（作物遗传育种专业论文）拟南芥新型芥子酶基因功能的初步研究.pdf

内容提要 植物芥子酶防御系统为白花菜目植物特有，由芥子酶及其底物硫代葡萄糖苷 组成。芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，在受到病虫侵袭时，底物 和酶相遇，硫代葡糖苷被降为有毒化合物，起防御作用。对其研究具有重要的意 义。 在拟南芥中，s o u t h e m 印迹表明存在3 个芥子酶编码基因，其中只有两个基 因粥g j 和粥g 2 已被证明有活性，而粥g 3 是一个假基因。近年来，在拟南芥 中又发现了三个芥子酶基因，即粥g 4 、粥g 5 和粥g 6 。粥g j 和粥g 2 都在叶、 子叶、茎和花器官中表达。粥g 4 、粥g 5 在根部特异表达。 本研究利用i a 干涉技术，初步研究了粥g 4 和粥g 5 基因的功能。根据 粥g 彳、粥仍编码序列中特异靶序列设计s i i a 序列。以拟南芥基因组d n a 模板扩增7 脱一4 基因启动子和终止子，与s i i 斟a 序列连接并克隆到植物表达载 体p b p 5 中，构建成了s i r n a 真核表达载体。利用花序浸泡法转化拟南芥，获 得转基因植株。经彳口如基因p c r 检测初步证实外源基因已导入拟南芥的核基 因组中。酶活测定的结果显示，粥g 4 、粥g 5 基因的表达受到了大部分抑制。 这说明本研究构建的r n 载体对基因表达沉默是有效的。 另外利用r t p c r 方法克隆了7 t g g 4 基因c d n a ，连接并克隆到植物表达载 体p b p 6 中，构建成过量表达载体。同时利用花序浸泡法转化拟南芥。 购买了t - d n a 插入突变株，p c r 鉴定出t - d n a 插入位置。形态学观察结 果表明，突变体没有明显的表型改变。说明粥g 彳和粥g 5 功能具有冗余性，单 基因的突变不对拟南芥的生长发育产生影响。 主题词：芥子酶粥g 4 粥g 5 基因功能表达载体i 矾a 干涉过量表达 t d n a 插入突变 a b s t r a c t m y r o s i n a s e sa r eac l a u s so fe n z y m e sm a tc a t a l i z et 1 1 eh y d r 0 1 y s i so fm i o 西u c o s i d e s i 1 1b r 嬲s i c a l e s t h ee i ：亿y m e sa n dm es u b s 缸t e sa r es t o r e ds 印a r a t e l yi i ld i 仔旨e 1 1 tc e l l s ， m e ya r em i x e du p o ni n f e s 枷o nb yp e s t s ，a 芏l dt b j o 哲u c o s i d e sa r eh y d r o l y z e di n t ot o ) 【i c c o m p o u n d st 0s e r v e 鹤d e f e n s ew e a p o n s t h es t u d yo fm y r o s i n a u s eh a u si m p o r t a n t s i 嘶f i c a n c e t h r e em y r o s i n a s e sg e n e s ，弼g ，粥g 2a n d 粥g 3 ，h a v ep r 嘶o u s l yb e e n r 印o r t e di i l 彳朋6 渤唧括珐口眈n 口，i i lw 1 1 i c hz g g 3i sap s e u d o g e n e d a t a b a s em i n i n g o ft 1 1 e4 m 6 f 咖筘括g e n o m es u g g e s t e d 也ep r e s e n c eo f 廿u e ea d d i t i o n a lm y r o s i n 弱e g e n e sr e f 缸e dt 0 雒粥饼，粥研a n d 粥g 6 r t p c ra n a l y s i sw a sp 拍m e dt 0 s t u d y l ee x p l r e s s i o no f 粥g j ，粥g 2 ，7 g g 4 ，7 g g 5 趾d 粥g 6i n 彳砌口厅口万口 e x p r e s s i o nw a sa n a l y s e di nl e a c o t y l e d o n ，s t e m ，f l o w a n dr o o tt i s s u e 1 1 1 e 粥g 4 a n dz t g g 5g e n e sw e r ee x c l u s i v e l y 仃孤s 嘶b e di nr o o tt i s s u e 恤l et h ez g g j 锄d 粥凹g e i l e sw e r e 缸锄s 嘶b e di n1 e a c o t y l e d o n ，s t 锄a n dn o w c r s 鼬q 加t e c h n i q u ew a s 锄p l o y e dt os t u d ym eg e n e 丘m c t i o n so fm y r o s i n a s eg e n e s 丁r g g 4 趾d 丁r g 硝s i 鼢认s e q u e n c