蛋白质工程.ppt

要实现蛋白质工程必须由3部分的科学家共同努力才能完成。,蛋白质空间结构测定的专家;蛋白质分子设计的专家基因工程的专家。,空间结构测定的专家:主要应用X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。,多维核磁共振技术和电子衍射等电子晶体学的技术已用来确定生物大分子的结构和溶液构象。,确定哪些特征结构决定了它们的生物功能，从而发现结构与功能相关的规律。蛋白质的哪些部分比较脆弱，哪些部分比较牢固，哪些部分比较坚硬，哪些部分比较柔软，哪些部分可以引起人们不希望的毒、副作用，等等。,分子设计的专家:在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，主要通过理论的方法，提出蛋白质改性的设计方案。,这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同，这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化，从而能赋予新蛋白质什么样的特性。,当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具，采用基于物理学原理的各种模拟方法和基于蛋白质分子结构知识的模型构建方法，或兼用这两类方法。,基因工程的专家:在得到了新的蛋白质的改性设计方案之后，就用一套分子生物学的技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白质的产物，最后通过分离、纯化，提取出足够纯的新蛋白质以研究它的性质。,胰岛素是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药物，但是天然的胰岛素在人体中的寿命只有几个小时要想得到长效的胰岛素，一个直观的设计思路就是在维持活性部位结构不变的同时，增加其他部位的结合强度，使之更难以被酶所破坏。我国科学家实现的一个巧妙的方案就是增加胰岛素多聚体之间的结合强度，以实现长效的目的。,(1)胰岛素的蛋白质工程,核糖体失活蛋白除有引产作用外，也能抑制肿瘤细胞的生长和艾滋病病毒的复制。但天花粉的毒副作用也很强，很易引起过敏等免疫反应。通过对天花粉晶体结构的分析发现，它的活性中心部位和引起过敏的部位是分离的，这就为天花粉的改性提供了可能。,(2)天花粉的蛋白质工程,其改型设计方案就是尽量把鼠抗体的氨基酸序列和它的空间结构改变成人的。早在1988年英国剑桥大学的Winter等人就开展了这方面的工作，近几年来，我国科研人员也进行了抗体人源化方面的研究，并得到有活性的重链单域改性重组抗体。,(3)抗体的人源化,鼠抗体OKT3结合位点结构模拟和改性设计,决定抗原特异性的主要是互补决定区(complementarydeterminedregions,CDRs),在抗体改性的最初阶段，通过基因工程将人的C区连接到鼠的V区上，制出了基因工程抗体，称为嵌合抗体(ChimeriCantibody)。由于抗体的抗原结合位点位于V区内，因此嵌合抗体仍保留了结合抗原的能力，同时，由于C区已替换成为人的，这就在一定程度上解决了异源抗体问题。但由于嵌合抗体的V区全来自鼠，仍然有可能引起宿主的过敏反应，所以它不是好的抗体改性产物。,一种方案就是仅用鼠的CDRs代替人的CDRs，V区的其他部分均选用人的。原则上，这种改性能够保持亲代鼠抗体的抗原特异性，又能更大程度地消除宿主免疫反应。这样的抗体比嵌合抗体更接近人的抗体，故称为人源化抗体或改型抗体(reshapedantibody)。,第一个按此方案进行的人源化抗体的亲和力却仅为原来鼠抗体的亲和力的1/40。,经仔细分析鼠抗体V区的序列，尤其是位于CDRs邻近处的序列，以及相应的空间结构，发现邻近CDRs的残基对于抗体的CDRS与抗原的结合也起到重要的作用，因此必须在人源化方案中加以考虑。根据这一思想，研究者对T淋巴细胞膜抗原(CD3)的鼠抗体OKT3的可变区(V区)进行了人源化设计，在模拟了OKT3空间结构的基础上，又构建了人源化的OKT3的空间结构，并比较了改型设计对CDRs构象的影响。研究结果表明，人源化过程并没有使CDRs的构象产生较大的改变，因而改型抗体应保持原有活力。按此方案经基因工程技术生产的单域抗体确实具有活性。这一实验结果说明，抗体的人源化是可行的。,像凝乳酶枯草杆菌蛋白酶葡萄糖异构酶、胰蛋白酶等的研究都取得了明显进展。,与乳制品的生产有关,是洗涤剂的添加剂，用于清除蛋白质的污渍等。