践缸明，小分，物质如化学曲物、激素、农约、化。学试剂、仃机试剂等等，l ：i fj 没 柯免疫原性，将它们引入动物体，小能诱导产生抗体。f 口它们能用憾当的抗体反麻即订 免疫反麻性。我们将这些4 i 含蚩门质成分的有机小分子，叫做、r 抗原。小分子物质精人、 mj 一，是十分- n 要的分析检测埘缘。如何使小分f 物质诱导j 。叶抗体，就成为解决小分j ， 免嫂分析方法的关键。为此，l a n d s t e i n l _ w 进行了开创性的研究l ：干1 ：。他将小分f 偶联剑 具订皿抗坂忖- 的人分子( 通常川出质) i j ，从而i t 咀扶得抗小分丫n j 抗体，这发现意 义”常- e 人它突破，免疫方法的硒限人人拓宽厂免疫分析的范，开阀j 免瘦化乎+ 的 新领域。偶联的生r 1 质称为载体。当然，载体分_ r 必须具箭免疫腑陆。、r 抗原蚁仃偶联n - 完全抗属1 分rt ：，才能诱锌机体产, t - 对、r 抗坂的免疫成符。裁体生r 1 小仪仅是增加、f 抗原 的棚对分f 质精，也币是单纯的起运载作川，m j 是依鞋本岿的l 构特异悱一免螋原性，_ 能诱导体液抗体舯产生以及继而诱导对、i 抗原的汲别。这种现琢称为找体效腑( c a n t r e f t 。e c t ) 。通过人姑的研究i ：f 17 ，建立_ r 多种将小分，、r 抗原偶肤剖赞r 1 质或多糖臀找体 人分rf | 的方法。一般部是利h j 小分子t ：的活件部化与篮f l 质分子l 的氩驰、黢坫、酚j k 巯基或羟基进仃化4 学反应。经常采川的偶联反i , i z ：f l 重氮化浊、碳：啦胲法、泓合酸卅 厶 戊一醉法等等。 1 2 1 2 抗体 ( 1 j 定义 抗体是冉：剥抗原刺激的免疫应答中，b 淋巴细胞产生的一类糖出r 1 ，是。，棚j 趣抗原特 异地结台，“生栉种免疫效应( 生理效戍) 的球生闩，亦称 1 免疫球生r 1 ”，以 l g ( i m m u n o g l o b u j n ) 表示，现已发现的免疫球蛋向有5 种，分别命名为jg ( ；，l g a ，i 州， g d 年 g e ，无脊椎动物= ：l = = 产生免疫球出向。m 仃l g m ，炳栖类订l g m 剐l g ( ，。除人类订5 种免疫球蚩向外，人多数哺乳动物只仃l g ( ；，l g a ，l g m 和i g ep q 种免疫球篮i 1 。抗体- i 毖 分布在体内帆消巾。“抗血清”即地指含订某种特肄抗体的动物帆消。| _ j _ j 抗原1 0 抗体豆 9 门刿上装抗体膜i g c , 免疫传感_ ；： 的研究 麻具有高度的特异性，i 习此往往无需纯化抗血清而直接川j j 检测。 ( 2 ) 免疫球蛋白分子的基本结构 免疫球篮n 结构的阐明是现代免疫化学最伟人的成粜之 。任何一种免疫球货f ，f 都是 南两条轻链羊婀条班链共网条肽链构成。轻链和重链分别由2 1 2 2 1 4 个剐4 2 04 4 0 个氨壤 酸构成。不管眼链还是轻链都分两个阮域：氨基端的可变区( v ) 和羧荩端的稳定区( c ) 。 轻链只有k 和l 两种类型，分! l ； j 称为k 链平l 链。各种免疫球蛋白的轻链w 咀相刚，m 在血清学上可发生交义反应。重链有开种，分别以t ，o ，u 6 和e 表示。t g g 的啦髓 为t 链，而i g a ， g m ，i g d 和i g ef | 勺重链分别为q ，u ，6 年链；它”j 的轻链可以赴k 也可以是l 冈此免疫球蛋r 1 是根据t ，u ，u ，6 和链的不同而被区分成5 种。 图4i 霹g 分子结构及箕辩挽舔的讽别 0 i f 2 卜 蕊姣瞻 自纰装抗体膜i g g 免疫传感 l 的甜究 咀免疫球蛋向g 为例，它的分子由4 条多肽链组成，刨2 条相同而分子址较人的啦链 ( h e a v yc h a i n ，i t 链) 神l2 条相同而分子龄小的轻链( 1 i g h lc h a in ，i 链) 。匝链年轻链 之间及重链和重链之间均藉：硫键相连加l ：分子内的氢键等1 f 共价键，川i d 维系免疫球 蛋n 的分子结构。