（外科学专业论文）kiss1和s100a4在膀胱移形细胞癌中的表达研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6 刖舌 材料与方法6 结果1 0 讨论1 6 结论19 四、本研究创新性的自我评价2 0 五、参考文献2 1 六、附录 综述2 3 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 s 1 0 0 a 4 和k i s s 1 在膀胱移形细胞癌中的表达研究 目的 讨论钙离子结合蛋白a 4 ( s 1 0 0 a 4 ) 及肿瘤抑制因子( s s 1 ) 在膀胱癌中 的表达和临床意义，以及二者之间的关系。 方法 选择膀胱移形细胞癌标本6 0 例作为实验组，正常膀胱组织l o 例作为对照组。 实验组均为经手术切除的原发性膀胱移形细胞癌标本，术前均未经过放疗、化疗 和激素治疗，病人年龄的范围在2 0 8 1 岁。已发生淋巴结转移的原发性膀胱移形 细胞癌标本2 4 例，非转移性标本3 6 例。正常膀胱组织1 0 例( 由于输尿管癌或肾 盂癌而行膀胱部分切除的正常膀胱组织，经病理证实膀胱无肿瘤细胞) 做对照， 所有标本均经福尔马林固定，石蜡包埋。临床病历资料通过回顾病人的病历记录 和组织病理报告获得。应用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白一过氧化物酶连接标 记法( s p 法) 检测6 0 例膀胱移形细胞癌组织及1 0 例正常膀胱组织中的s 1 0 0 a 4 蛋白及k i s s l 的表达。采用s p s s 软件进行贮检验和s p e a r m a n 相关因素分析， 分析二者的表达变化与临床病历特征之间的关系，以及二者之间的相关性。 结果 1 正常膀胱组织s 1 0 0 a 4 蛋白1 例表达阳性，k i s s 1 中9 例表达阳性。6 0 例膀 胱移形细胞癌组织中4 2 例( 7 0 ) s 1 0 0 a 4 蛋白表达阳性，2 6 例( 4 3 3 ) k i s s 1 表达阳性。正常对照膀胱组织与膀胱移形细胞癌组织之间s 1 0 0 a 4 蛋白及k i s s 1 表达差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) s 1 0 0 a 4 蛋白在膀胱移形细胞癌组织中的阳性 表达率：在组织学分级中i 级、i i 级和i i i 级分别为3 1 3 ( 5 1 6 ) 、6 8 4 ( 1 3 1 9 ) 和9 6 0 ( 2 4 2 5 ) ；在不同临床( t ) 分期中t a t 1 期和t 2 1 4 期分别为5 7 1 ( 1 6 2 8 ) 和8 1 3 ( 2 6 3 2 ) ；在淋巴结转移阳性组和阴性组中分别为8 7 5 ( 2 l 2 4 ) 和5 8 3 ( 2 1 3 6 ) 。k i s s 1 在膀胱移形细胞癌组织中的阳性表达率：在组织学分级中i 级、 i i 级和级分别为8 1 3 ( 1 3 1 6 ) 、4 7 4 ( 9 1 9 ) 和1 6 0 ( 4 2 5 ) ；在不同临床( t ) 分期中t a - t 1 期和他t 4 期分别为6 4 3 ( 1 8 2 8 ) 和2 5 0 ( 8 3 2 ) ；在淋巴结转 移阳性组和阴性组中分别为2 5 o ( 6 2 4 ) 和5 5 6 ( 2 0 3 6 ) 。在膀胱移形细胞癌 组织中，s 1 0 0 a 4 蛋白的表达增强和k i s s 1 的表达缺失与膀胱移形细胞癌的组织 学分级、临床分期和淋巴结转移有关( p 0 0 5 ) 。s 1 0 0 a 4 蛋白表达增高时，k i s s 1 表达下降，二者之间呈负相关的关 系。 结论 s 1 0 0 a 4 蛋白及k i s s 1 的表达变化与肿瘤的进展密切相关，是判断其生物学 行为，预测转移趋势极具价值的指标。s 1 0 0 a 4 蛋白有可能下调k i s s 1 的表达， 在膀胱癌的发生、发展和转移过程中起重要的作用。 关键词 膀胱；移行细胞癌；s 1 0 0 a 4 ；k i s s 1 2 英文论著摘要 t h e s t u d yo fs 1 0 0 a 4a n d k i s s - - 1e x p r e s s i o ni n t r a n s i t i o n a lc a r c i n o m ao ft h qb l a d d e l n s i t i o n a la ro m ao it h eb l a d d e r 0 b j e c t i v e t od i s c u s st h e e x p r e s s i o n so fs 1 0 0 a 4a n d k i s s 1i nb l a d d e ru r o t h e l i u m c a r c i n o m aa n dt h e i rs i g n i f i c a n c e m e t h o d s w es e l e c t e d6 0 s p e c i m e n so fb l a d d e rt r a n s i t i o n