（内科学专业论文）间断高糖对人视网膜色素上皮细胞分泌vegf的影响.pdf

目录 删删| i | i | f i | | f f 忡佃 y 19 0 0 9 b 博。 中文摘要1 英文摘要”j 4 研究论文间断高糖对人视网膜色素上皮细胞分泌v e g f 的影响 前言一一“”“8 日i j 舌一”“”“”“”“”“”一一6 材料与方法”8 结果”一”一1 4 附图1 6 附表1 7 讨论“18 结论“”一”“一“”2 2 参考文献2 3 综述v e g f 与糖尿病慢性血管并发症的研究进展2 6 致谢”一“一一”一一3 6 个人简历3 7 中文摘要 间断高糖对人视网膜色素上皮细胞分泌v e g f 的影响 摘要 目的：随着人们生活方式的改变及人类寿命的延长，糖尿病的发病率 日益增高，来自中国2 型糖尿病防治指南2 0 1 0 年版讨论稿的数据显 示：目前我国糖尿病患者总体发病率已达9 7 ，另有1 5 的人为糖尿病 前期，糖尿病前期人数达1 亿4 千8 百万以上，高于欧美发达国家水平， 中国目前有超过9 2 4 0 万的糖尿病患者，己成为全球糖尿病第一大国。未 来几十年内糖尿病仍是我国面临的一个严峻的公共卫生疾病问题。糖尿病 作为一种慢性病，其并发症主要分为急性并发症和慢性并发症两种，糖尿 病视网膜病变( d r ) 作为糖尿病慢性并发症之一，其危害更是不容忽视， 可引起视力下降，严重者可导致不可逆性视力丧失。目前认为糖尿病视网 膜病变的发生是视网膜组织缺氧及微循环受损的结果，其发展与血糖控制 程度及糖尿病病程长短密切相关，病程越长，d r 的发病率越高。目前糖 尿病视网膜病变的药物治疗尚不成熟，激光光凝治疗是普遍为患者接受的 延缓其发展的治疗方法，但其提高视力的作用很弱。为了寻求有效的防治 糖尿病视网膜病变发生发展的方法，弄清其发病机制势在必行。目前的研 究认为d r 的发生与糖代谢机制紊乱、多元醇肌醇代谢通路的异常、非 酶性糖基化作用、蛋白激酶c 激活、血管舒张性前列腺产物、血流动力 学的改变、超氧化物歧化酶活性下降以及视网膜内生长因子水平的改变等 有关，其中细胞因子的作用尤其是血管内皮生长因子( v e g f ) 的作用日 益受到关注。v e g f 作为一种细胞生长因子，具有增加血管通透性的作用， 被认为是目前所知的最强的内皮细胞选择性促有丝分裂因子和血管生成 因子。体内多种细胞包括视网膜色素上皮细胞均可分泌v e g f ，在正常情 况下，视网膜色素上皮细胞可少量分泌v e g f ，高糖条件下可促进视网膜 内v e g f 的分泌，己有研究证实v e g f 与d r 密切相关。李才锐等【1 】探讨 了非肥胖糖尿病小鼠血清和视网膜v e g f 的表达及二者之间的关系，发 现随着糖尿病的发展，糖尿病视网膜病变程度加重，而且血清v e g f 含 量增高，病程越长，血清中v e g f 的含量就越高，揭示了血清v e g f 含 量和糖尿病病程之间的显著的相关性。这一研究结果与糖尿病病程达1 0 中文摘要 年以上者，糖尿病视网膜病变的发生率达到5 0 的研究结果一致【2 】。而且 糖尿病患者体内的血糖不是一成不变的，它会随着一些因素的影响而发生 改变。餐后高血糖的控制不佳以及胰岛素或促泌剂的不合理应用，均可造 成糖尿病患者的血糖波动【3 l 。随着对高糖毒性研究的日益深入，关于波动 性高糖的研究日益成为热点。本研究模拟了糖尿病患者体内血糖的急性波 动状态，通过比较波动性高糖与恒定性高糖对人视网膜色素上皮( m 冲e ) 细胞分泌血管内皮生长因子( v e g f ) 的影响，从而探讨间断高浓度葡萄糖 较恒定性高浓度葡萄糖是否更能促进糖尿病视网膜病变的发生发展。 方法：将体外培养的人视网膜色素上皮( 冲e ) 细胞分为四组，每组 设有6 个复孔。实验分组如下：a 正常对照组：葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 的d 姬m 培养液培养；b 恒定高浓度葡萄糖组：葡萄糖浓度为2 5 m m o l l 的d m 培养液培养；c 间断高浓度葡萄糖组：葡萄糖浓度为5 5 5 n 吼o l l 与葡萄糖浓度为2 5 m m 0 1 l 的两种条件的d m 培养液交替培养，其中 低糖2 小时，高糖3 小时交替培养，以高糖过夜；d 高渗对照组：甘露 醇浓度为1 9 4 5 m m o l l + 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 的d m m 培养液培养。 四组分别于2 4 小时，4 8 小时和7 2 小时观察细胞形态，并收集细胞上清 液，2 0 保存待测。按照v e g f 试剂盒说明书检测所收集的上清液中 v e g f 的含量。 