（基础兽医学专业论文）表达裂谷热病毒糖蛋白重组山羊痘病毒的研究.pdf

中：殳摘要 l t j 一r r _ 中又捅芰 裂谷热( r i rv a l l e yf e v e r ，r v f ) 是反刍动物和人共患的一种烈性传染病，可通过虫媒( 库 蚊等) 及直接接触等途径传播，具有传染性强、致死率高、易感动物广泛等特性。r v f 每次 流行均造成巨大的社会经济损失和公共卫生危机。国际兽医局( o i e ) 已将r v f 列为a 类传染 病，也是国际上重要的生物武器研究对象及生物反恐防范对象。r v f 主要流行于非洲，2 0 0 0 年前后蔓延至中东及阿拉伯半岛。近年，南亚地区也有迹象表明存在该病毒的流行。随着全 球化贸易、人员交往快速发展及全球气候变暖趋势的加速，我国面临r v f 等新发传染病的威 胁也越来越严重，急需开展疫苗、诊断监察技术等相关防控技术的研究。 裂谷热病毒( r i rv a l l e yf e v e rv i r u s ，r v f v ) 为布尼安病毒科( b u n y a v i r i d a e l 的p h l e b o v i r u s 属成员，仅一个血清型。囊膜糖蛋白g 是r v f v 的主要结构蛋白及保护性免疫原，由基因组 m 节段编码，翻译后裂解为g n 和g c 两个亚单位。 山羊痘病毒( g o a t p o xv i r u s ，g p v ) 宿主范围明确，主要限于山羊和牛等反刍兽。g p v 基因 组容量大，遗传性稳定，复制非必需区明确，可耐受大片段外源基因的插入、重组和表达， 作为重组病毒载体疫苗不影响流行病血清学监测。 本研究首先以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒( g p v ) 疫苗株为载体，以复制 非必需区t k 基因为插入靶点，通过同源重组，构建了痘病毒晚期启动子p 1l 驱动、内部核 糖体进入位点( i r e s ) 介导的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶基因( g p t ) 和绿荧光蛋白基因( g f p ) 串联表 达的重组病毒r g p v - g p t i r e s e g f p 。在此基础上，进一步构建痘病毒早晚期启动子p 7 5 驱动 r v f v 保护性抗原g 基因片段重组病毒r g p v - g i e r v f v g ( n + c ) ，利用霉酚酸( m y c o p h e n o l i ca c i d ， m p a ) 药物筛选后，经p c r 、w e s t e r n b l o t 和i f a ( 间接免疫荧光) 方法证实g 蛋白在重组病 毒中稳定表达，并被有效裂解为g n 和g c 两个皿单位，重组病毒具有良好细胞生长特性。 本研究为r v f 重组山羊痘病毒活载体疫苗的研制奠定了坚实的基础。 关键词裂谷热病毒：囊膜g 蛋白；重组山羊痘病毒 v r e c o m b i n a n tg o a t p o x v i r u se x p r e s s i n gt h e g l y c o p r o t e i no f r i f tv a l l e yf e v e rv i r u s a b s t r a c t t h er i f tv a i l e yf e v e rv i r u s ( r v f v ) ，b e l o n g i n g t ot h eg e n u sp h l e b o v i m s ，f a m l l yb u n y a v i r l d a e c a nb et r a n s m i t t e dt 0h u m a n sa n dr u m i n a n t sb ys e v e r a l a r t h r o p o d s ，a l t h o u g hm o s q u l t o e s o tt h e 2 e n e r aa e d e sa n dc u l e xa r ec o n s i d e r e dt ob et h em o s tc o m m o n v e c t o r so ft h ed i s e a s e h u m a n 二f e c t i o n sm a ya l s or e s u i tf r o mc o n t a c tw i t ht h e t i s s u e s a n d b o d yf l u i d so fm f e c t e dr u m m a n t s d u r i n gs l a u g h t e r o rt h e a b o r t u so fi n f e c t e da n i m a l s _ l i la n i m a l s ，r v wi n 曲1 m 0 5 0 0 麓 m o r t a l i t ya m o n gy 。