a l c e l l c a r c i n o m a ( b t c c ) a s e x p e r i m e n t a lg r o u pa n d10s p e c i m e n so fn o r m a lb l a d d e rt i s s u ea sc o n t r o lg r o u p t h e s p e c i m e n so ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pa r ea l lp r i m a r yb t c co fs u r g i c a le x c i s i o n t h e y h a v en o tr e c e i v e d r a d i o t h e r a p y ，c h e m o t h e r a p y a n dh o r m o n e t h e r a p y b e f o r e o p e r a t i o n t h ed u r a t i o no ft h e i ra g ei sf r o m2 0 - 81 t h en u m b e ro ft h es p e c i m e n sw h i c h h a v em e t a s t a s i si s2 4 a n dt h en u m b e ro fn o n m e t a s t a s i si s3 6 t h e10s p e c i m e n so f n o r m a lb l a d d e rt i s s u eo fc o n t r o lg r o u pa r ea b l a t e db l a d d e rb e c a u s eo fu r e t e r i co rp y e l i c t c c i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a t t h e yh a v e n o tt u l t l o rc e l l sa f t e r p a t h o l o # c a l d i a g n o s i s 舢lt h es p e c i m e n sh a v eb e e np r o c e s s e db yf o r m a l i nf i x a t i o na n dm i n e r a l w a x e m b e d m e n t w ee v a l u a t e d6 0b t c c sa n d10c o n t r o l sa n de x a m i n e dt h ep r e s e n c eo f s 1 0 0 a 4 p r o t e i n a n d k i s s - 1 ，a s d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t r e p t a v i d i n p e r o s i d a s e ( s p ) m e t h o dw i t ht u m o r g r a d e ，c l i n i c a ls t a g ea n dl y m p hn o d e m e t a s t a s i s b e s i d e s ，w ea n a l y z ew h e t h e rs10 0 a 4 p r o t e i na n dk i s s 1e x i s tc o r r e l a t i o no r n o t r e s u l t s t h ee x p r e s s i o no fs10 0 a 4p r o t e i ni sn e g a t i v ei 1 1n o r m a lb l a d d e rt i s s u ea n dt h e e x p r e s s i o no fk i s s 一1i sp o s i t i v ei ni t t h ee x p r e s s i o no fs10 0 a 4p r o t e i nw a sf o u n d e di n 7 0 i nb t c c sa n dk i s s 一1w a s4 3 3 伊 0 0 5 ) t h e e x p r e s s i o nr a t e so fs 1 0 0 a 4 p r o t e i ni nh i s t o l o g i c a lg r a d ei ，i ia n di i io f b t c ca r e3 1 3 ( 5 1 6 ) ，6 8 4 ( 1 3 1 9 ) a n d 9 6 o ( 2 4 2 5 ) t h ee x p r e s s i o nr a t e so fs10 0 a 4p r o t e i ni nc l i n i c a ls t a g et a t 1a n d t 2 - t 4a l e5 7 1 ( 1 6 2 8 ) a n d8 1 3 ( 2 6 3 2 ) a n dt h ee