（作物遗传育种专业论文）水稻DREB转录因子基因的克隆及干旱对稻米品质的影响研究.pdf

附件一 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 王孚缸 渺f 年6af 0 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 加f 年6r | sn 诮年6 具- 黾 中文摘要 干旱、低温和高盐是目前影响农作物的主要非生物限制因子，它严重影响作物的 生长发育，以及产量和品质。 d r e b 转录因子能特异结合启动子中含有d r e c r t 的顺式作用元件，激活逆境应 答基因表达，增强植物耐干旱、低温、高温等逆境的能力。 本论文克隆了一个逆境调节基因即d r e b 转录因子基因，同时，还研究了于早对 稻米品质的影响，主要结果如下： 1 根据g e n e b a n k 数据库中的d r e b 转录因子的同源序列设计引物，应用p c r 技 术，从水稻中克隆了一个新的d r e b 转录因子基因，该基因含有1 2 1 8 b p 的开放阅读框 ( o r f ) ，推测编码4 0 5 个氨基酸，蛋白质分子量为4 4 k d ，p i 为4 6 ，且无内含子。 它具有d r e b 转录因子典型的结构特征，n 端富含碱性氨基酸rkkrprrsr ，推 测为核定位系统( n l s ) ；c 端富含酸性氨基酸，作为转录活化区。中间由5 8 个氨基 酸组成的保守的d n a 结合蛋白区a p 2 结构域，其第1 4 位和1 9 位分别为缬氨酸( v ) 和谷氨酸( e ) 。 在水稻9 3 11 基因组数据库中进行b l a s t 搜索，结果表明该基因位于水稻第5 染 色体上。对其进行同源性检索，该基因与许多d r e b 2 型基因具有较高的同源性，例如： 与籼稻d r e b l i k ep r o t e i ng e n e ( 注册号为a y 6 4 6 2 2 3 ) 有6 7 相似；与拟南芥d r e b 2 a 和d r e b 2 b ( 注册号为a b 0 0 7 7 9 0 和a b 0 0 7 7 9 1 ) 的相似性分别为6 7 年h6 0 ；与o s d r e b 2 a 的相似( 注册号为a f 3 0 0 9 7 1 ) 性为6 4 ；与拟南芥d r e b 2 g 和d r e b 2 c 的相似性分别为 5 8 和5 2 。 通过对d r e b 转录因子a p 2 域的氨基酸组成以及第1 4 位和1 9 位问的氨基酸组成 v a e i r e 的分析，同时用水稻和拟南芥的d r e b 转录因子的分子进化树分析，结果都表 明我们所克隆的基因属于d r e b 2 型，因此可能具有d r e b 2 型的特征，推测其表达模式 可能受干旱、高盐和a b a 等诱导。 2 选用1 3 个杂交水稻组合及恢复系，研究了水稻开花与灌浆结实期持续干旱对 稻米品质的影响，结果表明干旱可降低稻米加工品质，其巾对整精米牢的影响最大； 干旱对粒形影响不大，但极显著增加垩白米率和垩白度，从而降低稻米的外观品质； 干旱还可影响稻米的蒸煮和食用品质，使稻米的糊化温度提高，胶稠度变硬，直链淀 粉含量降低。提出优质米生产首先应选用优质品种，同时，应选择温光条件和水源条 件均好的生产基地，栽培上应搞好灌浆结实期的水分管理，特别注意保持后期的田问 水分，不能断水过早。 关键词：水稻：d r e b ：基因；a p 2 域；稻米品质 2 a b s t r a c t w a n gp in g r o n g ( c r o pg e n e tic sa n db r e e din g ) dir e c t e db yp r o f e s s o rx uz h e n g ju n d r o u g h t ，l o wt e m p e r a t u r ea n dh i g hs a l ta r ea d v e r s ea b i o t i ce n v i r o n m e n t t h a tg r e a t l ya f f e c t e dt h eg r o w t ho fp l a n ta n dt h ep r o d u c t i v it ya n dq u a l i t y o fc r o p s d r e b t r a n s c r i p t i o n f a c t o rc a n s p e c i f i c a l l y i n t e r a c tw i t ht h e d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t cr e p e a t ( d r e c r t ) c i s a c t i n ge l e m e n tt h a t w a sr e p o r t e di nt h ep r o m o t e rr e g i o no fm a n ys t r e s s i n d u c i b l eg e n e sa n dc o n t r o l t h ee x p r e s s i o no fm a n ys t r e s s i