u n ga n i m a l s a n d ah i g hr a t e o f a b o n 0 n ng r a v mf e m a l e s r v f v w a ，sf o u n ：! t h r o u g h o u ta f r i c a ，a n d c i r c a2 0 0 0y e a r ss p r c a d t ot h em i d d l ee a s ta n d 舢曲h 胛锄m 鲫1 8 0 、! f 0 u t b r e a k sa r e c h a r a c t e r i z e db ye c o n o m i c a l l yd i s a s t r o u s “a b o r t i o ns t o r m s ”a n d p u b l 沁h e a l t hc r l s l s b e c a u s eo f9 1 0 b a lc o m m e r c e ，h u m a n st r a v e lf r e q u e n t l y a n dg l o b a lw a n n n gt r e n d a c c e l e r a t e d ： f a c i n gt h ei n f e c t i o u sd i s e a s e sl i k er v ft h r e a t e n e d ，i t i s i m p o r t a n tt od e v e l o pm o r ee e n ta n d s a f e rr v f vf o rt h ep o t e n t i a lp a n d e m i ci nc h i n a - r v f vh a s0 n i yo n es e r o t y p e t h es u r f a c eg l y c o p r o t e i n ( g ) i s t h em o s ti m p o r t a n ts t r u c t u a 1 p r o t e i nt oi n d u c ep r o t e c t i r en e u t r o l i z a t i o na n t i b o d y g p r o t e i ni se n c o d e d b ym s e g m e n ta n d ：l e a v a g e si n t og n a n dg cs u b u n i ta f t e rt r a n s l a t i o n ， g o a t p o xv i r u s ( g p v ) ，a n o t h e rm o s ti m p o r t a n tp a t h o g e n f o rd o m e s t i c 枷m a i ，h a st h e l l m j 。 h o s tr a n g ea m o n gr u m i n a t e s ，m a i n l yg o a t ，s h e e pa n dc a t t l e g p vh 弱a1 a r g e 锄d s t a b l ed 竺- s t 胁d n ag e n o m e ，a b o u t15 0 k b g p vg e n o m e c a nt o l e r a n c et h ei n s e r to f f o r e i g ng e n eu p t o2 5 k b b u ts t i l lr e t a i nr e p l i c a t i o na n di n f e c t i v i t y t h ea t t e n u a t e d l i v ev a c c i n eo fg p vh a sw i d e i yb e e nu s e d t oc o n t r o lg o a t p o xi nd o m e s t i ca n i m a l s 1 nt h i ss t u d y ，ar e c o m b i n a n tg p v v a c c i n es t r a i ne x p r e s s i o ngp r o t e i no fr v f v w a sg e n e r a t e d w ec h o s et kg e n e ，t h en o n e s s e n t i a lr e g i o nf o rv i r u sr e p l i c a t i o n ，a st a r g e t s i t et oi n s e nf o r e l g ng e n e s b yh o m o l 0 9 0 u sr e c o m b i n a t i o n ，w ec o n s t r u c t e d ar e c o m b i n a n tg p v b a r n e 懿r g p v - g i e - r v f v - g ( n + c ) t 二er e c o m b i n a n tv i r u se x p r e s s e sr e p o r t e rg e n eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) a n dp r e s s u r e s e 1 e c ： g e n ex a n t h i n e - g u a n i n ep h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e ( g p t ) u n d e r t h ec o n t r 0 1 甜p l1 e p m 0 伧。