e sw e r ed e s i 乒a t e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h e 伽驾e ts i t e so f7 ，g g 4a n d 粥g 5 t h ep r o m o t e r ( 7 s l p ) a n dm e3 硼t r a n s 谢b e d r e 西o n ( 7 s l 广t ) o fa t 7 s l 4g e n e 舶m 彳旭6 f 却廊砌口厅鲫以( c 0 1 u m b i ae c o t y p e ) w e r c c l o n e d ，a n d 嬲s e m b l e dt of o 册s i r n ac x p r e s s i o nm o d u l e t h em o d u l ew a ss u b c l o n e d i n t 0m em u l t i - c l o 血gs i t e i np b p 5 1 1 1 er n 纳舯e n to f 粥g 彳a 1 1 d 粥w a s i n s 嘶c db e 觚e e n7 s l - pa n d7 s l 广t ，也u s ，ag e n e s i l e n c ev e c t o rw 嬲c o n s t m c t e d ，i h e 么朋6 f 比那括w a s 仃：m s f o m e db yn o r a ld i p 7 i 咖s f o n i l a i l t sw e r eo b t a i n e d i tw a sc o n f i m e dt h a t 彳口比g e n eh a db e e l le x p r e s s e di n 衄1 s f o 衄c d 么阳6 f d 咖括 p l a n t m y r o s i n a s ea u c t i v i 够a s s a yi n d i c a t e dm a t 粥g 彳a n dz 1 g g 5e ) 【p r e s s i o nw a s m o s t l yi n ：h i b i t e di 1 1t 1 1 e 扛a n s f o n n a n t s t h er e s u l t sd 锄o n s 仃a t e dt h a tt h ev e c t o ri s e 仃e c t i v ef o rg e n es i l e n c i n gi np l a i l t s t h ec d n ao f7 t g g 4w a so b t a i l l e db yr t p c r t h e i ls u b c l o n e di n t om e m u l d c l o i l i n gs i t ei np b p 6 t h u s ，ao v c r e x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t m c t e d t h e 彳厂口6 砒p 括w a s 仃a n s f o 加e db yn o r a ld i p 1ol i n e so f 仃a i l s f o m a n t sw e r eo b t a i l l e d t - d n ai 1 1 s e r t i o nm m a n t st o 也ez t g g 4 强d 几；g 5g e n e sw e r eo b t a i n e d 舶m 舡a b i d o p s i sb i o l o 百c a lr e s o u r c ec e l l t e r ( a b r c ) t h ei i l s 硎o ns i t e sw e r ed e t 【1 1 i n e d i i b yp c rc l o 血ga n ds e q u 锄咖g n o0 b v i o u sp h e n o t y p i cc h a n g e sw e r eo b s e r v c d b e t 、e e n 也e m t a n t sa n d 也e 谢1 dt y p ep l 锄t so fc 0 1 啪b i ae c o t y p e t h e r e f o r e ，s i n 酉e g e n em u t a r t i o nm a yn o tb es i 9 1 1 i 6 c 趾tt 0c a u s ep h e n o t y p i cc h a n g e sa n dt l l e 矗m c t i o no f 粥倒a n d 粥m a y b e 川u 1 1 d 锄t k e yw o r d s ：m y r o s i n a u s e 粥g 47 g g 5 g e c t i o ne x p r e s s i n gv e c t o r r n ai n t 晌e n c eo v e r e x p r e s s i o nt - d n ai i l s e r t i o nm u t a g e n e s i s i i i 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律 结果由本人承担。 