n d u c i h l eg e n e si np l a n t ，a n ds oi n c r e a s e t o l e r a n c et od r o u g h t ，1 0 wt e m p e r a t u r ea n dh i g hs a l t i nt h i sp a p e rw ec l o n e dan o v e ld r e bg e n e ，a n ds t u d i e dt h ee f f e c to fd r o u g h t o nr i c eq u a l i t y t h er e s u l t sa r es h o w e da sb e o w 1 p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d n gt oh i g hh o m o l o g yi nt h ec o n s e r v e dr e g i o n s o ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fd r e bp r o t e i n ，a m p l i f l e dt h e mb yp e r ，a n dc l o n e d an o v e ld r e b 一1 i k eg e n e w en a m e di tb 0 2g e n e i tc o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f1 2 1 8n u c l e o t i d e s ，a n de n c o d e s4 0 5a m n oa c i d s t h ep u t a t i v ea m i n o a c i ds e q a e n c eh a sap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f4 4k d aa n dap lo f4 6 t h e r e isn oi n t r o ni nt h eo r fo f g e n o m i cg e n e i tc o n t a i n st h e t y p i c a c h a r a c t e r s t i e st od r e bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t h ep r o t e i nr i c hb a s i ca m i n o a c i di ni t sn - t e r m i h a lr e g i o nt h a tp o t e n t a 1 1 ys e r v e da san u c l e a r 1 0 c a l i z a t i o ns i g n a la n da na c i d i cc - t e r m i n a lr e g o nt h a tm i g h ta c ta sa t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nd o m a i n 5 8a m i n oa c i d sc o n s t i t u t eac o n s e r v e d r e g i o n sd n ab i n d i n gp r o t e i nd o m a i ni ni t sm i d d l er e g i o n ，t h e1 4 t ha n d1 9 t h a m i n oa c i d ss i t ea r ev a li d ea n dg l u t a m i ca c i d ，r e s p e c t i v e l y s e a r c h i n gt h er i c e9 3 1l g e n o m ed a t a b a s ew i t hb l a s tp r o g r a m w ed i s c o v e r e d b 0 2g e n ew a sl o c a t e da tc h r o m o s o m e5 w ef o u n dt h a tb 0 2h a dh i g hh o m o o g y w i t hs e v e r a ld r e b 2i np l a n t ，f o re x a m p l e ，6 7 i d e n t i t yt od r e b 一1i k ep r o t e i n 3 g e n e ( a y 6 4 6 2 2 3 ) f r o mi n d i c ar i c e ，6 7 a n d6 4 i d e n t it yt od r e b 2 a ( a b 0 0 7 7 9 0 ) a n dd r e b 2 b ( a b 0 0 7 7 9 1 ) f r o ma r a b i d o p s i s ，r e s p e c t i v e l y ，6 4 i d e n t i t yt o o s d r e b 2 a ( a f 3 0 0 9 7 