x p r e s s i o nr a t e so f p o s i t i v ea n d 3 n e g a t i v el y m p hm o d e m e t a s t a s i sg r o u pa r e8 7 5 ( 2 1 2 4 ) a n d5 8 3 ( 2 1 3 6 ) t h e e x p r e s s i o nr a t e so fk i s s - 1i nh i s t o l o g i c a lg r a d ei ，i ia n d o fb t c ca l e8 1 3 ( 13 16 ) 、4 7 4 ( 9 19 ) a n d16 0 ( 4 2 5 ) t h ee x p r e s s i o nr a t e so fk i s s 一1i nc l i n i c a l s t a g et a - t 1a n dt 2 t 4a r e6 4 3 ( 18 2 8 ) a n d2 5 o ( 8 3 2 ) a n dt h ee x p r e s s i o nr a t e s o fp o s i t i v ea n dn e g a t i v el y m p hm o d em e t a s t a s i sg r o u pa r e 2 5 0 ( 6 2 4 )a n d5 5 6 ( 2 0 3 6 ) b o t hs10 0 a 4a n dk i s s 1i i lb t c ca n dn o r m a lb l a d d e rt i s s u eh a v e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h ee x p r e s s i o no fs 1 0 0 a 4p r o t e i na n dt h el o s so fk i s s - 1w a s p o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hh i s t o l o g i c a lg r a d e c l i n i c a ls t a g ea n dl y m p hn o d em e t a s t a s i s ( p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no f k i s s - 1 d e c r e a s e sw h i l et h ee x p r e s s i o no fs10 0 a 4p r o t e i nr i s e s t h er e l a t i o no ft h e i r e x p r e s s i o n si sn e g a t i v e c o n c l u s i o n s t h ee x p r e s s i o n so fs10 0 a 4p r o t e i na n dl o s so fk i s s 一1a r es i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e d w h i tt u m o rp r o g r e s s i o ni nb t c c s b o t ho ft h e mc a nb et h ep r e d i c t o r so ft h eb i o l o g i c a l b e h a v i o ra n dt r e n do ft h e p a t i e n t sw i t hb l a d d e rt r a n s i t i o n a l c e l lc a r c i n o m a t h e e x p r e s s i o no fs 1 0 0 a 4p r o t e i na n dt h ee x p r e s s i o no fk i s s - 1i nb t c c sh a v ei n t i m a t e r e l a t i o n s10 0 a 4p r o t e i nm a yd e c r e a s et h ee x p r e s s i o no fk i s s 一1 i tp e r h a p sa f f e c t st h e o c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n ta n dm e t a s t a s i so fb l a d d e rc a r c i n o m a k e vw o r d s b i a d d e r ：t r a n s i t i o n a lc e l lc a r c i n o m a ：s10 0 a 4 ：k i s s 1 4 英文缩略语 5 论文 k i s s 1 和s 1 0 0 a 4 在膀胱移形细胞癌中的表达研究 刖舌 膀胱癌是泌尿系统常见的肿瘤，其中膀胱移行细胞癌( t r a n s i t i o n a lc e l l c a r c i n o m ao fb l a d d e r ，b t c c ) 的发病率和病死率均为第一位。