论文作者签名： 关镒 日期：2 p 坫年乡月穹日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名： 关镂天丁p 日期：z 口d g 年石月9 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “c a l i s 高校学位论文全文数据库”户全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。屋童迨 塞逞銮唇溢唇：旦坐生j 旦= 生；鱼三生筮查。 论文作者签名：乡椎 日期：d 占年石月7 日 导师躲型谆稍 日期：祧年6 月fd 日 1 前言 1 1 芥子酶研究进展 1 1 1 硫代葡糖苷芥子酶防御系统简介 十字花科植物分布很广。一般来说，它们在生物界具有一定生存和扩张的优势。 这种优势得益于其独特的硫代葡糖苷芥子酶体系。芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在 不同的细胞中( k e l l ye ta 1 ，1 9 9 8 ) ，在必要时，如机械损伤时，底物和酶相遇，硫代 葡糖苷被降为有毒化合物，抵御病虫侵袭( b o n e se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。这就是人们所说的“芥 子炸弹”。然而，有些害虫( 专性昆虫) 通过协同进化，已克服了硫代葡糖苷降解产 物的毒性。因此，硫代葡糖苷芥子酶体系的防御功能主要针对兼性昆虫。 硫代葡糖苷一方面是十字花科植物的防御工具，另一方面，又对菜籽油的品质和 菜籽饼蛋白质的利用有不利影响( f e n 谢c ke ta 1 ，1 9 8 3 ) 。如何培育植株高硫而种子低 硫的品种引起了油菜m 鼬f c 口，z 印淞) 育种家的高度重视。硫代葡糖苷的种类很多，已鉴 定结构的超过1 0 0 种，它们的差别在于r 一基团的不同( h o g g ee ta 1 ，1 9 8 8 ；b e n n e te t a 1 ，1 9 9 7 ) 。与生氰葡糖苷类似，硫代葡糖苷的侧链也来自氨基酸( b e l l l l e te ta 1 ，1 9 9 7 ； p o u l t o n1 9 9 0 ) 。芥子酶是专一降解硫代葡糖苷的酶。甘蓝型油菜大约有2 0 2 5 个这 样的基因( f 址e ta 1 ，1 9 9 5 ；x u ee ta 1 ，1 9 9 2 ) 。目前还不清楚不同基因编码的酶对底 物是否有不同的要求。 根据油菜，z 印凇) ( c h e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；f 出e ta 1 ，1 9 9 2 ；f a l ke ta 1 ，1 9 9 5 ) 和拟南芥 ( 么朋6 f 如芦括觑口厉口咒口) ( c h a d c h a w 趾e ta 1 ，1 9 9 3 ；x u ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 芥子酶c d n a 推 断，芥子酶单体的分子量为5 9 l ( d 左右。然而，所有植物芥子酶都不同程度糖基化， 使芥子酶单体分子量达到6 5 7 5 k d 。在植物体内，芥子酶一般以二聚体形式存在，分 子量在1 3 5 1 5 0k d 之间( b o n e se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。芥子酶的三维结构己得到阐明 ( b 1 l r m c i s t e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。它折叠为( a b ) 8 桶状，与得到详细研究的、来自m 加魔“朋 聊p 淞的生氰葡糖苷酶的结构非常相似。一般认为，芥子酶起源于生氰葡糖苷酶 ( c y a n o g e l l i cg l u c o s i d a s e ) 。芥子酶( s b 一葡糖苷酶) 的一级结构与o b 葡糖苷酶的一级结 构有很高的同源。尽管还有一些不同意见，一般认为，区别s b 葡糖苷酶和o b 葡 糖苷酶的有效方法是看该多肽在1 8 7 位( 以s 如a 结晶芥子酶为参照) 是谷氨酸还是谷 氨酰氨。到目前为止，所有芥子酶都是谷氨酰胺残基，而o b 葡糖苷酶都是谷氨酸 残基。谷氨酸残基( 酸性氨基酸) 是0 b 葡糖苷酶活性中心的重要组成部分，是硫代葡 糖苷降解时的质子供体。在芥子酶中，这一位置被谷氨酰胺取代后，酶活性需要低浓 度的抗坏血酸来激活，以抗坏血酸作为质子供体。这一变化可能增加了植物对酶的作 用的时空调控的机制。对芥子酶的晶体结构分析结果表明，抗坏血酸位于芥子酶的活 性中心，可能代替o b 葡糖苷酶活性中心谷氨酸残基的酸性基团的作用( b u n n e i s t e re t a 1 ，1 9 9 7 ) 。然而，当抗坏血酸浓度较高时，反而抑制芥子酶的活性( c h c i le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 芥子酶具有较好的热稳定( 杨文杰1 9 9 9 ；慕运动等，1 9 9 9 ) 。纯化的酶在4 保存几 个月，酶活性降低很少( 申请者经验，未发表) 。