1 ) f r o mj a p o n i c ar i c e ，5 8 i d e n t it yt od r e b 2 ga n d5 2 i d e n t i t yt od r e b 2 cf r o ma r a b i d o p s i s b a s eo nt h ea m i n oa c i d ss e q u e n c e so fa p 2d o m a i no fd r e bp r o t e i na n dv a e i r e a m i n oa c i d ss e q u e n c e sb e t w e e nv 14a n de 1 9 c o m p a r i n gt h e8 0 2t oo t h e rd r e b p r o t e i n sf r o mr jc ea n da r a b i d o p s i s ，w eg e tad r e bm o l e c u l a re v o l u t i o nt r e e a n df o u n dt h eb 0 2g e n eb e l o n g e dt od r e b 2 ，s or e n a m e di td r e b 2 1i k eg e n e t h e r e f o r ew em a yp r e d i c tt h a tit p o s s i b l yh a saf u n c t i o no fd r e b 2 ，t h e e x p r e s s i o np a t t e r n so ft h eb 0 2g e n em i g h tb ei n d u c e db yd r o u g h t ，h i g hs a l t a n da b a 2 u s i n g9h y b r i dc o m b i n a t i o n sa n d4r e s t o r e r1 i n e s ，t h ee f f e c to fc o n t i n u o u s d r o u g h to nr i c eq u a i t y ，w a sa n a l y z e dd u r i n gf l o w e r i n g ，f i i l i n ga n d s e e d s e t t i n gs t a g e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ed r o u g h tr e d u c e dm i11i n g q u a l i t yo fr i c e ，e s p e e i a l1 y ，m o s ts i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h eh e a dr i c er a t e t h ed r o u g h tt r e a t m e n ta l s oi n c r e a s e dc h a l k yg r a i nr a t ea n dc h a l k i n e s s s i g n i f i c a n t l y ，b u tt h ee f f e c to ng r a i ns h a p ew a sn o tv e r ys i g n i f i c a n t t h e s e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ed r o u g h tr e d u c e dg r a i na p p e a r a n c eq u a l j t y i no u r e x p e r i m e n t s ，b e c a u s et h ed r o u g h tr a is e dg e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，h a r d e n g e lc o n s i s t e n c ya n dd e c r e a s ea m y l o s ec o n t e n to fr i c e ，c o o k i n ga n de a t i n g q u a i t yo fr i c es h o u l db ei n f l u e n c e d s o ，i tw a sp r o p o s e dt h a tp r o d u c t i o no f g o o dq u a l i t yr i c es h o u l df i r s t l ys e l e c tg o o dq u a l i t yv a r i e t y ，m e a n w h i l e ， s h o u l dc h o o s ep r o d u c t i o nb a s ew i t hb o t ho fs u i t a b l et e m p e r a t u r ea n ds u n l i g h t c o n d i t i o na n dg o o di r r i g a t i