篓 t h egp r o t e i nu n d e rt h ec o n t r o io fp 7 5e a r l y l a t e p r o m o t e r t h ee x p r e s s l o n a n d c l e a v a g ：c ：t u p r o t e i 0w a sc o n 矗r m e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dw e s t e r n - b l o t t h i s r e c o m b n a n 。g p vw n lb ea ：) o t e n t i a lv a c c i n ec a n d i d a t ef o rt h ec o n t r o lo fr v e k e yw 。r d sr i f tv a i l e yf e v e rv i r u s ；g l y c o p r o t e i n ；r e c 。m b i n a n tg o a t p 。x v i m s v i l 研究生学位论文独刨声明和使用授权幅 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师步志高研究员指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 逵! 垫逡查墓丝量墓鳖型主盟的! 奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 红喃 日期：舯年月倦日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、，汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：害每葫 日期：年月日 导师签名： 色南 日期：年月日 引苦 1 引言 1 1 研究的目的和意义 裂谷热( r i f tv a l l e yf e v e r ，r v f ) 、山羊痘( g o a t p o x ，g p ) 、牛瘟( r i n d e r p e s ，r p ) 、肿皮病 ( l u m p ys k i nd i s e a s e ，l s d ) 及小反刍兽疫( p e s t ed e sp e t i t sr u m i n a n t s ，p p r ) 均为国际兽医局 ( o l e ) 认定的a 类传染病，主要流行于非洲、中东等牛羊养殖业发达的地区，给牛、羊及反 刍兽的生产造成了巨大的经济损火( c a mv m ，1 9 9 3 ；b o s t o c ke ta l ，1 9 9 6 1 9 9 9 ；l e f e v r ee ta l ， 1 9 9 0 ) ，其中裂谷热为人畜共患疫病，具有重人的公共卫生意义。 r v f 是反刍动物和人共患的一种烈性传染病，可通过虫媒( 库蚊等) 及直接接触等途径 传播，具有传染性强、致死率高、易感动物广泛等特性。r v f 每次流行均造成巨大的社会经 济损失和公共卫生危机。o i e 已将r v f 列为a 类传染病，生物安全i i i 级，是国际上重要的生 物武器研究对象及生物反恐防范对象。 裂谷热病毒( r i f tv a l l e yf e v e rv i r u s ，r v f v ) 为布尼安病毒科( b u n y a v i r i d a e ) 的p h l e b o v i r u s 属成员，仅一个血清型。囊膜糖蛋白g 是r v f v 的主要结构蛋白及保护性免疫原，由基因组 m 节段编码，翻译后裂解为g n 和g c 两个亚单位。 r v f 主要流行丁非洲，2 0 0 7 年9 月裂谷热疫情首次出现在非洲以外地区，沙特阿拉伯( 南 部的加赞地区) 和也门报告确诊病例，在原来没有该病的阿拉伯半岛也发生了流行，直接威 胁到邻近的弧洲及欧洲地区。随着全球化贸易、人员交往快速发展及全球气候变暖趋势的加 速，我国面临r v f 等新发传染病的威胁也越米越严重，急需开展相关疫苗、诊断监察技术等 防控技术的研究，作为应对外米新发重大烈性传染性的前瞻性技术储备。 传统的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗。目前针对r v f 研制弱毒疫苗s m i t h b u r n ，可引起流 产等严重副作用( w a l l a c ee ta l ，2 0 0 6 ) ，仅限于疫区高危人群和音群；组织灭活疫苗 t s i g s d 2 0 0 具一定保护效果( p h i l l i pe ta l ，2 0 0 0 ) ，但生产过程生物安全要求高，成本昂贵， 尤其在r v f v 非流行地区，引进全病毒灭活疫苗和弱毒疫苗存在严重的生物安全隐患。