侵袭和转移是恶性 肿瘤的主要生物学特征之一。抑癌基因的失活和癌基因的活化是导致肿瘤增殖失 控，恶性生长，侵袭和转移的基础。目前有关膀胱癌发生侵袭和转移的机制仍不 十分清楚，严重制约了临床医生对其早期诊断、治疗和预防的评估。因此，寻找 与膀胱癌侵袭和转移有关的标记物一直是膀胱癌研究的重点和热点。 s 1 0 0 a 4 基因的编码产物属于c a 2 + 结合蛋白s 1 0 0 家族的成员，$ 1 0 0 蛋白被认 为是一组钙离子传感器，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分化、粘附、运 动、基因表达及凋亡过程中发挥重要作用。 k i s s 1 基因是1 9 9 7 年l e e 等人在黑色素瘤中发现的一个新的肿瘤转移抑制 基因。研究发现k i s s 1 的表达水平与人黑色素瘤、乳腺癌的转移能力呈负相关。 目前二者在膀胱移行细胞癌中表达的相关性研究尚未见报道。 本文采用免疫组化法检测了b t c c 中s 1 0 0 a 4 蛋白及k i s s 1 蛋白的表达，研 究二者与b t c c 生物学行为之间的关系，从而探讨s 1 0 0 a 4 与膀胱癌的发生、侵 袭及转移的关系，为膀胱癌的早期诊断、基因治疗和判断预后提供理论依据。 材料与方法 一、标本来源 选择中国医科大学附属盛京医院2 0 0 4 年1 月- - 一2 0 0 7 年4 月手术切除膀胱癌 标本6 0 例，均为原发性膀胱尿路上皮细胞癌，术前均未经过放疗、化疗和激素治 疗。标本中男性4 0 例，女性2 0 例，年龄2 0 - 8 1 岁。已有淋巴结转移的原发性膀 胱尿路上皮细胞癌2 4 例，无淋巴结转移者3 6 例。正常膀胱组织1 0 例( 由于输尿 管癌或肾盂癌而行膀胱部分切除的正常膀胱组织，经病理证实膀胱无肿瘤细胞) 6 做对照，男性4 例，女性6 例，年龄5 2 8 4 岁。所有标本经福尔马林固定，石蜡 包埋。临床病理资料通过回顾病人的病历记录和组织病理报告获得。临床分期按 照2 0 0 3 年修改的国际抗癌协会联盟( u i c c ) 和美国肿瘤联合会( a j c c ) 联合制 定的t n m 标准分为t a t 1 期2 8 例，t 2 t 4 期3 2 例。病理分级按w h o 标准分 为i 级( 高分化) 1 6 例，i i 级( 中分化) 1 9 例，l 级( 低分化) 2 5 例。 二、主要试剂 一抗：兔抗人s 1 0 0 a 4 单克隆抗体( 工作浓度为1 ：1 6 0 倍) ； ( 购自武汉博士德生物技术有限公司) 一抗：兔抗人k i s s 1 单克隆抗体( 工作浓度为1 ：8 0 倍) ； ( 购自武汉博士德生物技术有限公司) s a b c 免疫组化试剂盒( - - 抗：标记长臂生物素的山羊抗兔i g g ) 5 b s a 封闭 液；s a b c 液) ； ( 购自武汉博士德生物技术有限公司) d a b 显色剂；组织抗原修复液i ；1 ：9 多聚赖氨酸溶液；3 h 2 0 2 溶液；磷 酸盐缓冲液( p b s 缓冲液，0 0 2 m ，p h = 7 4 ) ；苏木素复染剂； o 0 1 m 枸橼酸盐缓冲 液( p h 6 0 ) 。 ( 购自武汉博士德生物技术有限公司) 三、检测方法 所有标本经福尔马林固定，石蜡包埋。采用免疫组化s a b c 法。每批染色均 设阳性对照( 已知的阳性膀胱移行细胞癌组织切片) 和阴性对照( 以磷酸盐缓冲 液p b s 代替一抗) 。 ( 一) 载玻片处理 1 、载玻片置于8 1 0 硫酸中过夜。 2 、流水冲洗2 4 小时。 3 、蒸馏水浸泡2 4 小时。 4 、置于1 0 0 烘箱中3 0 分钟干燥。 5 、l ：9 多聚赖氨酸溶液( p o l y l y s i n e ) 中浸泡5 分钟。 6 、捞出后，室温晾干，装盒备用。 7 ( 二) 切片、贴片、烤片 1 、组织蜡块夹于轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋 紧。 2 、设定切片厚度4 9 m 。 3 、旋转蜡块，切出蜡片，用毛笔扫入摊片机水槽内展平( 水温4 5 ) 。 4 、用载玻片捞取蜡片，铺平。 5 、置于3 7 c 温箱中过夜。 6 、装盒备用。 ( 三) s 1 0 0 a 4 染色程序 l 、切片经二甲苯、梯度酒精常规脱蜡至水。 2 、滴加3 h 2 0 2 ，置于3 7 恒温培养箱内孵育1 5 分钟以灭活内源性过氧化 物酶。蒸馏水洗3 次。 3 、滴加抗原修复液i ，高温高压修复5 分钟，降至室温，p b s 液洗涤2 分钟 3 次。 4 、滴加5 b s a 封闭液，置于3 7 恒温培养箱内孵育1 0 分钟，甩去多余液 体，不洗。 5 、滴加稀释至1 ：1 6 0 倍的一抗( 兔抗入s 1 0 0 a 4 单克隆抗体) ，置于4 c 恒 温培养箱内过夜，p b s 液冲洗1 分钟2 次。 6 、滴加二抗( 山羊抗兔) ，置于3 7 恒温培养箱内孵育3 0 分钟，p b s 液冲 洗1 分钟x 2 次。 