有些芥子酶在植物体内还与其它蛋白质 结合形成复杂的结构( f a l ke ta 1 ，1 9 9 5 ；t a i p a l e i l s u ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这些蛋白质包括 m b p s ( m y r o s i n a u s e - b i n d i n gp r o t e m s ) ，m 心s ( m y r o s i n a u s e 一舔s o c i a t e dp r o t e i n s ) 等。 1 1 2 芥子酶基因的表达调控 拟南芥砌口厅口刀口) 曾经被认为仅有三个芥子酶基因即孔g j 、z g g 2 、z g g 3 ( x u e e t2 l 1 ，1 9 9 5 ；c h a d c h a w a l l1 9 9 5 ) ，其中，弼g 3 是不能编码完整芥子酶的假基因( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。r t - p c r 研究结果表明粥g ，和粥g 2 在叶片、子叶、茎、和花器中表 达( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这一结果也与x u e 等( x u ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 人的原位杂交结果， c h a d c h a w a l l 等( c h a d c h a _ w a n1 9 9 5 ) 人的n o r 出锄b l o t 结果一致。z t g g 3 尽管是假基 因，它却在雄蕾和花瓣特异表达( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。但是，在拟南芥口历口胁行口) 的种子和根中，却检测不到芥子酶基因的表达( a n d r e a s s o nc ta 1 ，2 0 0 1 ) 。难以理解 的是，在拟南芥口砌口矗口n 口) 的种子和根中，有较多的硫代葡糖苷( h o g g ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 于是，人们推测，拟南芥似历口肠，z 口) 可能还有新的芥子酶基因。2 0 0 1 年，德国的一个 研究小组( n 地e ta 1 ，2 0 0 1 ) 自称发现了一个新的芥子酶基因昂府j d ，该基因正好在根部 特异表达。然而，由于他们没有酶活性实验证据，且该基因编码的蛋白质与o b 一葡糖苷 酶更相近，在1 8 7 位( 以s a l b a 结晶芥子酶为参照) 是谷氨酸而不是谷氨酰氨，因 此，砖j d 更可能是o b 葡糖苷酶。近年，通过对拟南芥似历口z f 口，z 口) 基因组数据库的搜 索，又发现三个核基因，分别命名为粥g 4 、粥g 5 、粥g 6 ( 张家明等，待发表) ， 它们的某些片段的编码产物与芥子酶相似。进一步与芥子酶的c d n a 序列比对，找到 了它们的大部分编码序列。用r t - p c r 和i 认c e 的方法克隆到粥g 彳，粥g 5 的全长 c d n a 。在酵母中表达的t g g 4 和t g g 5 重组蛋白具有很强芥子酶活性，而粥g 6 与 弼g 3 类似，在编码区有移码突变，不能编码完整多肽。这一新家族的基因在d n a 序 2 列、基因结构及编码蛋白特性等方面与己知的芥子酶基因有较大差异，乃至以往用已 知芥子酶基因的同源序列为探针进行s o u 也锄杂交不能检测到它们的存在，用芥子酶 通用的抗体进行w c s t e mb 1 0 t 及免疫组织化学研究也不能发现它们的存在。r t - p c r 和r e a l t 曲ep c r 研究结果表明，7 g g 4 和7 g g 5 基因仅在拟南芥似砌口肠玎口) 根部特 异表达，在植物其它部位均不表达。而粥g j 和粥g 2 的表达部位刚好相反。 由于油菜( 曰，印淞) 芥子酶基因数量多，基因间同源率高，研究个别基因的组织特 异性及诱导型表达难度较大。以基因亚家族为对象的研究较多。f 扯( f a l k 等1 9 9 5 ； f a l k 等1 9 9 2 ) 、i 舢m a n ( l e n l n 距就a 1 ，1 9 9 3 ) 、a n d r e a u s s o n 等( a m d r e a s s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 用n o 他e mb l o t 和原位杂交的方法研究了油菜( b 川印淞) 三个芥子酶基因亚家族m a 、 m b 、m c 的表达。与拟南芥似砌口妇疗口) 不同的是，芥子酶基因在种子中表达。m a 组 的芥子酶基因主要在种胚特化的芥子细胞( m y r o s i nc e l l s ) 中表达，m c 组的基因的表达 也局限于种胚，在所有的种胚芥细胞中都能检测到m c 的转录产物。在种子的发育过 程中，m a 、m c 同步积累。在体细胞胚状体的发育过程中，芥子酶的积累与种 子发育中的情况类似( 桑建利等，1 9 8 8 ) 。m b 亚家族不仅在种子中表达，而且在子 叶、叶片、茎、根、及花和角果中表达。m b 基因转录水平及酶活性在嫩叶中比老叶 中强( b o n e s1 9 9 0 ) 。这与嫩叶中硫代葡糖苷的含量较高是一致的。然而，在根部， 似乎越老的组织芥子酶活性越高( f a l ke ta 1 ，1 9 9 2 ；l e n m a n 武a 1 ，1 9 9 3 ；q s i ce t a 1 ，1 9 9 9 ) 。 