,二、蛋白质工程领域的开创性工作,早在1987年美国杜邦公司的DeGrado等人就利用当时已积累的蛋白质分子空间结构与构象的规律，经过精心的设计并由多肽合成法产生出了一个由74个氨基酸组成的非天然蛋白质。它具有设计者所期望的典型的4股螺旋结构。这一工作被称为蛋白质分子设计的第一个里程碑。紧接着Duke大学的Richardson夫妇经过从头设计并用基因工程的方法不仅合成了另一种4股螺旋的非天然蛋白质，还合成了全折叠结构的，称为betabellin的非天然蛋白质。此后的一系列从头设计(Denovo)的实验结果说明，定向地设计与合成具有人们所要求的空间结构与性质的蛋白质是合理的、可行的。此后对分子量较小的各种类型药物的设计、研究与生产也蓬勃地开展起来。并有若干个成功的例子。,艾滋病毒HIV蛋白水解酶抑制剂的设计。HIV-l蛋白水解酶是由两个含有99个氨基酸残基的单体组成的天冬氨酸水解酶，它在将艾滋病毒导入人体细胞过程中起了重要作用。高效的该酶抑制剂将是治疗艾滋病的有前途的药物。两个大的制药厂Abbott(Chicago，IL，USA)和DuPontMerck(Glenolden，PA，USA)分别使用计算机辅助设计合成了具有对称性的，口服有效的HIV蛋白酶抑制剂。DuPontMerCk的产品DMP323正在进行临床试验。,胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂:它是由Agouron药厂(LaJolla，CA，USA)基于该酶活性中心区结构的知识设计的。作为一个抗肿瘤药物目前正在临床试用,凝血酶抑制剂的设计，高血压蛋白酶原抑制剂的设计,当前蛋白质工程研究的热点主要集中在两个方面:,一方面是:对具有明显生物功能的天然蛋白质分子，加以改性;另一方面:是基于生物大分子结构知识的药物设子.,三、蛋白质的改性及分子设计当前蛋白质工程研究的热点之一,到1999年2月3日，在PDB(proteindatabank,BrookhavenNationalLaboratory)库中收集的生物大分子空间结构数据已达9226套，其中蛋白质结构8568套，核酸结构646套，糖类结构12套。这就使得基于蛋白质和核酸结构上的药物设计成为可能。,这是因为任何药物都是作用在相应的受体上的，这些受体或靶分子往往又是蛋白质或核酸。如果我们有了这些大分子的结构，就容易发现哪些物质能与这些受体发生特定的结合，使得药物的筛选与设计有了科学依据，避免了盲目性。这就是基于生物大分子结构知识的药物设计。,选择蛋白质工程改造对象时往往要考虑以下几个方面:,（1）改性对象有没有测定出空间结构。（2）结构和生物功能的联系是否明确。（3）所选对象的重要性。（4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。,肿瘤坏死因子,它的生物学作用是抑制肿瘤血管的形成。因此就可有效地抑制肿瘤。但是研究还发现，肿瘤坏死因子有很强的毒副作用。如不能有效地降低其毒副作用，就不能将其用于肿瘤治疗。有报道说，我国科学家己经通过蛋白质工程的技术，改变了天然肿瘤坏死因子的结构，使其毒性大为降低，同时还保留了生物活性。,肿瘤细胞区别于正常细胞的基本特征是：细胞生长失控和分化受阻,因此易于恶性生长和转移。导致肿瘤发生的主要原因是：存在于人类染色体上的癌基因被活化估计在人类基因组中约有1000个原癌基因位点。,P53蛋白,它是抑癌基因P53的表达产物,因此研究癌基因的结构，在染色体上的分布以及如何阻止它的活化一直是肿瘤学研究的热点。自1986年人类第一个抑癌基因Rb(视网膜母细胞瘤基因)被分离克隆时起，人们认识到染色体上还存在另一类基因，它可以抑制肿瘤的发生。由此细胞癌变机制研究的热点就由癌基因过渡到抑癌基因。,近年来逐步有许多抑癌基因被认识，并被克隆鉴定，目前己发现的有Rb、P53、DCC、Wtl、NFl、BRCAl、MTSl、NF2、APC等约30种。其中P53被认为是肿瘤抑制基因家族中的主要成员之一，P53基因突变是至今已知的与癌症相关的最普遍的基因变化，约50%癌症是由于P53基因突变引发的。在通常的肿瘤中，约70%的结肠癌、50%的胃癌、40%的乳房癌发生P53基因突变。P53也与血癌和淋巴癌有关，包括Hodgkins病、T淋巴细胞病和白细胞病。,因此，P53蛋白被列为Science1993年的分子(themoleculeoftheyear)，美国Discovery称它为1992年的基因。,野生型P53基因及其表达的P53蛋白具有多种功能:(1)野生型的P53基因作为转录因子调节细胞生长和分化。(2)野生型P53基因能监视细胞基因组的完整性。当细胞损伤后，P53蛋白积累，DNA复制停止，使DNA有足够的时间得到修复;如果修复失败，P53蛋白能够通过程序性细胞死亡过程(apoptosis)诱导细胞自杀。