7 、滴加s a b c 试剂，3 7 * ( 2 3 0 分钟，p b s 液冲洗1 分钟2 次。 8 、d a b 显色：使用d a b 试剂盒，取l m l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂各 一滴，混匀后立即加至切片。室温显色，显微镜下控制反应时间( 一般在3 5 分 钟) ，自来水洗涤。 9 、苏木素复染5 分钟，置流水中返蓝3 0 分钟。 l o 、梯度酒精、二甲苯脱水，透明。中性树胶封片。显微镜下观察结果。 ( 四) k i s s 1 染色程序 1 、切片经二甲苯、梯度酒精常规脱蜡至水。 8 2 、滴加3 h 2 0 2 ，置于3 7 恒温培养箱内孵育1 0 分钟以灭活内源性过氧化 物酶。蒸馏水洗3 次。 3 、滴加抗原修复液i ，高温高压修复5 分钟，降至室温，p b s 液洗涤2 分钟 x 3 次。 4 、滴加5 b s a 封闭液，置于3 7 恒温培养箱内孵育1 0 分钟，甩去多余液 体，不洗。 5 、滴加稀释至1 ：8 0 倍的一抗( 兔抗人k i s s 1 单克隆抗体) ，置于4 恒温 培养箱内过夜，p b s 液冲洗1 分钟2 次。 6 、滴加二抗( 山羊抗兔) ，置于3 7 恒温培养箱内孵育3 0 分钟，p b s 液冲 洗2 分钟3 次。 7 、滴加s a b c 试剂，3 7 。c 3 0 分钟，p b s 液冲洗1 分钟2 次。 8 、d a b 显色：使用d a b 试剂盒，取l m l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂各 一滴，混匀后立即加至切片。室温显色，显微镜下控制反应时间( 一般在3 5 分 钟) ，自来水洗涤。 9 、苏木素复染5 分钟，置流水中返蓝3 0 分钟。 1 0 、梯度酒精、二甲苯脱水，透明。中性树胶封片。显微镜下观察结果。 四、结果判定 s 1 0 0 a 4 蛋白以细胞浆细胞核内出现黄色或棕色颗粒为阳性细胞。 k i s s 1 蛋白以细胞膜细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。 每张切片在光学显微镜( n i k o ns m z l 5 0 0 实体显微镜) 下选取5 个高倍视野， 每个视野按下述标准进行评判： a = 阳性细胞百分比： 无，0 分； 5 0 ，3 分。 b = 阳性细胞染色程度： 无显色，0 分；浅黄色，1 分； 黄色或浅棕色，2 分；棕褐色，3 分。 每个视野积分= a x b 。 9 求每张切片5 个高倍视野积分平均值，按照积分高低分为： 3 分，阴性( 一) 3 - - 9 分，阳性( + ) 五、统计学方法 采用s p s s l 3 0 软件进行x 2 检验和s p e a r m a n 相关性分析，检验水准a = 0 0 5 。 结果 l 、在6 0 例b t c c 中，s 1 0 0 a 4 蛋白4 2 例阳性表达，阳性率为7 0 ( 4 2 6 0 ) ， 明显高于在正常膀胱组织中的表达( 阳性1 例，阳性表达率1 0 0 ) ， x 2 = 1 0 6 1 ( p o 0 1 ) ，主要在癌细胞的胞浆内表达，细胞核内也有表达( 附表1 ) 。 2 、$ 1 0 0 a 4 蛋白阳性表达率在组织学分级i 级、i i 级、i i i 级b t c c 中分别为 3 1 3 ( 5 1 6 ) 、6 8 4 ( 1 3 1 9 ) 和9 6 o ( 2 4 2 5 ) ；在非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌中 分别为5 7 1 ( 1 6 2 8 ) 和8 1 3 ( 2 6 3 2 ) ；在淋巴结转移阳性组和阴性组中分别为 8 7 5 0 o ( 2 1 2 4 ) 和5 8 3 ( 2 1 3 6 ) 。s 1 0 0 a 4 蛋白的阳性表达率随肿瘤组织学分级、临 床分期的增高和淋巴结转移的出现而增加，其差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，与病 人性别、年龄无关。( 附图1 4 ，附表3 ) 3 、k i s s 1 蛋白2 6 例阳性表达，阳性率为4 3 3 ( 2 6 6 0 ) ，明显低于在正常膀 胱组织中的表达( 阳性9 例，阳性表达率9 0 0 ) ，x 2 = 5 7 1 ( p 0 0 5 ) ，以细胞膜表达为主 ( 附表2 ) 。 4 、k i s s 1 蛋白的阳性表达率在组织学分级i 级、i i 级、i i i 级膀胱移行细胞 癌中分别为8 1 3 ( 1 3 1 6 ) 、4 7 4 ( 9 1 9 ) 和2 0 0 ( 4 2 5 ) ；在非浸润性膀胱癌和浸润 性膀胱癌中分别为6 4 3 ( 1 8 2 8 ) 和2 5 0 ( 8 3 2 ) ；在淋巴结转移阴性组和阳性组中 分别为5 5 6 ( 2 0 3 6 ) 和2 5 0 ( 6 2 4 ) 。k i s s 一1 蛋白的阳性表达率随肿瘤组织学分级、 临床分期的增高和淋巴结转移的出现而降低，其差异具有统计学意义( p o 0 5 ) ，与 病人性别、年龄无关。