然而 随着现代生物学技术的发展，重组d n a 病毒疫苗的研究不断深入。重组d n a 病毒疫苗主要 是将抗原基因克隆到经过遗传修饰的痘病毒和腺病毒载体上而制备的重组d n a 病毒疫苗 ( s t e p h e n s o n ，2 0 0 1 ：s u n e re ta l ，2 0 0 3 ；t a t s i se ta i ，2 0 0 4 ) 。痘病毒( p o x v i r u s ) 作为基因重组活疫苗 的载体，不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可刺激机体产生免 疫应答，不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导很强的细胞免疫。其中羊痘病毒( c a p r i p o xv i r u s ， c p v ) 作为复制缺陷型载体，已经用于表达反刍和非反刍动物病毒基冈的一些蛋白，例如表达 了狂犬病毒糖蛋白，以及牛瘟重组疫苗( a s p d e ne ta l ，2 0 0 3 ) 。 山羊痘病毒( g o a t p o xv i r u s ，g p v ) 作为活病毒载体研制双价或多价疫苗有着明显的优势 ( b e r h ee ta 1 2 0 0 3 ；d a v i de ta l 。2 0 0 5 ) 。g p v 宿主范围仅限于牛、羊及小反刍兽，对人类不具 感染性和致病性，以g p v 作为疫苗载体并不会引入新的病毒；表达病毒保护性抗原的重组 g p v 不但可以有效防制病毒感染，而且不会干扰这些传染病常规血清学监测；重组g p v 成 本低、可冻干、储运无需低温、不需昂贵的设备和高技术人员。因此，研制重组山羊痘病毒 活载体疫苗策略在安全性及制造成本上具有显著优势和良好的应用前景。 东北农业大学农学硕f 论文 我国目前使用的c p v 疫苗是1 9 5 8 年沈荣显等将分离的山羊痘病毒太原株( c v c cn o a v 4 1 ) 经过鸡胚传代弱化的弱毒苗，已经在我国广泛应用数十年，其安全性和有效性得到充 分证明。本研究以该毒株为载体，构建了表达裂谷热病毒保护性免疫原囊膜蛋白的重组山羊 痘病毒，为r v f 重组山羊痘病毒活载体疫笛的研制奠定了坚实的基础。 1 2 裂谷热概述 裂谷热( r i f tv a l l e yf e v e r ，r v f ) 是反刍动物和人共患的一种烈性传染病，流行于非洲 反刍动物( d a u b n e ye ta l ，1 9 3 3 3 4 ) 。本病由白蛉热病毒属布尼病毒引起( b i s h o pe ta l 。1 9 8 0 ) ， 只有一个血清型，经蚊传播，多发丁蚊虫活动季节，病变特征为肝损伤( d a u b n e ye l ：a l 。1 9 3 1 ) 。 本病对绵羊、山羊、牛的危害较为严重，可引起怀孕动物流产和新生畜高度死亡，大龄非怀 孕动物也较易感，但临床抗病性较强。动物的易感性与其本身的遗传差异有关，来自非洲以 外及r v f 非流行地区的动物对本病较易感。骆驼对r v f 可发生隐性感染，但流产率和牛一样 高( p e t e r se ta l ，1 9 9 4 ) 。 人对r v f 易感，可通过处理感染性材料接触或通过蚊虫媒介叮咬感染。在一些动物宿主 较少的国家，通过媒介蚊虫叮咬感染人是其显著特征，在这样的地区首先可能会在人群中发 现r v f 。r v f 可引起实验室工作人员的严重病症( f r a n c i se ta l ，1 9 3 5 ：s m i t h b u me ta l ，1 9 4 9 ) ， 处理病料时应备有高级别生物防护设施。 1 3 裂谷热病毒概述 1 3 1 裂谷热病毒分类及种群 裂谷热病毒( r i f tv a l l e yf e v e rv i r u s ，r v f v ) 隶属布尼安病毒科( b u n y a v i r i d a e ) 白蛉热病毒 属( p h l e b o v i r u s ) ，该属包括白蛉热病毒群和吴孔尼米( u u k u n i e m i ) 病毒群( m u r p h ye ta l ，1 9 9 5 ) 。 白蛉热病毒群分为7 个亚群( c o m p l e x ) ：布加鲁( b u j a r u ) q f _ 群，有两种病毒；坎第鲁( c a n d i r u ) 亚群，有6 种病毒；智力波( c h i l i b r e ) 亚群，有2 种病毒；弗雷约斯( f r i j o l e s ) 亚群，有2 种病毒：布塔托罗( p u n t at o r o ) 亚群，有2 种病毒；裂谷热群，有5 种病毒，其中以r v f v 最为常见；萨勒哈巴德( s a l e h a b a d ) 亚群，有4 种病毒；此外还包括一类尚未归入弧群的1 6 种病毒( s a i le ta l ，1 9 9 7 ) ，本群至少有3 9 种病毒。吴孔尼米病毒群有1 2 种病毒。由丁本属的 许多病毒分离自白蛉，故而得名。同属的病毒均有相同的交叉补体结合反应抗原，而有不同 的中和反应抗原，此属的分群是以交叉中和试验结果进行的( 殷震等，1 9 9 7 ) 。 