结果： 1 分组培养2 4 h 时，倒置显微镜下观察各组细胞形态较前无明显变化，经 检验各组上清液中的v e g f 水平无显著性差异( p o 0 5 ) ； 2 分组培养4 8 h 时，倒置显微镜下观察各组细胞形态较前变化不明显，经 检验各组上清液中的三g f 水平无显著性差异( p o 0 5 ) ； 3 分组培养7 2 h 时： 与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o 儿) 相比，高渗对照组( 甘露 醇浓度为1 9 4 5 m m o l l + 葡萄糖浓度为5 5 5 1 1 1 1 n o l l 的d m 培养液) 细胞 在倒置显微镜下观察仍以长梭形或多边形为主，两组间v e g f 水平亦无显 著性差异( p 0 0 5 ) ； 与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 i m 0 1 l ) 相比，恒定高浓度葡萄糖 组( 葡萄糖浓度为2 5 m m o l l ) 细胞在倒置显微镜下观察可见细胞胞体变 薄，形态不规则的细胞增多，且经检验恒定性高浓度葡萄糖组v e g f 水平 中文摘要 明显升高，两组间v e g f 水平差异具有统计学意义( p o 0 0 1 ) ； 与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m 0 1 l ) 相比，间断高浓度葡萄糖 组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 与葡萄糖浓度为2 5 m m o l l 交替) 倒置显微 镜下观察亦可见细胞胞体变薄，形态不规则，且经检测间断高浓度葡萄糖 组v e g f 水平明显升高，两组间v e g f 水平差异具有统计学意义( p o 0 5 ) ； 3a r e r7 2 h ： c o m p a r e dw i mm en o m l a lc o n t r o lg r o u p ，t h eh y p e r t o n i cc o n t r o lg r o u p c e l l sw e r es t i l lo b s e r v e ds p i n d l eo rp o l y g o n a l - b a s e du n d e rt h em v e r t e d m i c r o s c o p e ，a n dt h e r ew a s n os i g n i f i c a n td i f r e r e n c eo nv e g fl e v e l sb e t w e e n t h e 僦og r o u p s ( p o 0 5 ) ； c o m p a r e dw i m 也en o m a lc o n t r o lg r o u p ，m ec o n s 锄h i 曲9 1 u c o s e 铲o u pc e l l sw e r eo b s e e db e c 锄et h i m e ri nt h ec e l lb o d y ，i r r e g u l a rc e l l s i n c r e a s e d ，a n dt h ec o n s t a n th i 曲g l u c o s e 伊o u ph a ds i 印i f i c a n t l yh i 曲e rv e g f l e v e l s ，也ed i 行e r e n c eo fv e g f l e v e l sb e 铆e e nm et w og r o u p sw a u ss i 印i f i c 枷 ( p o 0 0 1 ) ； c o m p a r e dw i mm en o r r r l a lc o n t r o lg r o u p ，m ei n t e m l i t c e n th i 曲g l u c o s e 鲈o u pw e r ea l s os e e nt h a tt h ec e l lw e r em i n a 1 1 di r r e g u l a r ，t 1 1 ei n t e r m i t t e n th i g h 9 1 u c o s eg r o u p h a do b v i o u s l yh i g h e rv e g fl e v e l sw h i c hw a ss i 鲥f i c 跏 6 d i f f e r e n c eb e t w e e n “st w og r o u p s ( p o o o 1 ) ； c o m p a r e dw i t ht h ec o n s t a n th i g hg i u c o s eg r o u p ，t h ei n t e r