( 附图5 8 ，表3 ) 5 、6 0 例膀胱移行细胞癌组织中，二者表达均为阳性的为1 2 例，表达均为阴 性的为4 例，s 1 0 0 a 4 蛋白表达阳性但k i s s 1 蛋白表达阴性的为3 0 例，s 1 0 0 a 4 蛋白表达阴性但k i s s 一1 蛋白表达阳性的为1 4 例。s 1 0 0 a 4 蛋白表达增高时，k i s s 1 表达减低。经统计分析x 2 = 1 2 4 ，p 0 0 5 ，二者在膀胱移行细胞癌中的表达呈统计 1 0 学负相关，相关系数r = - - 0 4 2 。( 附表4 ) 表l ，s 1 0 0 a 4 蛋白在正常膀胱组织及b t c c 组织中的表达关系 表2 ，k i s s 1 蛋白在正常膀胱组织及b t c c 组织中的表达关系 表3 ，s 1 0 0 a 4 蛋白和k i s s 1 蛋白的表达与b t c c 临床病理特征的关系 表4 ，s 1 0 0 a 4 蛋白和k i s s 1 蛋白在b t c c 中表达的关系 ( x 2 = 1 2 4 ，p 0 0 0 5 ，r - - 0 4 2 ) 图1 ，s 1 0 0 a 4 蛋白在正常膀胱组织中的阴性表达( 1 0 x 1 0 倍) 1 2 图2 ，s 1 0 0 a 4 蛋白在膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 x 1 0 倍) 图3 ，s 1 0 0 a 4 蛋白在高分化膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 x 4 0 倍) 1 3 图4 ，s 1 0 0 a 4 蛋白在低分化膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 4 0 倍) 图5 ，k i s s 一1 蛋白在正常膀胱组织中的阳性表达( 1 0 1 0 倍) filljijiljjijilijjjijij 图6 ，k i s s i 蛋白在高分化膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 1 0 倍) 图7 ，k i s s i 蛋白在高分化膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 x 4 0 倍) flifffjjljlfjff ffffjffijififililijif 图8 ，k i s s 1 蛋白在低分化膀胱移行细胞癌中的阳性表达( 1 0 4 0 倍) 讨论 膀胱癌是我国常见的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤l 2 ，在国内无论其发 病率和死亡率均占泌尿系肿瘤的首位，且近年有增加的趋势。虽然针对膀胱癌的 综合治疗已使其5 年生存率有所提高，但是膀胱癌侵袭和转移仍是影响其预后的 重要因素之一。分子生物学研究表明肿瘤细胞的某些基因活性的改变及其表达产 物在肿瘤的发生、侵袭、转移和预后等一系列病理过程中发挥着重要作用。 s 1 0 0 a 4 又称c a p l 、p 9 k a 、c a l v a s c u l i n 等，是1 9 8 9 年由s b r a l i d z e 从高转移 性小鼠乳癌细胞中克隆出来的一种转移相关基因【1 】。1 9 9 2 年克隆了人类s 1 0 0 a 4 基因。该基因位于染色体l q 2 1 ，基因全长2 8 3 7 b p ，编码1 0 1 个氨基酸的蛋白。该 区易发生各种染色体的缺失、易位、重叠等改变，提示s 1 0 0 a 4 蛋白与肿瘤的发 生发展关系密切【2 】。s 1 0 0 a 4 基因的编码产物属于c a 2 + 结合蛋白s 1 0 0 家族的成员， s 1 0 0 蛋白被认为是一组钙离子传感器，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分 化、粘附、运动、基因表达及凋亡过程中发挥重要作用【3 】。研究表明，s 1 0 0 a 4 的表达与人类多种恶性肿瘤细胞的侵袭、转移能力呈正相关，被认为是与肿瘤预 1 6 后密切相关的分子标志物之一 4 5 】。关于s 1 0 0 a 4 蛋白与肿瘤发展的分子机制的 最初证据来源于对具有转移性的鼠细胞系s r - 3 y 1 的观察 6 】。其后的转染实验显 示，啮齿动物及人类的s 1 0 0 a 4 可以诱导无转移性的大鼠乳腺癌细胞系出现转移征 象【7 、8 】。与此相似的，将啮齿动物s 1 0 0 a 4 基因转染入鼠类恶性黑素瘤细胞系b 1 6 1 9 】 和人类乳腺癌细胞系m c f 7 增加了其向肺脏转移的能力。而转染反义s 1 0 0 a 4 基 因，则可以明显降低具有高转移特性的恶性肿瘤细胞系的转移率 1 0 。目前认为， s 1 0 0 a 4 能影响细胞骨架动力学，促进细胞运动；并通过上调c d 4 4 的局部表达， 改变e c m 的结构，影响细胞与e c m 的粘附；增强m m p 的活性，下调其组织抑 制因子t i m p s 的合成；s 1 0 0 a 4 与非肌肉组织的原肌球蛋白和肌球蛋白相互作用， 并调节细胞间粘附结合，当其过表达时，这些作用增强，从而提高瘤细胞的转移能 力；抑制由蛋白激酶c ( p k c ) 介导的肌球蛋白重链磷酸化，导致肌球蛋白聚集受抑， 细胞转移能力增强。