此外，芥子酶基因的表达还受其它物理化学因子的影响。比如，末莉酸和脱落酸 降低芥子酶基因的表达( t a i p a l e i l s u ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。有些芥子酶基因能被硫酸盐诱导 表达( b o n e s ，1 9 9 0 ) 。 1 1 3 芥子酶的细胞定位 早在1 8 8 4 年，h e i l l r i c h e f 等就在十字花科植物中发现了一些特殊的细胞。这些 细胞具有反常的折光性，在形态和尺寸上与邻近的细胞差异明显，用几种染料染色， 结果与邻近的细胞的差异也很明显。这些细胞被认为是积累蛋白质的特化细胞一芥子 细胞( m y r o s i nc e l l s ) ( b o n e se ta 1 ，1 9 8 5 ) 。芥子细胞以单细胞形式，分散在根、茎、 叶、种子及幼苗中。用米伦试剂( m i l l o n sr e a g e l l t ) 和芥子酶抗体双染色显示，芥 子细胞中含有芥子酶( t 孤g s t a d 既a 1 ，1 9 9 0 ；h 0 9 1 u n de ta 1 ，1 9 9 1 ) 。如前所述，原位杂 交结果也表明芥子酶基因的转录发生在芥子细胞中，由此推断，芥子酶的合成也在芥 3 子细胞中完成。免疫金粉标记的电镜研究结果显示，芥子酶位于芥子细胞中的一些颗 粒结构内部( h o 苕u n de ta l l ，1 9 9 2 ) 。在油菜，z 印螂) 种子发育过程中，第一个芥子细 胞大约在授粉后2 0 天出现。此后芥子细胞的数量逐渐增加，直到其数量达到胚细胞 总数的2 5 。在发育成熟的子叶中，约o 1 的细胞含芥子酶，在叶片中，芥子细胞 的数量仅占总细胞数的0 0 5 ( a n d r e a s s o n 等2 0 0 1 ) 。在拟南芥似砌口砌，z 口) 的种子中， 没有芥子细胞。拟南芥珐口如以口) 的芥子细胞仅存在于韧皮部薄壁细胞中( a n d r e a s s o n e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在油菜，l 印淞) 的叶片及韧皮部内部，都有芥子细胞( a n d r e a s s o ne t a 1 ，2 0 0 1 ；b o n e s1 9 9 0 ) 。茎和花瓣的木质部也有报道说与芥子酶抗体相互作用( h o 酉u n d e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。但a n d r e 嬲s o n 等( a n d r c a s s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 用更高的抗体稀释度重复研 究的结果表明，在油菜皿，z 印淞) 的茎和花瓣中，芥子酶仍然位于韧皮部或者异化芥子 细胞中。由于物种间芥子细胞的分布的差异，j g r g e i l s e i l 等( j 盯g e n s e n ，1 9 8 1 ；j 嘲e n s e n ， 1 9 9 5 ) ，将芥子细胞的分布作为物种鉴别的指标之一，比如番木瓜( c 口伽p 俐三砌刀) 仅有气孔芥子细胞。 1 1 4 植物以外其它生物的芥子酶 芥子酶活性在植物以外的某些生物体中被检测到。这些生物包括昆虫、真菌和细 菌。有些蚜虫能释放含异硫氰化物的信息素，d a w s o n 等( d a w s o ne ta 1 ，1 9 8 7 ) 推测 这种信息素是蚜虫用自己的芥子酶降解食物中的硫代葡糖苷产生的。最近，一种菜蚜 ( b - 嘶c o r y n eb r 船s i c a e ) 的芥子酶被几个研究组( f r a n c i sc ta 1 ，2 0 0 2 ；j o n e se ta 1 ，2 0 0 1 ； p o n t o p p i d a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 分离纯化。序列分析结果表明，此酶与植物芥子酶的同源性 较低，显示动物和植物芥子酶的起源可能不同。可能是专性害虫和植物平行进化的产 物。芥子酶在菜蚜中的分部与植物中类似，也是集中储藏在个别细胞中( b r i d g e se t a 1 ，2 0 0 2 ) 。推测菜蚜利用植物的硫代葡糖苷作为自身的防御武器。在受到天敌攻击 后，储藏的芥子酶将硫代葡糖昔降解为警报信息素e - b e t a 钿m e s e l l e 。目前己克隆了菜 蚜芥子酶的c d n a ( j o n e se ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 9 5 8 年，r e s s e 等( r e s s ec ta 1 ，1 9 5 8 ) 在筛选3 0 0 种真菌和3 0 种细菌后，发现约 8 的微生物具有吸收硫代葡糖苷s i l l i 鲥n 的能力。但是，不能排除这些微生物仅积累 s 衄f i i l 却不代谢的可能性。1 9 6 9 年，0 h t s u m 等( o h t s u mc ta 1 ，1 9 7 9 ；o h t s u r u ，1 9 6 9 ) 从么印p 俘z z 螂部分纯化芥子酶( 当时叫s 埘酣n a u s e ) ，证实真菌中存在芥子酶。