m i t t e n t h i g h g l u c o s eg r o u ph a dt h em o r ei r r e g u l a rc e l l sa n di n c r e a s e d 、厂e g f1 e v e l s t h e d i f f e r e n c eo fv e g fl e v e l sb 咖e e nt h et w o g r o u p sw a ss t a t i s t i c a l l y ( p o 0 5 ) ； 分组培养7 2 h 时，各组v e g f 含量均较前明显增加，数据经统计学检 验： 正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l ) 与高渗对照组( 甘露醇浓度 为1 9 4 5 m m o l l + 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l ) 相比，两组间v e g f 水平亦无 显著性差异( p o 0 5 ) ； 与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l ) 相比，恒定高浓度葡萄糖 组( 葡萄糖浓度为2 5 m m o l l ) v e g f 水平明显升高，经检验两组间v e g f 水平差异具有统计学意义( p o 0 0 1 ) ； 与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l ) 相比，间断高浓度葡萄糖 组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 与葡萄糖浓度为2 5 m m o l l 相交替) v e g f 水 平明显升高，经检验两组间v e g f 水平差异具有统计学意义( p o 0 0 1 ) 与恒定高浓度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为2 5 m m 0 1 l ) 相比，间断高浓 度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为5 5 5 h h n 0 1 l 与葡萄糖浓度为2 5 m m o l l 相交替) v e g f 水平明显升高，经检验两组间v e g f 水平差异具有统计学意义 ( p o 0 0 1 ) 。 研究论文 附图 f i g 1t h ev e g f l e v e lo fd i 艉r e n tt i m e si ne a c hg r o u p ( n = 6 ，y 士s ) p o 0 0 1v sg r o u pa ；p o o o lv s 铲o u pb 研究论文 附表 t a b l e1t h ev e g f1 e v e la t2 4h o u r s ( p g m 1 )( n = 6 ，文s ) g r o u p s v e g fv a l u e a 2 3 1 9 8 1 6 9 0 b 2 2 7 4 7 2 3 8 2 c 2 2 6 5 5 2 3 5 2 d 2 2 4 3 0 2 1 3 0 p o o olv sg r o u pa ； p o o o1v sg r o u pb a ：n o m a lc o n t r 0 1g r o u p ；b ：c o n s t a n th i g hg l u c o s e 罂i o u p ； c ：i n t e r m i t t e n th i 曲9 1 u c o s e 铲o u p ；d ：h y p e r t o n i cc o n t r 0 1 黟o u p t a b l e2t h ev e g fl e v e la t4 8h o u r s ( p g m 1 ) ( n = 6 ，文- + s ) o u p s v e g fv a l u e a 3 7 8 3 6 2 3 3 7 b 3 9 8 2 8 2 4 7 3 c 4 0 5 0 6 2 5 6 3 d 3 8 3 9 6 2 9 6 0 p o o o lv sg r o u pa ；p o 0 0 1v sg r o u pb a ：n o m a lc o n t r o lg r o u p ；b ：c o n s t a n th i 曲9 1 u c o s eg r o u p ； c ：i n t e r m i t t e n th i 曲g l u c o s eg r o u p ；d ：h y p e r t o n i cc o n t r o lg r o u p t a b l e3t h ev e g