(3)野生型P53基因能够抑制细胞生长，协调细胞周期的进展和DNA复制。,方法是：将野生型P53基因导入体外转化细胞或直接注射到肿瘤组织中使其抑制恶性表达，这种基因疗法已有实验证明。,P53基因定位于人17号染色体的短臂17P13.l区，全长约20kb(kb是千碱基)。P53基因的产物位于细胞核，是一种由393个氨基酸组成的蛋白，分子量约为5OkD。P53基因由11个外显子和10内含子组成，不同物种的P53mRNA长度为2kb3kb。P53基因有5个高度保守区:即第1319,117142,171192，236258,270286氨基酸的编码区。,P53蛋白的二级结构也高度保守，蛋白质的氨基端为酸性区，从l至80位氨基酸残基，具高活性，易形成螺旋结构，目前被认为是转录活化区。羧基端为碱性区，从319至393位氨基酸残基，也具活性并易形成螺旋和转角结构，目前认为与四聚体形成相关。从102至292位氨基酸残基为其核心结构域。,近几年国外科学家发现，切掉P53的最后约30个残基，即保留363位以前的残基，可以提高野生型P53蛋白的活性。这为P53的改性设计提供了可能。,正在进行设计与改性的与人类健康有关的蛋白质还很多。它们往往是针对严重的人类疾患，像冠心病、肿瘤等和常见病、多发病，像流感等。一些具体的对象，例如:,核糖核酸酶、蛇毒、蝎毒的毒蛋白、天麻抗真菌蛋白、水蛇素等，,医用蛋白质设计的一个新的方面是把完成不同功能的两个蛋白质或肽类用一段仅起连接作用的肽(连接肽)组合在一起，成为一个复合蛋白质，使其兼具两者的功能。重要的是关于“导向药物”的设计，它的一个组分起常规药物的作用，另一个组分与药物作用对象有高度的亲和性，起导向作用。例如:我国科学家研制的脑啡肽和干扰素的复合蛋白，前者能与特定的细胞亲合，后者起治疗作用。,国际上也发展了以抗体为药效部分，以多种细胞结合蛋白为导向部分的融合蛋白药物。这种新的方向，导致了一个新的研究课题的产生,即:连接肽的设计。这一课题的目标是设计特定的短肽，把不同的功能蛋白或肽结合起来、并使它们保持各自的完整活性。,四、基于生物大分子结构的药物设计当前蛋白质工程研究的热点之二,X射线晶体学技术多维核磁共振(NMR)波谱学技术二维电子衍射三维图象重构技术等,为蛋白质空间结构测定提供了有效的试验手段，,这些方法依然存在局限:X射线晶体学技术需要得到适当的蛋白质晶体;NMR技术现在还不能有效地测定分子量大于3万的样品;电子晶体学技术目前还正在发展。人们尚不能估计有多少人类蛋白质最终可由上述试验方法测定，又有多少蛋白质不能测定。因此，理论模拟与结构预测就显示了重要性，正在日益发展和受到人们的重视。,理论研究不仅可提供生物大分子空间结构的信息，还能提供电子结构的信息，如能级、表面电荷分布、分子轨道相互作用等以及动力学行为的信息，如生物化学反应中的能量变化、电荷迁移、构象变化等。理论模拟还可研究包括生物分子及其周围环境(如水、离子等)的复杂体系和生物分子的量子效应。,药物的治疗作用主要是通过药物与受体的相互作用。在生物体中受体多半是生物大分子，像蛋白质和核酸，而以蛋白质居多。如果人们了解了受体蛋白的结构，就可以根据其结构来研究药物是怎样改变它的构象，进而产生治疗作用的。设想各种可能的药物结构来模拟这种相互作用就有助于找到较好的药物。这是当前药物筛选中的一个合理的和有效的途径。这种基于大分子结构的药物设计，使得常规的药物开发从较随机地筛选，逐渐过渡到理性化，避免了过多的财力和时间的浪费和盲目性。,(1)基于酶结构的药物设计,主要是设计特定酶的抑制剂或激动剂。,胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、羧肽酶A抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、凝血酶抑制剂等。,蛋白激酶类抑制剂的设计是当前的热门，比如酪氨酸蛋白激酶，它在细胞增殖、细胞转化、代谢调控以及细胞通讯的许多方面都起着十分重要的作用，细胞表面酪氨酸激酶受体的失控信号与细胞内的酪氨酸激酶能导致炎症和癌症、粥样硬化、银屑病等多种疾病。它的抑制剂的设计可以发展一类有效药物用于治疗上述疾病。,(2)基于抗体结构的药物设计,抗体衍生的小分子药物,(3)基于致癌、抑癌基因表达产物的药物设计,致癌基因表达产物(如ras蛋白)抑癌基因表达产物(如p53蛋白),(4)基于细胞表面受体结构的药物设计,CD4和生长因子受体,(5)基于转录因子结构的药物设计,锌指、亮氨酸拉链，螺旋-环-螺旋等,五、蛋白质结构预测与药物分子设计,第一类是同源预测