整个分r 分成二个功能区，如蚓4 所示。f c ( f r a g m e n t o f 。 c r y s t a 1z a t 0 1 1 ) f x - ，h i ( h i n g c ) 铰链x 垌lf a b ( f r a g m e n to fa n t i g e nb d in g ) r 。 抗体的f a b 区结合抗朦分f ，同时通过h i 区的转动以适心不同距离的抗原决定簇。1 抗 原结合衍，免疫球蛋白分r 构象将政变，暴露出f c 上的活性位点，从而表现j l 州定的激 活补体的功能。 ( 3 ) 多抗，单抗 从被免疫的动物向沾中获褂的抗体为多兜隆抗体，虽然川j i 免疫分析的效粜良女r ，似 缺点是抗体不均一，米源足间断的，有较人的批l h j 筹别。其掀住r 当机体受 种执跺刺 激后，抗原分子j ：的汁多抗原决定簇分别激活j 有不| i ；司鉴冈的b 淋巴细胞，这j 被激沂旧 b 淋巴细胞分裂、增驰形成多兜隆抗体分子，它仃j 在细成、结构以及b = f | 心抗原 台的亲 雨i 力等方面都有所不同，所以血消t j 的免疫球坐向是不均的混台物。f 7 0 年代发腱睁 克隆抗体技术，至今已i j 荫成熟。兜降( c l o n e ) 是指_ 尢t e 繁殖细胞系。币兜隆抗体 ( m o n o c 】o n a la n tf b o d y ，i m c a b ) 是指神：一株b 淋巴细胞系中的每个细胞j 能产乍种# 有的、针对种它能识别的抗原决定簇的抗体，闲而是一种均质的高特异性抗体，j i i l j 以往体外培养液巾继续培养，或接种柱小鼠腹腔l 由传代，人i i 十；= 制稀。 由1 ：实验条仆订限，我们在实验中使川的是从北京经科宏达生物技术竹限公d 蚴氍的 多克隆一二抗兔抗小鼠i g g 血清。它是将小鼠1 9 g 抗原分f 分别以桶氏完个佐制( 1 1 | 包水 溶性抗原分f ) 或褊氏不完全佐剂，及水剂相结合的剂删免瘦注射丁兔i 佝体内，j 二。s 效 价抗体后，经无菌低温分离制成。其效价为卜3 2 。( 抗体的效价，义称“滴度”，址怀，占 抗体性能的上要参数之。定义：对给定的测试反应能给山可观察剑的抗原j 抗体反j 衄 时，抗血清的最人稀秆度。教价越商，表明抗向清的质拦越高，即进行免疫分析叫的疋皱 度越高。) 1 2 1 3 抗体对抗原的特异绵合 当抗原与其相麻的抗体相垃接近形成抗原抗体复合物时，它们之问的结介1 i 址 j ! l 价 键而足借像酶或运输蛋白，它们的佧j h 物之问那样的吸1 1 ；| 力进行的。这种结台的蟥终姒艘 是抗原年抗体分子t - f f ( i f f j 荇种结f f j j $ , t t = ) ? j 2 的总和。虽然住生理p i i 的条件h ，这“o 分子e 的止负荷电离，之问t q 能存柙：强烈的吸引年排斥作川，但 台时并不定刈抗原 朗封【装抗4 木膜i 班j 免疫传感器的研究 荷l 也摹团有什麽要求。决定结合烈度的t 婴闪素是氢键、范德华力、静【l l l 川力年疏水 1 h j 这样一类比较弱f t q t k 合力。由卜心0 价键结合力比较弱，所以抗原珧定旗必须一，抗体的 结合点足够接近才能发生结合。抗体分r 是具f j 并种结合力曲! 度的混合物，闪此它，抗蟓 | 勺结台强度是不相同的。结合力弱旧易受r 抗：结合力强的则不勃解离。 为_ 解抗原年ij 抗体的结含部位，曾对鼠骨髓瘤抗体m c a h 6 0 3 的f a o 片段利膦毗碱1 1 结台的部位进行过x 射线衍射分析。从衍射结果不但了解了抗原抗体的结合沸化i 可儿还j j 剑其结合劁形，见蚓4 。磷酰心碱的结合。楔r 形灼空问，在空间肇上排列荇铍称为抗体 分r 的超可变x 的氨基酸戏幕。其磷酸部分方面与k 基以氢键结合，另方面义j 牿 氨酸残基的l i u 椭发牛静电相作j j ，这个磷酸部分忙丁这两种作川力的r 衡位置；j j | 1 碱 部分的也荷1 1 = | i 谷氨酸残荩上的负l u 衙发生静i u 相互作川，而n 一重链羽i 轻链舣力f 门碳原f 之间存在范德华力。