1 3 2r v f v 形态特征 病毒粒子有囊膜，多形( 类球形) ，直径8 0 1 2 0 n m ，表面有清楚的糖蛋白突起，突起 直径长1 0 一- 2 0 n m 。基因组为单链负义r n a ，包含三个节段，分别为l 、m 、s ，每个节段都 由独立的核衣壳包裹。( 见图1 1 、1 2 ) 2 h11r v f vi b 镜照片( i m a g e c o u r t e s y , csg o l d s m l t hmd b o w e na n d l ：gk s i a z e k ) f i g i - 1 e l e c t r o nm i c r o s c o p ep i c t u r eo f r v f v 圈12r v f v 结构模式l 刳 f i g 1 - 2s t r u c t u r a lp a t t e r np i c t u r eo f r v f v 133r v f v 基因组结构 r v f v 基组由单股负链r n a 组成。有大( 1 a r g e ) 、中( m e d i u m 、小( s m al 1 ) 3 种分f ，其 丹于昔分别为2 3 27 x 10 6 、i3 17 x 1 0 6 、05 06 x 】0 6 ，分别与核衣壳蛋白( n ) 构成螺旋状 核农壳。病毒互补的lm r n a 编码稿西r n a 依赖的r n a 聚合酶；mm r n a 具有十连续 的阅读框架，编码多聚蚩门前体，艄译后修饰过程中分裂成o n 、g c 两个糖蛋白及1 4 k d 、 7 8 k d 两个非结构蛋白( n s m ) ，sh 段届职义r n a ，编6 5 非结构蛋hn s s 和核收壳蛋白n 。 由丁病毒的糖蛋n 在病啦感染和致病性j 有其特殊的作用，而g n 、g c 糖蛋白的基因存在r m - r n ah 此，人们对m r n a 研究的较深入。 研究表明，每个r n a 基因片段3 术端核苜酸序列基本足稳定的。s 片断3 + 末端核t 艘序列足( 37 ) 一u g u g u u u c g g ，而l 自i m 片断3 束端核苗酸序州是( 3 7 1 u g u g u u u c u g ， 这些序州or l 岭病母属萁它病奄娄似。粮据r n at i 寡桉甘酸指纹表明，r v f vl 婀f m 片断 笄行有独自的序列。试验证实，糖蚩i - io n 的n h 2 端氯基酸序列为：( n h ，) 一x x - c l u l e u - l i e - a l a ( x 为还术确定的残基) ，而糖蛋白g c 的是：( n h ，) 。g l u a s p - p r o h i s - l e u - a r g a s h ar g - p r o g l y l y s g l y 。 1 34 r v f v 理化特性 r v f v 能“冻结战诛十状态r k 崩存活舟p i i7 一一8 司域为稳定。i i i i 清中的r v f v4 存活4 个j ，o 以、可仃活8 年。能抵抗o5 帕钉嵌醛哒6 个h 5 6 c4 0 m i n 才能使之火 活。玖氯酸钙，钠( 残氯舍m 不低丁5 0 0 0 p p m ) 、p h 小r62 帕醢澈、0 i 的恫a ：马林等c 佳 其灭活，其中p h3 时能迅谜k 活。此外r v f v 对已醚和土氧胆酸盐j i ! ( 嬉。( 殷楗等，19 9 7 ： o i e ) 135r v f v 血凝特性 r v f v 能凝集in 龄雏鸡n 0 红细胞，也能凝集小鼠、豚鼠目 f 自a 刑红细胞血凝素可 川丙酮一乙醚抽提浊由感染组织( 删) 制备。感懿组缎的乳删也常具较高的血凝特r 十，血凝 东北农业大学农学顾十论文 最适条件是p h6 5 和2 5 f 殷震等，1 9 9 7 ) 。 1 3 6l w f v 抗原性 糖蛋白对于布尼病毒在高尔基体内的成熟具有重要作用，g n 和g c 蛋白参与高尔基体 的定位过程。研究表明，g n 蛋白c 端的4 8 个氨基酸部位( 包括2 0 个氨基酸的跨膜区域和邻 近的蛋白c 末端2 8 个氨基酸) 就是r v f v 的高尔基体定位信号，而g c 蛋白则通过物理作用 与g n 蛋白相结合从而定位于高尔基体( g e r r a r de ta l ，2 0 0 2 ) 。n 蛋白是r v f v 主要的免疫原， 能刺激机体产生补体结合抗体( 殷震等，1 9 9 7 ) ，而病毒表面的g n 和g c 蛋白含有中和表位， 也z 日* 匕b 刺- 激机体产生抗体( f l i c ke ta l ，2 0 0 5 ) ，但在体内主要由g n 刺激机体产生中和抗体。研究 者利用单克隆抗体定位了g n 糖蛋白含有的4 个抗原决定簇，其氨基酸序列分别为if 1 0 5 1 3 8a a ) 、i i ( 2 2 9 - - - 2 3 9a a ) 、h i ( 3 6 2 - - 一3 7 5a a ) 、i v ( 1 2 7 1 4 6a a ) 。表位i 、i i 、为中和表位， 而表位i 为非中和表位。其中，抗原决定簇与构象有关，蛋白经s d s 变性后不能与相应的 单克隆抗体i v 反应。