o nc o n d i t i o n i nt h ec u l t i v a t i o no fq u a l i t yr i c e ， f i e l dw a t e rs h o u l db em a n a g e dp r o p e r l yd u r i n gf i l l i n ga n ds e e d s e t t i n gs t a g e s i nw h i c hs p e c i a la t t e n t i o ns h o u l db ep a i dt ok e e pf i e l ds u i t a b l ew a t e r ( s o i l m o i s t o r e ) i nt h e1 a t e rs t a g e k e yw o r d s ：r i c e ：d r e b ：g e n e ：a p 2d o m a i n ：r i c eq u a l i t y 4 第一章文献综述 第一节植物逆境生理及逆境应答机制 干旱、低温和高盐是目前影响农作物的主要非生物限制因子，它严重影响作物的 生长、产量以及品质。 我国农作物生产区广布于不同纬度、不同海拔地区，各种自然灾害( 如干旱、低 温等) 频繁发生，严重影响我国农作物的生产。据1 9 4 9 - 1 9 9 9 年的统计，平均每年受 旱面积约2 1 5 9 3 万公顷，因旱灾每年损失粮食1 0 0 亿公斤。其中，1 9 5 9 - 1 9 6 1 年的 三年连续干旱，受旱面积达1 0 9 8 0 万公顷，粮食减产6 1 1 5 亿公斤。2 0 0 0 年全国先 后有2 0 多个省市区发生旱灾，农作物受旱面积4 0 5 4 万公顷，其中成灾2 6 7 8 万公顷， 绝收面积8 0 1 万公顷，因干旱而减产的粮食超过4 5 0 0 万吨，经济作物损失5 0 0 多亿 元。2 0 0 1 年的旱情先后波及全国2 0 多个省市自治区。全国农作物受旱面积达3 8 4 6 万公顷( 是建国以来的第三位) ，成灾面积2 3 7 3 万公顷( 是建国以来的第二位) ， 粮食损失5 4 8 亿公斤( 是建国以来的第二位) ，经济作物损失5 3 8 亿元( 中国重大干 旱灾害数据库) 。 适宜的温度是农作物生长不可缺少的条件之一，随着经济的发展，生产水平的提 高，全球温室效应日趋明显的同时，各种极端反常气候也频繁发生，给农作物生产带 来巨大的损失。 同时，我国还有大面积的盐碱耕地和盐碱荒地，随着生态环境的日趋恶化，土地 荒漠化也有扩大和加剧的趋势。 随着科技的发展，农作物的产量有较大的提高，但这不能降低人口增长、耕地面 积减少以及各种自然灾害( 如干旱、低温等) 所带来的压力。因此，人们育种时除了 考虑提高作物产量这个主要目标，同时也注意到了作物抗逆的重要性，正试图通过各 种新技术增强作物的抗性来增强其稳产性及其品质稳定性。 本节拟就在干旱、低温和高盐等非生物逆境胁迫下，植物体内发生的一系列生理 反应和植物的逆境应答机制等方面加以阐述。 1 植物逆境反应的分子生理基础 1 1 植物的抗逆性 植物对逆境的抵抗或忍耐能力称为抗逆性，它是植物在长期演化过程中形成的对 不良环境的适应性。 植物的抗逆性可分为三种形式： ( 1 ) 避逆性( s t r e s se s c a p e ) 指植物通过调整生长发育周期，在时间上不与季节性或气候性逆境相遇，避开逆 境的干扰。这种方式在植物进化上十分重要。景天科酸代谢植物如仙人掌夜间气孔开 放，固定c 0 2 ，白天则气孔关闭，这样就防止了较大的蒸腾失水；有些沙漠植物在有 水时会迅速发芽，在几小时到几天的时间里完成发芽、生长、发育到开花结实的生命 全过程。避逆性的特点是不与逆境接触。 ( 2 ) 御逆性( s t r e s sa v o i d a n c e ) 指植物通过特定的形态结构消除逆境因子的影响，使其在逆境下仍能进行基本正 常的生理活动。逆境出现时，胁迫因子并未影响组织，植物体内不发生与环境变化相 应的变化。如仙人掌类植物叶片退化成刺，降低蒸腾，茎内贮存大量水分以避免干旱 带来的不利影响。 ( 3 ) 耐逆性( s t r e s st o l e r a n c e ) 指植物受到环境胁迫时，通过代谢反应来阻止、降低或修复由逆境造成的损伤， 使其仍能保持正常的生理活动。例如，植物遇到干旱或低温时，细胞内的渗透调节物 质会增加，以提高细胞抗逆性。耐逆性也是我们研究和下文中讨论的重点。 1 2 植物在逆境下的一般生理变化 ( 1 ) 逆境与植物细胞透性变化 植物细胞透性对逆境反应比较敏感，各种逆境都会导致细胞透性平衡的破坏，使 大量无机离子和氨基酸、可溶性糖等小分子被动地向组织外渗漏。细胞透性平衡破坏 的实质是细胞膜透性平衡的破坏。 ( 2 ) 逆境与植物的水分代谢 干旱、低温、高温、盐等各种逆境均可导致植物水分代谢发生变化，其吸水量、 蒸腾量均会低下，但当蒸腾量大于吸水量时，植物组织的含水量就会降低而使植物产 生萎焉。 ( 3 ) 逆境与植物光合作用 各种逆境均导致植物光合速率的下降和同化产物的减少。例如，在低温或高温时， 气孔关闭，c 0 2 扩散的阻力增加，光合作用相关酶钝化或变性；在干旱时，气孔关闭， c 0 2 扩散受阻；淹水时，水层阻碍c 0 2 扩散。 ( 4 ) 逆境与植物呼吸作用 各种逆境对植物呼吸作用均有明显影响。冻害、高温、盐和淹水胁迫时，植物 的呼吸速率明显下降；冷害、旱害时，植物的呼吸速率先升后降，即胁迫开始的短时 间内上升，2 - 3 天后随着胁迫时间的延长又明显下降。 ( 5 ) 逆境与物质代谢 各种逆境下植物代谢反应变化趋势相同，即水解作用增强，合成作用减弱，淀粉、 蛋白质等大分子化合物降解为可溶性糖、肽及氨基酸等物质。 ( 6 ) 逆境与核酸代谢 除了淹水外，各种逆境都会造成水分损失的胁迫，随着细胞脱水，其d n a 和r n a 含量减少。如在干旱下，干旱促使r n a 酶活性的增加，使r n a 分解加快，而d n a 和r n a 的合成则减弱。因此有人认为，干旱之所以引起植物衰老甚至死亡，与核酸代谢受到 破坏有直接的关系。 ( 7 ) 逆境与激素的变化 各种逆境都会使植物体内激素发生变化，如干旱时细胞分裂素含量降低，脱落酸 ( a b a ) 含量增加，这两种激素对r n a 酶活性有相反的效应，前者降低r n a 酶活性，后 者提高r n a 酶活性。脱落酸含量增加还与干旱时气孔关闭、蒸腾强度下降直接相关。 干旱时乙烯含量提高，从而加快植物部分器官的脱落。 植物遭受逆境胁迫后，首先发生细胞透性变化，继而出现代谢失调，严重的还会 对细胞造成机械性损伤，最终产生植物伤害。 2 植物逆境应答的分子机制 植物处于逆境时，其体内会发生一系列的生理生化反应来应答和忍耐干旱或低温 等逆境。植物对于不同的逆境具有相似的生理应答机制，本文以干旱为主介绍其应答 的分子机制。 研究表明，干旱等逆境可诱导多种基因的表达，根据基因产物的作用，可将这些 胁迫诱导的基因分为两大类“2 1 。 第1 类基因功能基因，包括在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质，这一类基因 的编码产物包括，直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白( 如l e a 蛋白、渗透调 节蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋白、离子通道蛋白、伴侣蛋白和m r n a 结合蛋白等) ；渗 透调节因子( 如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等) 的合成酶；以及毒性降解酶( 如谷胱甘 肽s 转移酶、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧 化物酶等) ，使细胞各种生理生化代谢活动能维持正常进行。这一类基因产物的具体 功能受到广泛重视，研究得比较透彻利用l e a 蛋白基因、脯氨酸合成酶基因以及甜 菜碱合成酶基因等进行转化，获得了一些耐旱耐盐性状得到改善的转基因植物。 第2 类基因是调节基因，在逆境中参与信号传导或基因表达调控，间接起保护 作用，这类基因编码的产物包括：传递信号和调控基因表达的转录因子( b z l p 转录因 子、婀c 转录因子、m y b 转录因子及d r e b 转录因子等) ；感应和转导胁迫信号的蛋白 激酶( 如：m a p 激酶、c d p 激酶、受体蛋白激酶，核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶 等) ：一以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶( 如磷酸酯酶、磷脂酶c 等) 。 阐明这些基因的作用对于了解植物对干旱的反应和通过转基因提高植物的耐抗 性具有十分重要的作用。 2 1 抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质 2 1 1 渗透调节剂 不同逆境都会直接或间接地对植物产生渗透胁迫。当植物处于低渗透势环境时， 在一定范围内，一些植物通过在细胞内积累各种有机和无机物质，以提高细胞液浓度， 降低其渗透势，这样植物就可以保持其体内水分，适应渗透胁迫，这种由于提高细胞 液浓度，降低渗透势而表现出的调节作用称为渗透调节。其细胞内积累的有机物质称 为渗透调节剂。 渗透调节剂( o s m o r e g u l a t o r ) ，也称渗透保护剂( o s m o p r o t e c t a n t ) 或相溶性 溶质( c o m p a t i b l es o l u t e ) ，是生物体合成的高度可溶的一类小分子有机化合物， 浓度高时也没有毒性。根据其化学性质，渗透调节剂一般可分为三类：( 1 ) 甜菜碱 及相关衍生物，包括甘氨酸甜菜碱，脯氨酸甜菜碱，b 丙氨酸甜菜碱和二甲基磺基 丙酸( d m s p ) 等。( 2 ) 多羟基醇和糖类，包括甘露醇，海藻糖等。( 3 ) 氨基酸类， 包括腑氨酸等氨基酸。 甜菜碱 甜菜碱是最重要，最有效的渗透调节剂之一，属于四甲基胺类化合物，在自然界 中广泛存在于微生物、高等植物和动物中，具有较强的溶解度，在浓度高时，对植物 无毒害作用，也不干扰细胞质的功能，且能有效地保持许多微分子的结构和功能。甜 菜碱的保护特性最早是在1 9 8 4 年发现的。在高盐浓度下，甜菜生长缓慢，而施加甜菜 碱后生长速度明显提高9 。 甜菜碱的生物合成是通过氧化胆碱进行的。