由此l j ! l ，抗体分子l 的抗原结合部化足仃j j 抗原形：i 火棚别麻的分j ， 空间。这个分子空i n - j - 视为以静i 乜引力和范德华引力作j 4 山氨基酸残基构成的。这挑地为 什麽抗体对其相应抗原发生特异 合的原周。 人多数的抗体至少是胁价的( i ：j 具7 r 两个受体结合点) 向多数是多价的。c o n a 订叫 个受体结合点。、i ，抗原通常有多个活性幕团，但常常n ：文献巾_ 石剑的抗原卡抗体i | ，j 年u 1j 结 合是以1 ：1 进行的，其结合常数单位为( m o l l ) 。这样处理所得得结合常数称为。价 结合常数。在砹讣免疫传感器时作为第一级近似还是可以采刖的。 从分析1 m 7 ：i 。作_ 行的眼光米看，抗体的特异性是无o 伦比的。抗原o 抗体分f 之洲的 空问址补结构使抗原抗体分子形成亲雨i 力而紧密结合，这是抗原1 ，相庸抗体 1 合：o 搜 特异性的分r 基础。抗体抗原复合物的稳定性檄高，其稳定常数一般为坩，仃b j 达 l o “l 1 0 ”。m 且免疫系统足部天然存拒的台成特异试剂的机器。入侵动物仆内的外束物 质形形色色，免疫系统人多都能产生i j _ i n 应的抗体。这就意味着它将为我们提供儿乎灶应 有堪有、取z 1 i 竭的特片性试剂。 1 2 2 电化学免疫传感器的结构“1 根据信息的转换过科，【乜化学免疫传感器的结构人致可分为直接j 蛆羽删接) 耻两类。 ( 1 ) 直接型电化学免疫传感器 这类传感器的特点是在抗体与其相应抗原彭 别结合的列时，就把这个免疫反戍的信息 直接转变成l l 三信号。这类传感器在结构j ：义可分为结台艰和分离刑蚶种，前种址将抗体 或抗原直接州定在转换器表面l ，将分子识别元什平转换器二者含为一体。i a n a t a 所提 2 ! ! ! 鲨堕! ! 堕! 鲤丝! ! 竺壁堡竺坐! ! 山的“免疫l 乜极”即属j ：这种类j 州。他是将抗体通过聚氯乙烯膜f t 按i 卉| 定剑金崩导休f 制成的。这类结构的传感器与相麻的抗体或抗原发生结合的同州产牛l b 何【盘变。肝 种炎 型，分子识别元什j 转换器延分开的。i ! 【r ij 1 抗体或抗原制备的抗体膜或抗原膜，“1 它j4 + l l 应的月e 肇反麻时，膜的电何发q 二变化。在测定这种膜电位的装嚣中，抗体膜或抗原腆j 转 换器是分开的1 。 ( 2 ) 间接掣电化学免疫传感器 这种传感器的特点姓将抗原或抗体结合的信息转变成h种中间信息，然j 1 i i 十把这个 中间信息转变成l u 学信号。这类传感器n ：结构上也有两种类掣：结合j l - , j _ 平1 1 9 ) - 离删。前种 结构足将抗体或抗原通过化学方法亢接结合剑l b 化学l i x 极的表面卜，或将制成的 j i | = 体腆! 蛇 抗原膜贴附在i u 极的表面 i 。它们的t 1 - 问信息的转换器实质 二是一种在化产i 一把分j 7 i j tb j i j 元件+ l l 转换器连接起米的化学体系。矗：者之问实现这种联系的l | j 以魁标“酶的体系或! i 它标记物。肝一种类璀n 勺间接j 弘电化学免礁传感器结构是分r 识h t j a p i 和转换器：名址 完全分开的。例如，使j 4 j 聚笨乙烯珠或其微孔内鲑吸附抗体或抗原制作分r 以别j a i l ：，川 电化学电极进行酶免疫测定，它们的分子识别元什年转换器是完全分丌f 由。”。 1 2 3 电化学免疫传感器的分类 根据所川的标记物种类的【乜檄类，町将f j 前所报道的i i x f t 。学免疫传感器分为fl 炎： ( 1 ) l b 流j 鸭酶免疫传感器：它是以酶免疫测定为基础，采j i j 电流州l u 极将的底物浓 度改变或其催化产物的浓度故变转变成电流信号的测定裟肖。 ( 2 ) 电流型1 l ：酶怀址免疫传感器：相：这种传感器中，抗体或抗胍不址川酶杯址的，i 竹 是川其它某种i u 活性物质标记的。 ( 3 ) 电能型无标记免疫传感器：这种传感器的原理是：抗体或抗原被i 定m 人分j 构 成的膜卜或金桶l l 土极l ，“被i 1 定的抗体或抗原与相应的配体结合时则l u 忙或膜l u 化发生 变化。 ( 4 ) 电位即酶免疫传感器：在这种免疫传感器中使川的标记酶的底物或其j 【i 三物的催化 产物是能川, i x 何型l 毡极洲定的。通常所使h | 的电极有离子选扦电极、c 幔。t 敏i u 檄年氨7 敏电极等。 ( 5 ) l 乜位型1 r 酶标记免疫传感器：枉这种类型传感器中所使川的标记剂1 i 魁哪m 址除 酶以外可州电何) 口电极进行测定的其它标记荆。 本文所研制的i 乜化学免疫传感器在结构t - _ l i 有结合式直接型【乜化学免疫1 0 感器的特 3 n 组姨抗体膜 g g 免疫传, j 端f l j4 0 1 究 点，属t - i b 位喇无标记免疫传感器中的种。 1 3 电位型无标记免疫传感器 1 3 1 电位型无标记免疫传感器的发展历史“ 这类传感器柞：某些文献中义被称为膜免疫传感器。臼1 9 7 5 - f 1 a n a t a “一次将伴儿 球蛋矗a ( c o n a ) 1 刊定j - p v c 膜h ，研制成可测定甘露聚糖酵母的免疫l b 极以米，这类传 感器秩得r 较快的发展。1 9 7 7 年a i z a w a 等将能与梅毒抗体特异结合的心肌磷胎 1 。为活 性物质，将其川定在醋酸纤维素上作为抗腺膜，川丁诊断梅素。问年，d ( ) z l o 干| | r e c h n i t z “利川豚鼠补体u ：别羊红m 细胞影( s r b c g ) t 的溶血袭抗原抗体复合物，溶解 s r b c g ，群放其中r f j7 r m a ，冉以二l i 基苯胺( t m p a ) 离r 选扦电撇测定抗溶l m 索或豚敝 补体，使这类免疫i u 极的灵敏皮f r 所改善。1 9 7 8 年y a m a m o t o 等将经商濉处珊肝的t j 丝j t lc n b r 酒化，州定人绒毛脱促性腺素( h c g ) 抗体，制得j - tj _ i j j 测域| 1 c ( ；的免疫i u 椒。 1 9 8 0 年a i z a w a 等”从红细胞中提取的血，弘物质凝集素制成抗原膜，川】f i l l 惮的测定。“ 抗原抗体反应n ：膜表面进行时，使膜i u 位发生变化，冈此，- | 】- 利j j 输甲的膜l u f 口洲h 装w 判定皿型。1 9 8 1 年s o l o k y 雨lr e c h n 【t z 采h jt 氟问硝荩苯。：氨基笨行1 8 越6 的反 应产物为载体，制成r 可川tj 12 ，4j 硝基苯肼抗体测定的p v c 膜i u 极，线性范刑为 2 8 1 4 6 】ug m 1 ，测垃的标准偏芹为4 1 ，为膜免嫂l u 极的研制开辟j - 种新的途径。 在此基础上，1 9 8 4 年k e a t j f l g 雨lr e c h n i t z l 义将苯并一1 5 冠5 、一苯爿。一1 8 - j d 一6 分! j | ji i 地戈辛经化学反府绱合，通过电极测垃某定k 浓度溶液的电极电何变化。奠内部分拽 体与放测溶液中的抗体结合后，可移动的k 载体减少，l u 极电传发十改变，m 此町问接 测得该体系中地戈辛抗体的浓度。1 9 8 7 年b u s h 雨r e c h n i t z l 报道了一干丁川jj i 测* 、1 7 执 原2 ，1 一二硝基苯肼( d n p ) 的可逆电极。小分子的2 ，4 - d n i ，可白由通过胶原膜1 d n i 抗 体结合。由_ r 该电极可逆，则可进 亍连续测定。近年米，国内已陆续研删成f i fh f ；生l 1 ( t ， 一f p ) ”、川i ! j l 毒袭”“l 、厶肝表i f i i 抗原( h h s a i ；) ”、h c g ”。“等膜免疫l u 极。