( k e e g a ne ta l ，1 9 8 6 ) 从不同地区分离的病毒的毒力不同，抗原性也略有不同。目前还未发现r v f 病毒的分离 株和实验室传代株的特异性抗原差异，但已证明各病毒株的致病性存在差异( s w a n e p o e ie ta l 。 1 9 8 6 ) 。 1 3 7r v f v 复制过程 r v f v 进入机体后的主要增殖场所有肝、脾及脑特别是流产胎畜和新生幼畜的脑内。 r v f v 复制的全过程均在细胞浆内进行，主要包括以下步骤：( 至) r v f v 糖蛋白介导病毒与细 胞受体结合；进入、脱囊膜，包括细胞对病毒粒子的吞噬作用和病毒囊膜与细胞膜的融合 过程：在病毒相关的聚合酶作用下，以宿主细胞核酸为引物，病毒基因组为模板，转录病 毒互补的m r n a ；游离核糖体翻译s 和l 的m r n a ，结合在膜上的核糖体翻译m 的m r n a 和新生囊膜蛋白的糖基化，蛋向质前体再裂解成g n 、g c 及n s m ；以病毒互补的全长r n a 为模板，合成病毒基因组；基因组r n a 的复制；第二次转录包括生产各种m r n a ；g n 和g c 在高尔基体内积累，末端糖基化，获得经过修饰的宿主膜，出芽进入高尔基体池； 胞质小囊与胞浆膜融合，释放出成熟的病毒粒子。( p e t t e r s s o n ，1 9 9 6 ) 1 3 8r v f v 遗传变异 a a s a i l 等对3 8 年期间1 8 株来源于不同宿主的r v f v 病毒n s s 蛋白编码基因同源性分 析表明在核营酸水平上0 - 、9 6 变异；氨基酸水平上o 9 5 变异。根据对n s s 蛋白编码区 进行序列分析，其系统发育进化树可将r v f v 分为两个不同谱系，一个是埃及的，另一个是 撒哈拉的。总的来说，r v f v 在其传播过程中变异不大。( s a i le ta l ，1 9 9 7 ；s a i le ta l ，1 9 9 9 ；t r e v o r e ta 1 2 0 0 2 ) 、 1 3 9r v f v 传播媒介与传播途径 r v f 是虫媒传染病，蚊子( 包括按蚊、库蚊、伊蚊等，其中伊蚊是其主要的保存宿主和 载体) 是其主要的传播媒介。研究发现，传播r v f v 的蚊子种类常随地区变迁而不同。r v f v 4 引言 可在伊蚊体内长期存在，不仅可通过叮咬易感动物和人类传播r v f v ，而且可将r v f v 传给 下一代虫卵，使孵化新生的蚊虫仍具传播病毒的能力。伊蚊虫卵可在干旱等不适宜孵化的条 件下存活数年。因此，r v f 的暴发一般发生于温暖、潮湿的雨季，具明显的季节性。此外， 白蛉、蠓等叮咬昆虫也参与传播本病。( g a r g a ne ta l ，1 9 8 4 ；t u r r e le ta l ，1 9 8 5 ；g a de ta l ，1 9 8 7 ； g a r g a ne ta l ，1 9 8 8 ；j u p pe ta l ，1 9 8 8 ；l o g a ne ta l ，1 9 9 1 ) r v f v 一旦在某一地区出现，几乎就再 也不可能被清除。 人类感染r v f 除直接被带毒蚊虫叮咬外，接触感染材料经呼吸道感染也比较常见，尤其 是实验室工作人员、放牧者和兽医等经常接触病畜、病料的人群。在尼日利亚，经常接触家 畜和野生动物的工作人员体内有高水平的裂谷热抗体( 较之其他人员) ，这说明，裂谷热病毒 在流行地区呈低水平状况在家畜和野生动物之间传播。( o i e ；m e b u s ，1 9 9 8 ) 1 3 1 0r v f v 宿主 r v f v 宿主极为广泛，除人之外，目前已从中分离到r v f v 的动物有：牛、山羊、绵羊、 骆驼、水牛、白犀牛、蝙蝠，鹿、狗等。禽类、马和猪似乎对r v f v 有一定的抵抗力，但也 曾有人从马血液中分离到一株r v f v ( 殷震等，1 9 9 7 ) 。 1 3 1 1r v f v 血清学试验 中和试验包括微量中和试验( x r n ) ，蚀斑减少中和试验( p r n ) ，小白鼠中和试验，主要用 于检查不同动物血清中的r v f 病毒特异性抗体。中和试验特异性高，可检查畜群早期感染， 但只能用活病毒进行试验，不适合疫区外使用。( o i e ；b a r n a r de ta i ，2 0 0 0 ) 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 、血凝抑制试验( h i ) 、琼脂凝胶免疫扩散试验( a g i d ) 、免疫荧 光试验、放射性免疫检测试验、补体结合试验，均可用于检测r v f ，这些检测结果与白蛉热 病毒属的其他血清型有交叉性，这些试验可用灭活抗原进行，可用于无r v f 国家。( o i e ；c l a r k e e ta l ，l9 5 8 ；p a w e s k ae ta l ，l9 9 5 ；n i k l a s s o ne ta l ，19 8 4 ；m e e g a ne ta l ，19 8 7 ) e l i s a 具有较高的可靠性和灵敏度，可利用儿种抗原检测r v f 特异性抗体。