fl e v e la t7 2h o u r s ( p m 1 )( n 2 6 ，) i s ) g r o u d s v e g fv a l u e a 6 2 8 u 9 4 2 3 b7 0 5 6 7 2 5 2 2 c 7 8 4 11 4 2 3 8 d 6 2 7 9 0 2 6 4 7 p o 0 0 1v sg r o u pa ； p o 0 0 1v sg r o u pb a ：n o r m a lc o n t r 0 1g r o u p ；b ：c o n s t a n th i 曲9 1 u c o s eg r o u p ； c ：i n t e 眦i t t e n th i g hg l u c o s e 伊o u p ；d ：h y p e r t o n i cc o m r 0 1g r o u p 1 7 研究论文 讨论 糖尿病视网膜病变( d r ) 作为糖尿病最常见和最严重的微血管并发 症之一，可引起糖尿病患者视物不清，严重者视力丧失。根据其有无新生 血管的形成，可将d r 分为单纯型和增殖型。目前的研究认为d r 的发病机 制与以下因素有密切关系，这些因素包括糖代谢机制的紊乱、多元醇肌醇 代谢通路的异常、非酶性糖基化作用、蛋白激酶c 激活、血管舒张性前列 腺产物、血流动力学的改变、超氧化物歧化酶活性的下降以及视网膜内生 长因子水平的改变等。研究发现d r 的基本病理过程为微循环障碍，其病 理特征为视网膜新生血管形成和血视网膜屏障( b l o o d r e t i n a lb 硎e r b i 迅) 的破坏【5 】。在糖尿病视网膜病变发生的病因学方面，已经证实慢性 高血糖在导致糖尿病微血管并发症过程中的重要作用，其重要内容是转运 进视网膜内的葡萄糖对视网膜产生糖毒性这一假训6 1 。可见长期慢性高血 糖是糖尿病的发病基础，而高血糖对糖尿病患者的危害存在两种方式，包 括慢性持续性高血糖与波动性高血糖。既往的研究多注重持续性高血糖对 糖尿病患者的危害，关于波动性高血糖的研究较少。有研究证实，在正常 条件下，体内的血糖由于受到精密的调控机制的影响，波动幅度小，然而 糖尿病患者的血糖波动幅度明显增加1 7 】。考虑到糖尿病患者的血糖波动幅 度大，近年来，人们越来越关注波动性高血糖对糖尿病患者的影响。越来 越多的证据表明波动性高血糖较恒定性高血糖更能促进糖尿病及其慢性 血管并发症的发生发展。流行病学的资料显示，血糖波动不仅可以独立预 测糖尿病患者的死亡率，同时也是糖尿病血管并发症的独立危险因素【8 】。 有研究表明【9 】，不论是低浓度葡萄糖还是高浓度葡萄糖，都能使体外培养的 大鼠的胰岛b 细胞大量表达凋亡基因c m y c 、加速细胞凋亡，而在正常糖 浓度下此凋亡基因的表达非常低。胰岛b 细胞的凋亡随着葡萄糖浓度的升 高，呈v 型曲线，可见血糖的波动更加促使胰岛b 细胞的凋亡，加重糖尿 病患者病情。新近的研究亦发现【1 0 1 ，将人的胰岛在体外波动性高糖条件下 孵育5 天后，与对照组相比较，波动性高糖条件下的胰岛素分泌指数约降 低了5 0 。亦有研究表明【1 1 1 ，间歇性高糖培养较持续性高糖培养对肾小管 间质细胞生长的影响更大，更能促进肿瘤坏死因子b 、血小板源性生长 因子等细胞因子的合成增加。有关糖尿病大鼠动物模型的研究提示，糖化 研究论文 血红蛋白水平相近的糖尿病动物中，与持续性高血糖状态相比，血糖波动 幅度的增大更能促使肾小管上皮细胞的凋亡【1 2 1 。 视网膜色素上皮( r p e ) 位于视网膜的最外层，其对维持视网膜的正常 功能起着十分重要的作用。r p e 运送大量的葡萄糖由脉络膜毛细血管进入 视网膜，以满足视网膜外层视细胞高代谢活动的需求，因此r p e 细胞容易 受到血糖浓度的影响【13 1 。血管内皮生长因子( v e g f ) 是潜在的增加血管 通透性的因子，是目前所知的最强的内皮细胞选择性促有丝分裂因子和血 管生成因子。眼内的多种细胞均可分泌v e g f ，血管内皮细胞、神经节细 胞、i 渖e 细胞、m u l l e r 细胞和神经胶质细胞等。有研究发现r p e 细胞不仅 是产生v e g f 的主要细胞之一，而且在i 冲e 细胞表面也有v e g f 的两种受 体，并证实一为f l k ( f m s 一1 i k e 母r o s m ek i n a s e ) ，另一为k d r ( k i n a s ei n s e r t d o m a i n c o n t a i n i n gr e c e p t o r ) 【1 4 】。v e g f 具有促进内皮细胞分裂、增加血管通 透性、诱发新生血管形成等作用，在正常情况下的表达量很低，雌激素、蛋 白激酶c 以及缺氧等因素均可诱导v e g f 的表达。