被记载 有芥子酶活性的细菌有砌阳肠施c 抛拱口8 弘阼d 趔酝( o 昏n s l ( ye ta 1 ，1 9 6 5 ) 及肠道细菌 4 勘纪阳施c 厶吵d d 口p ( t a n ie ta 1 ，1 9 7 4 ) 。然而，目前还未见这些芥子酶d n a 和蛋白质 序列的报道，很难断定这些芥子酶在进化上是否与植物的芥子酶相关。这些微生物芥 子酶活性也可能来自底物特异性较低的普通o b 葡糖苷酶。微生物芥子酶活性的生 物功能可能与利用寄主植物的硫代葡糖苷有关。b o r e k 等( b o r e ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 报道在 土壤中检测到芥子酶，认为酶活性来自土壤微生物，可能与十字花科植物特殊根际环 境有关。 1 1 5 硫代葡糖苷芥子酶系统起源进化 硫代葡糖苷芥子酶系统可能起源于生氰葡糖苷及相应的。一b 葡糖苷酶。该假设 是基于硫代葡糖苷与生氰葡糖苷在结构和生物合成方面的相似性，以及芥子酶和生氰 葡糖苷酶在一级、二级乃至四级结构上的相似性。生氰葡糖苷在植物界分布很广，包 括蕨类、裸子植物、被子植物等，说明生氰作用是个较早的进化事件( s o u p e ，1 9 8 1 ) 。 硫代葡糖苷却主要分布在白花菜目( d 崩打b 阳譬譬f 砖卯仰口朋协( 旧名) ) 。因此， 硫代葡糖苷芥子酶系统产生较晚。到目前为止，被报道( b e m l e te ta 1 ，1 9 9 7 ) 同时具有 硫代葡糖苷和生氰葡糖苷的植物只有番木瓜( cp 印缈) 。另有一个物种幻p 疗咒玩 印f n ，z 口) ，有芥子细胞，却缺乏硫代葡糖苷底物，由此认为它可能失去了合成这些化 合物的能力。通过系统进化的研究，还有人( r o d m 锄e ta 1 ，1 9 9 8 ) 提出植物界硫代葡 糖苷芥子酶系统的形成是两次独立的演化事件。 十字花科植物由于种子数量多，一般能快速拓展地盘。但它们也受许多专性病虫 的抑制( r o 血a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。因此相信硫代葡糖苷芥子酶系统在其中起重要作用。 野生拟南芥砌口肠，z 口) 由于在生长季节早期就完成生活周期，躲避了大规模虫害。而 在夏季生长的较大型的十字花科植物如油菜( b n 印螂) 和黑芥( b ，l 毋口) ，就没那么幸 运。由于新发现的粥g 4 和粥g 5 基因类型目前仅在拟南芥口砌口加7 z 口) 中发现，它们 很可能是在拟南芥砌以f f 口，z 口) 从其它十字花科植物中分化出来后出现的。传统的芥子 酶在植物体内的分布，拟南芥砌口z 缸”口) 和较大型的十字花科植物差异很大。拟南芥 咖口如聆以) 的两个有功能的芥子酶基因粥g j 和粥g 2 都在地上部的韧皮部表达。油 菜n 印淞) 和黑芥m 喀m ) 中有2 0 多个基因，它们既在韧皮部表达，也在植物各个部 位的芥子细胞中表达。因此，芥子酶在较大型的十字花科植物中的演化可能分为两个 步骤，首先芥子酶出现在韧皮部，然后出现在植物各个部位包括种子的芥子细胞中。 第一个演化步骤发生在拟南芥似砌口砌，z 口) 与其他十字花科植物分化之前，第二个演化 步骤发生在拟南芥口砌口肠n 口) 与其他十字花科植物分化之后( a n d r e a s s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ； r o d m a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这一观点得到芥子酶分子系统进化研究的支持。油菜 ，z 印淞) 和黑芥，z 辔m ) 的芥子酶基因可以分为m a 、m b 、m c 三个亚家族，但拟南芥 凹觑口肠，l 口) 的芥子酶基因弼g j ，粥g 2 无法分到其中的任何亚家族，m a 、m b 、m c 三个亚家族的形成发生在拟南芥砌口加，z 口) 与其他十字花科植物分化之后( x u ee t a 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 6 硫代葡糖苷芥子酶系统的可能功能 1 1 6 1 营养储备功能 白花菜目植物的成功在于其能生产大量的硫含量高的种子。硫代葡糖苷含硫和 氮，被认为是硫和氮的储藏库。 油菜p 聆印锻) 对硫有非常高的需求，它对硫的需求 量是高产禾本科植物的三倍以上( s d m u g ，1 9 9 2 ) 。油菜，印螂) 在缺硫的土壤中生 长，硫代葡糖苷的合成严重受阻。如果种子积累硫代葡糖苷不足，油菜，z 印淞) 幼苗 对土壤硫缺乏就更敏感。拟南芥口砌口加刀口) 种子中仅含硫代葡糖苷，芥子酶在种子萌 发后才合成，显示硫代葡糖苷可能作为拟南芥口砌口加以口) 种子的营养储备。 1 1 6 2 对兼性病虫的防御功能 兼性昆虫对硫代葡糖苷降解物的毒性非常敏感。g i 锄0 1 1 n s t 撕s 等( g i 锄o u i l s t 撕s c ta 1 ，1 9 9 5 ) 用硫代含量不同的油菜n 印螂) 品系进行田间抗虫试验。结果表明，随 着硫代含量的升高，兼性昆虫的危害显著降低。硫代的降解物也被证明对根部病原菌 ( g i 锄o u s t 撕se ta 1 ，1 9 9 7 ；鼬r k e g 锄r de t2 l 1 ，1 9 9 6 ) 和线虫( k e 皿a n s h a ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 有毒性。 