胆碱氧化酶c o d ( c b o li n eo x i d a s e ) 和胆碱脱氢酶c d h ( c h o lif i ed e h y d r o g e n a s e ) 是甘氨酰甜菜碱合成中的关键酶，它们 催化的反应步骤分别是胆碱( c h o l i n e ) 一甜菜碱醛( b e t a i na l d e h y d e ) 一甜菜碱 ( g 1 y c i n eb e t a i i q e ) 。编码胆碱氧化酶的基因是c o d a ，编码胆碱脱氢酶的基因是b e t a 。 l i l u s 等( 1 9 9 6 ) 将b e t a 基因导入烟草，同野生型相比，所获转基因植物在3 0 0 m i “n a c 胁迫下，干重比对照增加8 0 ，表现出较强的耐盐性。h a y a s h i 等( 1 9 9 7 ) 将土壤细 菌中编码胆碱氧化酶的基因c o d a 转入拟南芥中，结果转基因植物中积累甜菜碱，对盐 和冷胁迫的抗性增强【5 j 。 许多研究也证实甜菜碱在植物抗逆性中有非常重要的作用，在逆境条件下，许多 植物体p q 都会积累甜菜碱，且甜菜碱的含量与植物的抗性密切相关嘲，陈少良等 ( 2 0 0 i ) 以抗旱耐盐性强的胡杨和非抗盐的群众杨为实验材料，研究了盐胁迫条件下 盐分与甜菜碱、还原糖、蔗糖以及水溶性糖等细胞相溶质的动态变化。结果发现，在 盐胁迫下，胡杨叶片中甜菜碱的浓度提高了2 4 3 倍，根中甜菜碱含量也增加了9 倍， 而群众杨叶中甜菜碱并无显著提高【7 】。许雯等( 2 0 0 1 ) 对青菜叶面喷施甜菜碱，发现 一定浓度范围内的甜菜碱可明显增强青菜对盐胁迫的抗性i8 i 。 脯氨酸 脯氨酸是组成性的氨基酸，存在于细菌、藻类、高等植物和哺乳动物等多种生物 中。研究表明，在干旱、高盐、或低温等逆境胁迫下，大多数生物体内都会积累较高 水平的脯氨酸m ，从而起到调节渗透压的作用。除此功能外，脯氨酸还是重要的碳源 和氮源物质，在许多植物的果实、种子中，有丰富的脯氨酸积累，它可作为种子萌发 的营养物质m j 。 植物细胞中存在两种脯氨酸合成途径，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径。在植物发育 早期，两条合成途径同时存在，外界胁迫对两条途径均有诱导效果；在成熟的植物组 9 织中检测到的鸟氨酸合成途径的酶活- 生较低，鸟氨酸一0 一氨基转移酶基因的表达基 本检测不到，脯氨酸的合成途径主要是通过谷氨酸途径。谷氨酸合成脯氨酸途径需要 两个主要的酶：即吡咯啉一5 一羧酸合成酶( p s c s ) 和吡咯啉一5 一羧酸还原酶( p 5 c r ) ， 其中p 5 c s 可能是脯氨酸合成的限速酶，其基因已分别在拟南芥和水稻中克隆。p 5 c r 基因也从其它几种植物中得到克隆。 编码p 5 c s 的基因在转基因烟草中可以得到过量表达，其脯氨酸的含量比对照增加 了1 0 一1 8 倍。而且，在盐胁迫下，与对照相比，转基因植株的根长度和干重明显增加， 花的发育也比对照要好，果荚数量和每荚种子数也相应增加1 。p h u t e l a 等( 2 0 0 0 ) 以对干旱反应不同的5 种基因型拟南芥为材料，研究在水胁迫下的脯氨酸代谢，结果 表明：脯氨酸代谢与水分密切相关，水分胁迫时脯氨酸合成酶活性增加。但也有些实 验结果与此不一致，有些与环境胁迫无关的因子也会导致脯氨酸的过量积累，如拟南 芥突变体s o s i 中，其脯氨酸含量比野生型的积累的多，但对盐的敏感性却比野生型的 高2 0 倍以上m 1 1 ”，也许是在脯氨酸信号的传递过程中受到某种阻害而造成的。贺等 ( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 从大豆中克隆了编码脯氨酸基因s b p r p 的c d n a ，通过对其表达模式的 研究，证实p r p 的表达不仅受病菌( 如大豆花叶病毒) 影响，同时它的转录还受环境 胁迫的调节，结果表明编码脯氨酸基庆i s b p r p 在应答内外环境因子起着重要的作用 u t l 5 。 甘露糖 甘露糖醇是生物体内包括细菌、藻类、真菌和1 0 0 多种高等植物中广泛分布的一 种糖醇。 在甘露醇合成过程中起关键作用的酶，在细菌中为甘露醇一卜磷酸脱氢酶，其编 码基因：为m t l d 【1 6 1 。用细菌来源的m t l d 基因转化烟草，在盐胁迫下，转基因植物大量合 成并积累甘露糖醇，从而使转基因烟草抗盐特性增强”l 。t h o m a s 等( 1 9 9 5 ) 将m t l d 基因转到拟南芥，获德了表达甘露糖醇的转基因株系，而在菲转基因拟南芥中则没有 发现甘露醇的存在。在盐胁迫下，表达甘露醇的转基因种子可以萌发，而对照的种子 却不能萌发【1 8 】。 果聚糖 果聚糖是果糖多聚物，作为一种可溶性碳水化合物存在于植物细胞的液泡中，能 1 0 在多种植物与细菌内合成。催化细菌果聚糖合成的催化酶被称为果聚糖蔗糖酶。 e b s k a m a p 等( 1 9 9 4 ) 将编码枯草杆菌果聚糖蔗糖酶的s a c b 基因导入烟草，在正常生 长条件下，转基因烟草中积累了大量的果聚糖，但并未影响植株的生长与生物产量。 