可见，s 1 0 0 a 4 通过多种机制，在多阶段促进了肿瘤的侵袭和 转移。 众所周知，同肿瘤的发生一样，癌转移也是一个有规律的步步关联的细胞活 动过程，即所谓的“癌转移的级联反应” 1 1 】。理论上，癌转移级联反应相关事件 包括：基底膜破裂、细胞脱落、细胞运动、侵袭、穿透血管系统、癌细胞进入循 环系统、阻滞、外渗和增殖。在此过程中，是一个多步骤、多基因参与、多阶段 的复杂过程，根据转移进展模型理论，转移是由于转移促进基因和转移抑制基因 失衡导致的结果。为了探讨转移设计的这一机制，本研究检测癌旁组织，癌组织 以及癌周转移组织中的k i s s l 和s 1 0 0 a 4 基因的表达情况，并分析它们与膀胱癌 生物学行为的相关性和临床意义。为恶性肿瘤的诊断与治疗提供新的途径。 本实验结果显示，s 1 0 0 a 4 蛋白在膀胱癌组织中呈阳性表达，主要表达于癌细胞 的细胞浆内，正常膀胱组织表达阴性，且其阳性表达率随膀胱癌病理分级、浸润深度 的增加而升高，有淋巴结转移者表达率高于无淋巴结转移者，与其他研究报道结 果一致，提示s 1 0 0 a 4 可能促进b t c c 的发生发展，可能与其侵袭转移相关。 k i s s l 定位于1 号染色体长臂l q 3 2 q 4 1 区，该基因的初始编码产物是一个由 1 4 5 个氨基酸残基组成的肽链k i s s p e p t i n - 1 4 5 ，缩写为k p 一1 4 5 ( 又称为m e t a s t i n ) 1 2 】。 k p - 1 4 5 经剪切可以生成5 4 、1 0 、1 3 和1 4 个氨基酸残基的较短多肽k p 5 4 、k p 1 0 、 1 7 k p - 1 3 和k p 1 4 ，其共同特点是羧基端为精氨酸一苯丙氨酸- n h 2 ( r f - n h 2 ) 模体，都能 与人类孤儿g 蛋白偶联受体( gp r o t e i n c o u p l er e c e p t o r s5 4 ，g p r 5 4 ) 特异性结合 13 】。 其中k p - 5 4 是k p 1 4 5 的主要生物学活化产物，发挥抑制细胞趋化性，增强成簇黏附 激酶表达和活性的生物学效应 1 4 】。此外，k p 1 0 在生理受体水平上即能增加细胞 内钙离子浓度，这是因为l 印1 0 与其受体的亲和力较其他k i s s p e p t i n s 高3 1 0 倍，而 其他k i s s p e p t i n s 要在k i s s l 受体高表达的水平上才能增加细胞内钙离子浓度 【1 5 1 6 】。国内外的研究显示k i s s l 基因的表达与肿瘤的侵袭力相关 1 7 】。s a n c h e z 等观察了9 个膀胱癌细胞株，发现来源于进展期膀胱癌的细胞株k i s s l 表达水平较 低，膀胱癌中浸润程度越深k i s s l 的表达水平越i l 毛 1 8 】。在可获得随访的一部分膀 胱癌患者中，发现k i s s l 的表达与患者整体存活期有直接的联系，k i s s l 表达越低 患者的生存期越短 1 9 2 0 】。 我们在研究中发现k i s s 1 蛋白的表达阳性率与病理分级、临床分期、淋巴结 转移呈负相关，提示了k i s s 1 蛋白在膀胱癌中是转移抑制分子，与肿瘤的侵袭性 相关。据此可以推测b t c c 的局部浸润和远处转移是由于k i s s 1 蛋白功能缺失所 致。通过本研究可以证实，k i s s 1 作为肿瘤转移抑制基因，在抑制膀胱癌转移中 发挥了一定的作用。根据k i s s 1 基因的生物学功能，它在肿瘤的转移过程中起重 要作用，但其作用机制尚未完全清楚。因此，阐明k i s s 1 抑制肿瘤转移的具体机 制对早期发现膀胱癌是否发生转移有重要意义。今后可以设想应用分子生物学的 方法来检测肿瘤标本或患者血液中k i s s 1 基因的表达情况，合理评估肿瘤的转移 能力，制定完善的临床治疗计划，从而提高患者的生存率和生活质量。通过深入 了解肿瘤转移的生物学行为，人类有可能应用分子手段，改变肿瘤细胞基因遗传 性或纠正基因突变，从而逆转或去除肿瘤扩散转移的恶性行为。 在我们的实验中同样发现s 1 0 0 a 4 和k i s s 1 在b t c c 中的表达呈负相关。所 以我们推测在肿瘤的发展过程中，表达上调的s 1 0 0 a 4 蛋白可能通过抑制k i s s 一1 蛋白的表达促进肿瘤的局部浸润和转移。至于其具体的作用机制如何，尚需要进 一步的研究来探索。二者的联合检测是判断膀胱癌生物学行为，预测其侵袭转移 趋势的有价值的指标。设法阻断s 1 0 0 a 4 蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达， 从而提高k i s s 1 蛋白的表达可能会起到抑制或减缓肿瘤的发展、转移的作用。 1 8 s 1 0 0 a 4 蛋白有望成为膀胱癌抗转移治疗的新靶点，为膀胱癌的治疗提供新的思 路。 结论 l 、s 1 0 0 a 4 蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率高于在正常膀胱组织中的表 达，且随肿瘤组织学分级、临床分期的增高和淋巴结转移的出现而增加，与病人 性别、年龄无关。 