1 1 6 3 与专性昆虫的互动 不少研究者认为硫代葡糖苷是有些专性昆虫的食物和刺激剂( l o u d ae ta 1 ，1 9 9 1 ； r a s k ，2 0 0 0 ) 。硫代葡糖苷的气味可以帮助专性昆虫找到寄主植物。一种硫代葡糖苷 s i n j g 血的降解物a 1 1 y li s o t h i o c y a na _ t c 已被用来诱捕油菜假，z 印淞) 专性害虫( v i l l c e n te t a 1 ，1 9 8 4 ) 。不过，有研究表明，并不是硫代葡糖苷浓度越高，专性昆虫就越爱。硫 代葡糖苷浓度中等的品种，专性昆虫的种群数量越大( s i e m e l l se ta 1 ，1 9 9 6 ) ，说明即 使是专性昆虫，硫代葡糖苷对它仍有一定抑制作用。含硫代植物产生的气味对害虫天 敌也有吸引力( m a t i a c c ie ta i ，1 9 9 4 ) 。另一方面，害虫可以通过警报信息素逃避天敌。 6 1 1 6 4 对人类的影响 十字花科作物如b ，l f 鲁阳( 黑芥) b d 彪朋c e 口( 花椰菜、花菜、白菜等) 的特殊气味是硫 代葡糖苷降解物( f e n w i c ke ta 1 ，1 9 8 3 ) 。当菜油从菜子中提取后，硫代葡糖苷残留在 菜子饼中，由于有刺激性的气味和味道，以及降解物f 的毒性，菜子饼作为饲料受到 限制。近年来，由于降解物抗癌作用的发现( v e r h o e v e ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ，硫代葡糖苷的 负面形象有所改观。另外，硫代葡糖苷还可以作为化学合成的起始物( p 釉i 耐c t a 1 ，1 9 9 8 ) 。芸苔作物是非常好的轮作作物，能给下轮作物带来许多好处，包括硫代 葡糖苷残留物有抗病和抗线虫的作用( 硒r k e g a u a r de ta 1 ，1 9 9 6 ：a n g i l s e ta 1 ，1 9 9 5 ； r k e g a a r de ta 1 ，1 9 9 4 ) 。芸苔植物组织作为除草剂的潜在用途也有报道( b r 0 、ne ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 1 2i 冰a i 研究进展 i 斟a 干涉( i an e r 衙e i l c e ，简称r n ) 是将双链r n a ( d s i a ) 导入细胞引起特 异基因m i a 降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉默( p t g s ) 的一种。1 9 9 8 年，f i r e 等人( f ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现， 由正义和反义r n a 退火形成的d s r n a 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义 r n a 强1 0 倍以上。d s r n a 引起的基因表达抑制不是正义或反义r n a 引起的基因表 达抑制在数学上的叠加，这就说明d s i 斟a 触发了细胞内的一些反应机制，从而引起 了高效和特异的基因表达抑制效果。当时，他们就把这种现象命名为r n a 干涉。 1 2 1i 埘赴的发展史 i 州加首先是在1 9 9 0 年由j o r g e n s e n 等人在研究矮牵牛花中发现的一种转基因 同时抑制自身和相应内源基因表达的基因沉默现象。他们本欲通过加入外源色素合成 基因拷贝而产生出更深的紫色牵牛花，但是实验并为达到预期的结果，有的转基因植 物开出全白或部分白的花，这表明色素的合成不是被加强而是被抑制。事实上，不仅 导入的基因没有表达，植物自身的色素合成基因的表达也失活了，这种现象被称为基 因的工抑制现象。1 9 9 4 年，m a c i n o 和c o n g o i 发现将合成类胡萝卜所需的基因导入 粗糟红色链孢霉，导致3 0 的转化细胞中霉菌本身的基因失活，并将其称之为基因 的静息作用。1 9 9 5 年，康乃尔大学的s u g u o 博士在试图阻断秀丽新小杆线虫 ( c e l e g a n s ) 中的p a l 1 基因时，发现了一个意想不到的结果，他们本想利用反意i 矾a 7 技术特异性地阻断上述基因的表达，同时在对照实验中给线虫注射正义i 斟a ( s e i l s e r n a ) 以期观查到基因表达的增强，但达到的结果是二者都同样地切断了p a l 1 基 因的表达途径，这是与传统上反义r n a 技术的解释正好相反的。直到1 9 9 8 年2 月， 华盛顿卡耐基研究院的a n 出e wf i r e 和马萨诸塞大学医学院的c r a i gm e l l o 才首次揭开 这个谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，s u g u o 博士遇到的正义i 斟a 抑制基因表 达的现象，以及过去的反义i 矾a 技术对不基因表达的阻断，都是由于体外转录所得 r n a 中污染了微量双链i a 而引起。当他们将体外转录得到的单链r n a 纯化后注 射线虫时发现，基因抑制效应变得十分的微弱，而经过纯化的双链r n a 却正好相反， 能够高效特异性阻断相应基因的表达，这一发现被称为r n 加( m 锨，2 0 0 0 ) 。 