研究发现，v e g f 在糖尿 病视网膜病变的发生、发展过程中起了重要的作用，视网膜微循环障碍导 致了局部组织缺血和缺氧，进而导致局部分泌v e g f 【l5 1 。v e g f 以其促进新 生血管形成及增加血管通透性的作用与糖尿病视网膜病变的新生血管形 成密切相关。而且有研究发现，无论是在增殖型糖尿病视网膜病变还是在 单纯型糖尿病视网膜病变中v e g f 的含量均升甜1 6 ，l7 1 。 体外培养时的2 5 m m o l l 3 0 m m o l l 的葡萄糖浓度，可近似的等同于糖 尿病患者体内的高血糖状态【l8 1 。本实验设置培养液葡萄糖浓度为2 5 m m o 儿来模拟糖尿病患者体内的高糖状态，用葡萄糖浓度为5 5 5 n u n o l l 的培养液来模拟人体内正常血糖水平。本研究通过比较间断高浓度葡萄糖 ( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 与葡萄糖浓度为2 5 i m o l 几相交替) 与恒定性 高浓度葡萄糖( 葡萄糖浓度为2 5 m m o l l ) 对体外培养的人视网膜色素上 皮细胞分泌v e g f 的影响，以探讨血糖波动对糖尿病视网膜病变的影响。 结果显示，分组培养2 4 小时及4 8 小时倒置显微镜下观察细胞形态仍以多边 形或长梭形为主，各组间亦未见形态学的差别，仅是4 8 小时较2 4 小时的细 胞数量增多。分组培养7 2 小时观察：与正常对照组( 葡萄糖浓度为5 5 5 姗o l l ) 相比，高渗对照组( 甘露醇浓度为1 9 4 5 m m o l l + 葡萄糖浓度为 5 5 5 n u l l 0 1 l ) 细胞在倒置显微镜下观察仍以长梭形或多边形为主，恒定高 研究论文 浓度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为2 5 m m o l l ) 及间断高浓度葡萄糖组( 葡萄 糖浓度为5 5 5 m m o l l 与葡萄糖浓度为2 5 m m o l l 相交替) 则可见细胞胞体 变薄，形态不规则的细胞增多；且与恒定高浓度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为 2 5 m m 0 1 l ) 相比，间断高浓度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m o l l 与葡 萄糖浓度为2 5 m m o l l 相交替) 形态不规则细胞更多。而且通过比较不同 时间收集的上清液中v e g f 的含量，经统计学检验其结果与形态学观察相 吻合。分组培养2 4 小时及4 8 小时收集的上清液中v e g f 的含量，分别应用 单因素方差分析各组数据进行统计学检验，发现无论是2 4 小时收集的细 胞上清液还是4 8 小时收集的细胞上清液中的v e g f 含量，各组间无显著性 差异；分组培养7 2 小时收集的上清液中的v e g f 含量，应用单因素方差分 析对数据进行统计学检验，发现四组间有显著性差异，应用l s d 进行组间 多重比较，s n k 进行组间两两比较，发现：与正常对照组( 葡萄糖浓度为 5 5 5 m m o l l ) 相比，间断高浓度葡萄糖组( 葡萄糖浓度为5 5 5 m m 0 1 l 与葡 萄糖浓度为2 5 m m o l l 相交替) 三g f 浓度最高，恒定高浓度葡萄糖组( 葡 萄糖浓度为2 5 m m o l l ) 次之，且这三组任何两组间的差异都具有统计学 意义，这提示间断高浓度葡萄糖较恒定性高浓度葡萄糖更能增加v e g f 的 分泌，从而参与了糖尿病视网膜病变的发生发展。考虑间断高浓度葡萄糖 较恒定高浓度葡萄糖促使人视网膜色素上皮细胞分泌v e g f 增多的机理 可能是与高血糖记忆有关，所谓高血糖记忆指的是即使血糖恢复正常后高 血糖所引起的微血管损伤仍在继续和发展。来自d c c t 的研究显剩1 9 】，不 论是强化治疗组还是常规治疗组，其在d r 的发生、发展和病变的严重程 度方面的后续影响效应可持续至4 年，单纯的血糖控制未能有效的防止视 网膜晚期病变的发展。本实验中可能是当细胞培养液中的葡萄糖浓度高 时，导致细胞分泌三g f 增多，葡萄糖浓度降至正常水平时，高浓度葡萄 糖引起的细胞损害仍在继续和发展，高糖及正常糖浓度的培养液交替培 养，引起的细胞损害较单纯高浓度葡萄糖更严重，使得间断高浓度葡萄糖 条件培养下的人视网膜色素上皮细胞分泌的v e g f 更多。 v e g f 导致糖尿病视网膜病变的发生及发展均是通过v e g f v e g f r 这一系统实现的【2 0 。2 2 1 。体内高水平的v e g f ，通过与其特异性受体结合， 可以使视网膜局部细胞间黏附分子1 ( i c 蝴1 ) 的基因及蛋白水平的表 达增加，导致白细胞在视网膜的淤滞及血