2 、k i s s 1 蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率低于在正常膀胱组织中的表 达，且随肿瘤组织学分级、临床分期的增高和淋巴结转移的出现而减少，与病人 性别、年龄无关。 3 、人类膀胱移行细胞癌中，s 1 0 0 a 4 蛋白表达增加，同时伴有k i s s 1 蛋白表 达减少，二者呈统计学负相关。 1 9 本研究创新性自我评价 s 1 0 0 a 4 蛋白因为其在人体免疫，炎症，肿瘤的发生，发展，侵袭，转移等方 面的重要作用而成为近来国际研究的热点。 k i s s 1 蛋白在许多上皮来源肿瘤中的表达显著缺失，众多研究证明其与膀胱 肿瘤的浸润与转移相关 a n d e r s e nk 等在对恶性黑色素瘤中的s 1 0 0 a 4 蛋白和k i s s 1 的表达的研究发 现，两者的表达呈负相关。 目前没有其他学者研究s 1 0 0 a 4 蛋白及k i s s 1 蛋白在膀胱移行细胞癌中的表 达及其相关性分析。 2 0 参考文献 l1a q e r b a e km , a l s n e rj e ta 1 f o c a ls10 0 a 4p r o t e i ne x p r e s s i o ni sa l li n d e p e n d e n tp r e d i c t o ro f d e v e l o p m e n to fm e t a s t a t i cd i s e a s ei nc y s t e c t o m i z e db l a d d e rc a n c e rp a t i e n t s 【j 】e u ru r 0 1 2 0 0 6 q e t ；5 0 ( 4 ) ：7 7 7 7 8 5 2s h e b e tg v ，l a k s h m im s s10 0 a 4 ( m t si ) c a l c i u mb i n d i n gp r o t e i ni nc a n c e rg r o w t h , i n v a s i o n a n dm e t a s t a s i s 叨a n t i c a n c e rr e s ，2 0 0 8 ，18 ( 4 a ) ：2 415 2 4 21 3d o n a t or si0 0 ：am u l t i g e n i cf a m i l yo fc a l c i u m - m o d u l a t e dp r o t e i n so ft h ee f - h a n dt y p ew i t h i n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rf u n c t i o n a lr o l e s 【j 】i n tjb i o c h e mc e l lb i o l ，2 0 0 6 ，3 3 ( 7 ) ： 6 3 7 6 6 8 4 c u i i f ，l i uy k ，p a nb s ，e ta 1 d i f f e r e n t i a lp m t e o m i ca n a l y s i so fh u m a nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l ll i n em e t a s t a s i s - a s s o c i a t e dp r o t e i n s 【j 】jc a n c e rr e sc l i no n c o l ，2 0 0 4 ，13 0 ( 10 ) ： 6 1 5 6 2 2 5k i mt it , k i mh i ，s o u n gy h ，s h a wl a ，c h u n gj i n t e g r i n ( a l p h a 6 b e t a 4 ) s i g n a l st h r o u g hs r ct o i n c r e a s ee x p r e s s i o no fs10 0 a 4 ，am e t a s t a s i s p r o m o t i n gf a c t o r ：i m p l i c a t i o n sf o rc a n c e rc e l l i n v a s i o n 明m o lc a n c e rr e s 2 0 0 9o c t ；7 ( 1 0 ) ：1 6 0 5 1 6 1 2 6i k o m an ，y a m a z a k ih a b ey e ta 1 s10 0 a 4e x p r e s s i o nw i t hr e d u c e de - c a d h e r i ne x p r e s s i o n p r e d i c t s d i s t a n tm e t a s t a s i so fh u m a nm a l i g n a n tm e l a n o