1 2 2r n m 的作用机制 r n a 干涉是由外源、转基因、病毒感染产生或导入的双链i a ( d s r n a ) ，在细 胞内被i 矾a 酶d i c 以a t p 依赖的方式切割为2 l 2 3 核苷酸长的3 端的1 2 个b p 突出的小分子干扰r n a ( s m a l li n t e 侬：n i i l gr n 八s i r n a ) ，s i r n a 同核酸结合而形成 r n a 诱导基因沉默复合物( r n a sm d u c e d s i l e i l c i n gc o m p l e n ，s c ) ，r j s c 在a t p 的作 用下由含双链s i i 冰a 的形式变为m r n a 特异性结合，在结合处3 端的1 2 个b p 处切割 m r 2 n a ( e 1 b a s h i re ta 1 ，2 0 0 1 ) ，切断后的m i 斟a 或者被核酸外切酶所降解，或者可能 成为异常r n a ，在r n a 依赖性r n a 多聚酶( r n a d 印e n d e n ti ap o l y m e r a u s e ，r d i 呻) 的作用下又形成新的d s r n a ，再次被d i c e r 识别并切段，形成新的s i i a 进一步作 用其他的靶向m l a 。这种不断释放的瀑布式作用形成大量新的s i i 斟a ，使r n 加 作用在短时间内达到迅速、有效地抑制m r n a 翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地 抑制了靶向基因蛋白质或多肽的合成( b n l m e 墩a m pe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在一个细胞中如含有 几个双链r n a 分子就可以将靶基因沉默，因此可以推测在r n 舢过程中，通常包括 一个双链r n a 的复制过程。目前，人们已从线虫、果蝇、拟南芥等物种中发现相关 基因( c o g o i l i 豇a 1 ，2 0 0 0 ；f a g a r dc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3r n 的特点 1 2 3 1 高度特异性 有时s i i a 一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。b r u m m d k 锄p 等 ( b n 姗l m l k 锄pe ta 1 ，2 0 0 2 ) 利用载体表达的小发夹i 矾a ( s m a l lh a 卸i 1 1r n s h i a ) 来 8 封闭人m c f 7 细胞的基因，s m 斟a 上仅一对碱基突变就不能抑制c d h l 基因的表达， 其中，s i i a 中央位置碱基位点和3 。末端倒数第2 个碱基起了特别重要的作用。 1 2 3 2 高效性 在细胞内r n 途径一旦被启动，反应信号就被放大在低等动物中靶基因表达 抑制效率大于9 0 ，甚至有人认为每个细胞一份拷贝s i r n a 就可以达到封闭基因的 效果。 1 2 3 3 高成功率 ( 1 ) 种属时效性。m e 等( i r i ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 发现在低等生物中可持续存在，但在哺乳动 物细胞中只能维持一段时间，般注入d s r n a 后的2 3 h 的作用最明显，而后1 2 d 内，靶m r n a 的丰度就能恢复到注射r n 简之前的水平。( 2 ) d s r n a 的长度限制性。 d i c e r 能与2 0 0 5 0 0 n t 范围内的d s d n a 结合，底物片段越短，d i c e r 酶的活性也就越 弱，提示i 具有d s r n a 的片段长度限制性。( 3 ) r n 知的遗传性。目前已有大量 的资料证实，在低等生物中i a i 可以传代( b r a n t l ，2 0 0 2 ) 。( 4 ) 传播性。i 斟灿效应可以 在细胞间扩散。( 5 ) a t p 依赖性。在去除a t p 的样品中，r n 赴现象降低或消失，显示 i 舢是一个a t p 依赖的过程。 1 2 4r n a 干扰技术在植物上的应用 1 2 4 1r n a 干扰在植物功能基因组研究中的应用 r n a 干扰在生物体内普遍存在且高度保守，是一种高效的、序列特异的基因沉 默机制。被生物学家美誉为生物体在基因组水平上的免疫系统，同时它也为植物功能 基因组学的研究提供了新的思路和技术平台。作为植物功能基因组研究工具，i 斟a 干扰技术正被广泛应用，其中研究最深入的是拟南芥功能基因组的研究。目前， c w t a ( c o m p l e t e a j a b i d o p s i s 船m s 嘶p t i o m em i c r o a 饿l y ) 计划已开始实施，以获得覆盖 拟南芥全基因组的高质量的基因序列标签( g e n es e q u e n c et a g ，g s t ) ，为了分析 c a t 2 m a 中每一个g s t 的功能，h e l l i w e l l 及同事利用i n v i n o g e n 公司的g a t 哪a y