有一种l g m 捕获e l l s a ，可用一份血清样品诊断出新近感染。( p a w e s k ae ta l ，2 0 0 3 ；j a n u s ze ta l ，2 0 0 3 ) h l 试验可用于r v f 非流行地区，先期感染白蛉热而非r v f 血清群的动物血清，与r v f 抗原反应滴度可达4 0 ，少数可达3 2 0 。r v f v 疫苗免疫后，h l 抗体滴度可达6 4 0 ，少数可达 1 2 8 0 ，自然感染r v f v 时，h 1 滴度通常更高。尽管h l 的特异性稍逊，但它适于检测之用。 各种白蛉热病毒之间发生明显的交叉反应，但同源病毒滴度高于异源病毒。据实验，r v f 以 外的各种白蛉热病对反刍动物不致病，它们激发的抗体不致造成r v f 诊断中的混淆。 ( s w a n e p o e le ta l ，19 8 6 a - b ) 1 3 1 2r v f v 分子生物学研究进展 r v f v 分子生物学研究进展相对于同属成员布塔托罗病毒来说较为缓慢，因为布塔托罗 病毒不感染人，但对小鼠能产生致死性攻击，所以该病毒被作为白蛉热病毒属模型病毒研究 颇深。r v f v 病毒各种蛋白研究相对较多的是糖蛋白和n s s 蛋白。 由于布尼病毒缺乏基质蛋白，所以糖蛋白对病毒粒子的成熟和释放具有重要作用。研究 5 东北农业人学农学硕f j 论文 发现，r v f v 、吴孔尼米病毒、布塔托罗病毒的高尔基定位信号均存在于g n 内部，但精确定 位信号区域却各不相同。r v f v 定位信号区域由g n 跨膜区2 0 个氨基酸残基和毗邻的胞浆尾 2 8 个氨基酸残基共4 8 个氨基酸残基组成，而吴孔尼米病毒定位信号区域仅包含胞浆尾氨基 酸残基，布塔托罗病毒定位信号区域包括跨膜区和毗邻的胞浆尾各1 0 个氨基酸残基。白蛉热 病毒属的所有成员的g c 羧基末端都有赖氨酸为基础的内质网再现信号，冈此，g c 能定位于 高尔基体完全是由丁和g n 通过物理作用结合所致。也就是说，当以多元蛋白前体的形式共 同表达g n 、g c 时，二者均能定位至高尔基体，g n 单独表达可以定位至高尔基体，但当g c 单独表达时只能定位于内质网。( a n d e r s s o ne ta l ，1 9 9 7 ；a n d e r s s o ne ta l ，1 9 9 8 ；c h e ne ta l ，1 9 9 l ； g l e e s o n ，1 9 9 8 ；m a t s u o k ae ta l ，1 9 9 4 ；m a t s u o k ae ta l ，1 9 9 6 ；m e l i ne ta l ，1 9 9 5 ；r o n n h o l m ，1 9 9 2 ； w a s m o e ne ta l ，19 8 8 ；s o n j ae ta l ，2 0 0 2 ) 非结构蛋白n s s 在病毒感染过程中的具体作用仍然不清楚，但可以肯定的是它与病毒毒 力有关，能抑制宿主机体干扰素a p 的产生，使病毒逃避宿主抗病毒机制的作用。( k o h le ta l ， l9 9 9 ；y a d a n ie ta l ，l9 9 9 ；v i a l a te ta l ，2 0 0 0 ；b i l l e c o c qe ta l ，2 0 0 0 ；a n n ee ta l ，2 0 01 ；m i c h ee ta l ， 2 0 0 1 ；a g n ee ta l ，2 0 0 4 ) 1 3 1 3r v f 在历史上的主要流行情况 r v f1 9 1 2 年最先报道于肯尼亚，1 9 3 0 年在研究东非裂谷地区绵羊发生的一次的暴发性 疾病过程中分离到该病病原体，故而得名。 1 9 5 0 1 9 5 1 年肯尼亚暴发r v f 引起1 0 0 ，0 0 0 只羊的死亡，2 0 ，0 0 0 人感染。 1 9 7 7 年埃及暴发r v f ，疑是由苏丹传入，2 5 5 0 的羊、牛、骆驼感染，2 0 0 ，0 0 0 人感染， 1 8 0 0 0 人被确诊，5 9 8 人死亡，有些地区感染率高达3 5 。1 9 9 3 年二次暴发本病。 1 9 9 0 1 9 9 1 年马达加斯加岛暴发r v f 。 1 9 8 7 年毛里塔尼皿暴发r v f 造成2 0 0 多人死亡。1 9 9 8 年再次暴发。 1 9 9 7 1 9 9 8 年肯尼弧、索马里、坦桑尼亚暴发r v f ，3 0 0 多人死亡。 2 0 0 0 2 0 0 1 年也门和沙特阿拉伯暴发r v f ，2 0 0 多人死亡。 2 0 0 3 年8 月2 4 日w h o 疫情快讯报道埃及流行r v f 已造成3 7 人死亡。 2 0 0 6 年1 2 月1 9 日至2 0 0 7 年2 月2 0 日，在索马里共报告1 1 4 例裂谷热，包括5 1 例死 亡( 病死率4 5 ) 。 2 0 0 6 年1 1 月3 0 日至2 0 0 7 年3 月1 2 日，在肯尼亚共报告了6 8 4 例裂谷热，包括15 5 例 死亡( 病死率2 3 ) 。 2 0 0 7 年1 月1 3 日至5 月3 日，在坦桑尼弧共报告了2 6 4 例裂谷热，包括1 0 9 例死亡( 病 死率4 1 ) 。 