订报道 将抗硒j 刊定j 聚笨乙烯薄膜上，研制成免疫球蛋一g ( i g g ) 羽j 抗i g ( ；i u 撇，洲褂f n 线 性范阳分别是1 7 3 7ug m 1 和5 8 6ug m l 。也有报道”“川蚕丝作载体定抗i l t ) s 的 i l b s a f f 免疫l u 撇，u j 打2 ( 卜3 2 ( j n g m 】范罔检测i l b s a g 。林剃辉等以醋酸纤维索戊：n * 己：胺膜以及合成的聚甲基例烯酸羟乙j | 匕麒，分别l 1 定c 一反应篮白( c r i ) 抗体、免疫 球篮r im ( i 洲) 抗体、抗af p 乖l 甲状腺索( n ) 抗体，配合全态基础l u 檄制成的免疫 电极，可歌得稳定、吐现的结聚。该法l 研制成c r p ”、o f i ，”、i g m 。 垌l1 i - 等免疫i 也檄 4 自封i 装抗体膜i g g 免疫传感器的研究 并已j “j ：人f m 沸抖抖，豹测越。 1 3 2 电位拟无标址免疫传感器的发展趋势自组【装膜修饰 乜极 在免疫传感器的制备中，抗体或抗原的定化怂关键。近年来，采川 价结合法州i 定 抗体或抗原的报道节1 外趋贽，尤其是余桶( 如金) 表面 i 组装技术的心j 1 越求越广泛。 用自缃装膜修饰的叱微兜服r 以f 衍的修饰疗法如吸附法、聚合物涂层法等不能完令控制分 子的取向或排列的缺点可以枉分子水i 艮l 按人们预州的i _ ；_ l 杯进行i 5 计。它足对传统的 l a n g m u i r8 1 0 d g e t t ( l b ) 膜修怖l 也极的进一步发展，达纠_ 单联化学修饰j u 拔的最f 膏血棼。 1 3 2 1 自组堤单分子膜概述” ( ”，“绷装单分，膜的发展简史及麻 j 组装单分r 腆( s e l 卜a s s e m b e dm o n o l a y e r s ：s a m s ) 是近2 0 年米发展起米的种新 型的有机超薄膜，其制备技术及农征方法已得到巨人发展。 在1 9 4 6 年z i s w l n 等”1 械 报道了表面活性物质n ：沾净会属表i i f 1 吸附m 形成单分r 膜的现缘，不过这项r 作的瓯1 1 兴起始丁8 0 年代，1 9 8 0 句：s a g iv ”报道了 一八烷丛：氯硅烷在髓片i 形成的s ，1 9 8 3 年n u z z o 等“成功地制备了烷堆硫醇化物在会农葡i 的s a m s 。从此儿种制箭s a m s1 1 ( 体乐 逐渐成熟利发展起术| = 。 s a m s 从分f 羊原子水平l 提供了对结构与性能之问的天系及符种界晰脱豫深入删斛 的机会，方便灵活的分f 敬计使其成为研究、认识f 序性生k 、润温悱、料卉、涧滑、j 黼 蚀等现象的极他体系：s a m s 的空问有序性，呵使其作为i 维乃至i 维领域内训：究物理化 学_ 手l l 统计物理学的根立，模， | ! ：由丁其堆积紧南和j 结构稳定，w 而具订跏= 腐蚀、减小摩撩 及降低磨损的作瑚；此外，生物模拟帮l 生物相容性的本质使其有望a ：化+ 学刹t j 物化：敏感 兀什的制薛中得到戍川。与分子求外延生长( m b e ) 、化学2 相沉积( c v d ) 等办法制街的超 薄膜相比，s a m s 贝j j 更高的有序性年取向性”。 ( 2 )n 纽装成麒的基本原理 白绵装成膜的基本原理足通过i 计液界面问的化学吸附或化学反应，以：罐”l ：形成化 学键连接的、戢向紧密排列的一维有序单层膜”j ( 魁剀5 ) 。s a m s 从组成结构1 ，u 分为二 部分j ：一是分r f l ，j 头基( h e a dg r o u p ) ，它1j 基底表向l 的反应点以0 价键( s 卜( 】 键及a u - s 键等) 或离f 键( 如一c 躔a 9 1 ) 结合，这是一个放热反应，活r ：分_ r 会塔川能t l 据基底农面上的反应点：二是分f 的烷基链( a l k y lc h a i n ) ，链，链之m 锥范德。# 作川使 活性分子在潲体表f f f 有序h 紧密构押列，相干1 ：刈能般小r4 0 k j m o ，分r 链1 1 1 问川 5