而在p e g 介导的渗透胁迫下，转基因烟草的生长速率、鲜重、干重分别比野生型高5 5 、 3 3 年f f 5 9 ，表明果聚糖的积累与转基因烟草的抗旱性有关 1 9 , 2 0 i 。 在逆境胁迫下，植物体内还会积累其它一些小分子物质，如海藻糖、山梨糖、棉 子糖和多胺等，它们对植物抗逆都起着积极的作用。 2 1 2l e a 蛋白质 l e a 蛋白质，即种子胚后期富含蛋白质( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ) 。随着 神子的逐灏成熟，种子中水分逐渐减少，从而引起干旱胁迫。表达研究发现，在棉花 中l e a 基因，是一个大家族，所克隆的多个基因都表现出相似的表达模式，即：它们 在胚胎发育的后熟阶段前开始表达和随着种子的萌发而很快消失。因此，l e a 蛋白质 被认为是种子胚发育时忍耐胁迫的一种保护性蛋白质。根据其氨基酸同源性可以将这 类基因分为4 组【2 1 l ：第一组l e a 蛋白受a b a 和渗透胁迫所诱导，如d 一1 9 中的l e a s 同系物 在渗透胁迫的幼苗中表达，其作用被推测是固定水分，供给保护细胞的水合环境；第 二组l e a 是与水稻t a d 基因及玉米和大麦的脱水素( d e h y d r i n ) 蛋白质同源，被认为在 稳定膜结构和细胞蛋白问相互作用中具有重要功能，也具有稳定核和细胞质中大分子 物质的功能。第三组l e a ( 棉花d 一7 ) 以“一氨基酸基序的重复为特征，在水稻受到水 分胁迫和盐胁迫时可以改善它生长，表现出抗干旱和耐盐的特性1 2 2 】。第四组l e a 蛋白 代表是番茄的l e 2 5 ，在种子成熟时期以及逆境胁迫( 如干旱、高盐和低温) 可诱导其 表达口”。l e a 蛋白质的一般特征表现为具有亲水性、高溶性和缺乏特定信号序列等特 点，它们可以维持细胞溶胶稳定性。因此，在植物抗逆性上起着重要的作用。 2 1 3 抗氧化防御系统 植物必须依赖氧才能获得能量、维持生存，然而氧对植物又可能产孛毒害作用。 一般把植物体内直接或间接由氧转化而成的某些氧代谢产物及其衍生的含氧物质统 称为活性氧，植物体内的活性氧超过正常水平时，会对细胞构成氧化胁迫，将使生物 膜遭到破坏，特别是破坏线粒体和叶绿体的膜系统】。植物体内清除活性氧的酶主要 有超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸氧化酶 ( a s b p o d ) 、脱氢抗坏血酸还原酶和谷光甘肽还原酶( g r ) 。植物活性氧清除剂主要 有类胡萝h 素、抗坏血酸等。 超氧化物歧化酶( s o d ) 是美国科学家f l c c o r da n df r i d o v i c h1 9 6 9 年从牛血红细胞 中发现的一种超氧化物岐化酶，是一种结合金属离子的蛋白质，广泛分布于各种生物 体内，是体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一。目前已知的s o d 主要分为三类，即 f e s o d ，m n s o d 和c u z n s o d 。其中f e s o d 主要存在于原核生物，c u z n s o d 主要存在于 包括人类在内的所有高等真核生物中，而m n s o d 存在于原核生物和真核生物的线粒体 中，三类s o d 可能具有不同的进化祖先。s o d 的主要功能是清除体内有氧代谢所产生的 超氧自由基( 0 2 。) 。 几种s o d 基因的克隆已从植物中分离并用来转化不同的植物，并获得t s o d 活性得 到增强的转基因植物。将从於草的m n s o d 基因导入烟草中，转基因烟草对氧化胁迫的 抗性得到提高，其中氧化胁迫对叶绿体的伤害下降了3 4 倍| 2 5 l 。转基因苜蓿叶绿体 中s o d 的过量表达提高了植物的抗冻能力 2 6 1 。 2 1 4a b a 的作用 a b a 是1 9 6 3 年a d d i c o t t 在研究棉花脱落幼果发现的，与此同时，w a r e i n g 等人从 秋天即将休眠的桦树叶中也分离到同种物质，1 9 6 7 年在第6 届国际生长物质会议上 将这种生长调节物质正式定名为a b s c i s i ca c i d ( 脱落酸) 。 脱落酸在植物体内主要有两种作用：一是介导植物对环境胁迫( 如高盐、干旱、 低温等) 产生应答，特别是在植物水分胁迫的反应中起着重要作用，如在干旱胁迫下， 植物内源a b a 水平会明显增加，随之其耐旱性增强；二是在调控种子发育过程中起重 要作用，a b a 能抑制细胞伸长和分裂，诱导种子休眠，防止过早萌发，积累贮藏蛋白 等物质、抗脱水等。 2 1 5 乙烯的作用 乙烯是参与植物生长发育调控的重要植物激素，在植物体内主要有三种作用，它 最主要的功能是调控植物的衰老，尤其是控制果实的软化、成熟过程；二是影响种子 萌发、叶片脱落、花的形成、性别分化及植物偏上性；三是参与植物对病原侵染、干 旱、伤害和水涝等各种胁迫的应答。 2 2 参与信号传导或基因表达调控的转录因子 2 2 1 转录因子 转录因子，也称反式作用因子，是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件 发生特异性相互作用的d n a 结合蛋白。通过它们之问以及与其它相关蛋白质之间的相 互作用，激活或抑制基因的转录。