2 0 0 7 年9 月，沙特阿拉伯卫生部报告2 9 1 例中，死亡6 4 例。 2 0 0 7 年9 月至1 0 月9 日，也门卫生部报告发病3 2 l 例，死亡3 2 例。 从r v f 的流行情况来看，找不出流行间隔规律，通常流行在非洲，在同一时间涉及一个 地区的几个国家。这些情况伴随着特大降雨的周期循环，较少发生于半干旱区( 3 0 - 3 5 年的 周期) ，或较频繁地( 3 1 0 年周期) 发生在较人雨量的草原区。并且在非洲以外的地区出现 流行。 6 , - j i 言 1 3 14 疫苗 自r v f 出现以来，虽然从未间歇针对本病疫苗的探索研究，但所研制出的疫苗综合效果 均不佳。目前普遍应用的弱毒疫苗是经小鼠和鸡胚连续传代而育成的。其中以小鼠脑内适应 毒( s m i t h b u r n 株，嗜神经毒株) 的效果最好，接种后6 7 天产生免疫力，免疫保护期长达3 年。已j “泛用于绵羊、山羊、牛、骆驼的免疫预防。此疫苗的缺点是副作用大，用丁妊娠母 羊引起流产，用于人则导致发病。人用疫苗主要为由猴肾细胞培养的冻干福尔马林灭活苗， 免疫期长达1 8 个月，但该疫苗生产过程需要很高的生物防护，大量生产不太可能。目前只用 于兽医、实验室 ：作人员等高危人群。 近儿年研究的另外两株弱毒苗m p l 2 和c i o n e l3 据说对孕畜和哺乳期幼畜有保护作用且 无不良反应，但尚在研究当中，缺乏田间试验，未正式投入生产使用。m p l 2 来自丁z h 5 4 8 株( 1 9 7 7 年埃及暴发r v f 分离株) ，经诱变剂5 氟尿嘧啶压力筛选1 2 代致弱，故称作m p l 2 。 c l o n e l 3 分离自1 9 7 4 年中非暴发r v f 时一轻症患者。该毒株1 0 6 p f u 感染小鼠和豚鼠不引起 临床症状，而且具有很好的免疫原性，能提供长期的免疫保护。 基因工程重组疫苗作为现代分子生物学和分子免疫学的一个主要发展方向，在各种疾病 的免疫预防方面发挥越来越大的作用。其中针对r v f v 的基因工程疫苗的研究也在不断深入。 例如c o l l e t 等人在痘苗病毒中表达r v f v 的g n 和g c 糖蛋白，免疫小鼠后产生很高的中和 抗体，能够起到有效地保护作用( c o l l e te ta l ，1 9 8 7 ) 。d a l r y m p l e 等人也做了相关的研究并获得 相似的结论( d a l r y m p l ee ta l ，1 9 8 9 ) 。但是，他们利用的都是痘苗病毒作为载体，痘苗病毒的宿 主范同广泛，因此需要寻找宿主范围小的痘病毒作为载体。r l s d v - r v f v 重组疫苗就是利辟j 肿皮病病毒作为载体研制的，将这种病毒免疫羊，可以预防绵羊痘和肿皮病两种疫病( w a l l a c e e ta 1 2 0 0 6 ) 。 1 4 山羊痘病毒概述 1 4 1 山羊痘概述 山羊痘( g o a t p o x ) 是由山羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病。以发热、呼吸困难、 流黏液性或脓性鼻液及在皮肤黏膜出现痘疹为特征。该病发病率高、传播迅速，严重威胁养 羊业的发展( 张延龄等；k a p l a n ，1 9 8 9 ) 。o i e1 9 9 7 年将该病列为a 类疫病之一，在我国山羊痘 也被列为一类疫病( w i t t e ke ta l ，1 9 8 0 ) 。 1 4 2 山羊痘病毒载体的优越性 山羊痘病毒( g o a t p o xv i r u s ，g p v ) 是o i e 指定的1 5 种a 类传染病之一，宿主范同明确， 主要为山羊、绵羊和牛等反刍兽，对其他哺乳动物不形成复制性感染。其弱毒苗已经被广泛 应用于绵羊痘和山羊痘的防制，以g p v 作为疫苗载体不会引入新的病毒。g p v 对人类不具 有感染性和致病性，使用起来比较安全。山羊痘病毒是痘病毒科的重要成员，基冈组结构背 景明确，具有高度的遗传稳定性，对外源基冈插入耐受性强。痘病毒基因组容易组装，可以 允许大片段的基因丢失或删除，至少可容纳k 达2 5 k b 的外源片段而不丧失感染力。 7 东北农业人学农学硕i ：论文 痘病毒接种一次就能获得k 期的免疫效果，既可引起细胞免疫又能引发体液免疫，能诱 导抗外来抗原的抗体和细胞毒性t 细胞的反应。因为g p v 的弱毒疫苗株具有良好的免疫原 性，在我国已经被广泛用于绵羊痘和山羊痘的预防。另外，由于重组d n a 病毒疫苗只含有 病原微生物特定的抗原成分，可以用来区别野毒感染的动物和重组疫苗免疫接种的动物。痘 病毒冻干苗较其他病毒稳定，保存费用低，容易进行生产和使用，易于保藏和运输，并且使 用不需要佐剂和纯化。羊痘病毒以及痘病毒科的其他成员在自然界中很常见，存在于细胞浆 中，利用病毒编码的聚合酶进行病毒的复制和转录。因此，没有必要担心痘病毒的基冈组会 整合到宿主细胞的基因组中。 1 5 本论文主要研究内容 r v f v 囊膜糖蛋白g 翻译后裂解为g n 和g c 两个亚单位。g n 和g c 介导病毒与宿主细 胞受体结合及膜融合，在病毒侵入过程中发挥关键作用。g n 、g c 与n 为病毒主要抗原蛋白， 其中g n 是诱导中和抗