植物中存在着大量的转录因子，据报道拟南芥基因 组中有5 以上至少1 8 0 0 个的基因编码转录园子2 7 。 2 2 2 转录因子的结构 转录因子一般由d n a 结合区、转录调控区( 包括激活区或抑制区) 、寡聚化位点 和核定位信号4 个功能区组成，转录因子通过这些功能区域与启动子顺式元件作用或 与其它转录因子的功能区域相互作用来调控基因的转录表达1 。 d n a 结合区 d n a 结合区是指转录因子识别d n a 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列， 同类型转录因子的d n a 结合区域，其氨基酸序列较为保守。d n a 结合区存在一些特殊 的基序结构，常见的有以下几种：螺旋一转角一螺旋( h e li x t u r n h e l i x ，h t h ) ， 锌指( z i n cf i n g e r ) ，亮氨酸拉链( 1 e u e i n ez i p p e r ) ，螺旋一突环一螺旋 ( h e ljx l o o 旷h e li x ，h l h ) 。 转录调控区( 包括激活区或抑制区) 同类转录因子的主要区别在于它们的转录调控各不相同，转录调控区包括转录激 活区和转录抑制区两种，它们起到决定转录因子功能差异的作用。一般包含d n a 结合 区以外的3 0 1 0 0 个氨基酸残基，而且有时一个转录因子可含1 个以上的转录激活区。 常见的转录激活区结构有以下3 种： a 富含酸性氨基酸结构区：该类结构区含有酸性氨基酸的保守序列，形成带负电荷 的螺旋区。酵母活化因子g a l 4 、糖皮质激素受体和a p l 等就属于这类结构。 b 富含谷氨酰胺结构区：首先最先在s p l 中发现，其n 端有两个转录激活区，其中， 谷氨酰胺残基含量可达2 5 。 c 富含脯氨酸结构区：在c t f 蛋白质家族的c 末端区域，与转录激活有关，其脯氨 酸残基可达2 0 一3 0 。 寡聚化位点 寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保 守，大多与d n a 结合区相连并形成一定的空间结构。如b z i p 类转录因子的寡聚化区 包括1 个拉链结构，而b h l h 型转录因子含有螺旋一环一螺旋结构。 核定位信号区 核定位信号区( n l s ) 是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域。转 录因子进入细胞核的过程受该区段控制。不同转录因子中的n l s 的构造和数目有所不 同，一个转录因子可含1 至数个n l s 功能区，它们不规则地分布在转录因子中，有的 n l s 如o ：转录因子的n l s 被包含在其它功能区域内。 2 2 3 转录因子的活性 编码转录因子的基因，其表达受细胞发育阶段与外界环境等因素的调节。除此之 外，转录因子的活性也受许多其它因素的影响。如转译后修饰、在细胞中的位置以及 与其他蛋白质问的相互作用等都能影响转录因子的活性。 2 3 逆境信号传导过程中的转录因子 在分析拟南芥a b a 缺失和a b a 不敏感突变株，以及野生型拟南芥在干旱、低温诱导 表达型基因后，特别是在分析r d 2 9 基因的启动子和其启动子结合蛋白后，发现植物中 逆境胁迫应答基因的转录至少存在两种独立的信号转导途径旧”翔】。即依赖a b a 和不依 赖a b a 的信号传导途径( 图1 ) 。 引白( k a z u os h i n o z a k ia n dk a z u k oy a m a g u c h i s h i n o z a k i2 0 0 0 ) 图1 干旱和低温逆境下的细胞信号转导途径 fig 1c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y sb e t w e e nt h ei n i t i a ld r o u g h t s t r e s so r c o l d - s t r e s sa n dg e n ee x p r e s s i o ni na r a b i d o p s i s 2 3 1 依赖a b a f l ( 信号转导途径 a b a 诱导的基因表达中根据是否需要新的蛋白质( 如：m y c m y b 蛋白) 的合成，其信 号转导途径又可分为两条途径。 许多植物在于旱和高盐条件下，内源a b a 水平会显著提高 1 , 2 , 3 0 , 3 2 , 3 3 1 。拟南芥中应答 低温胁迫时，a b a 在回到基础水平时会瞬时提高【3 4 ”j 。许多受干旱和高盐诱导的基因， 同样也受外源a b a 的诱导，这些基因的启动子区域包含了a b a 应答元件( 目p a b r e s ： p y a c g t g g c ) ，a b r e 的功能是作为顺式作用元件参与至o a b a 调节基因的表达中。a b r e s 首次在小麦的e m 和水稻的r a b 基因中被报告，a b r e d n a 结合蛋白e m b p 一1 的c d n a 编码一 个b z l p 蛋白质，于1 9 9 0 年首先从玉米中分离到”6 1 。它具有亮氨酸拉链基序，b z i p 转录 因子是一个大的基因家族