（土壤学专业论文）蚯蚓蛋白酶解工艺与氨基酸螯合盐的制备及生物效应研究.pdf

山东农业大学硕十学位论文 中文摘要 蚯蚓蛋白资源化利用，已由原单方向的饲料化利用转向了多功能产品 的开发利用。氨基酸螯合金属盐的制备是涉及到氨基酸的制备，螯合物的 合成及后期产物生物效应检测( b i o a s s a y ) 的系统工作，螯合盐在微量元 素肥料、液体肥料、动物饲料添加剂、种子包衣剂生产中的运用相当广泛。 本研究利用蚯蚓蛋白作为氨基酸供体，对比了蚯蚓自溶和添加外源蛋白酶 水解产率的变化，并引入响应面( r s m ) 设计优化酶解条件，筛选出螯合 铜、锌盐的最佳螯合条件，最后通过生物检测，即小麦发芽率试验和小麦 种芽敏感性试验，检验f e s 0 4 ，e d t a f e ，a a f e 三种铁盐的生物效应， 评价了三种铁盐的对小麦种芽相关部位和功能体的靶位作用。主要研究结 果和结论如下： 1 整个水解过程中酸性蛋白酶处理的氨基态氮浓度都明显高于自溶 处理，差异显著，从3 h 到8 h 时，加酶处理水解度由1 2 7 提高到2 2 ， 自溶处理水解度由6 6 2 提高到1 6 0 5 ，同时酸性蛋白酶相对于自溶处 理的水解度提高率由9 1 8 下降到3 7 1 。 2 水解时问x 和氨基态氮浓度y 进行拟合，酸性蛋白酶处理与自溶 处理方程分别为：y = 0 4 3 2 x e x p ( 0 1 3 0 ；y = 0 2 6 0 x e x p ( o 1 4 3 x 1 ，模型的相关系 数分别为0 9 3 8 3 * ，0 9 9 2 8 * * 。自溶模型拟合度低于加酶处理模型，蚯蚓 自溶过程是一个不稳定的反应过程。 3 生产工艺中原材料的保存方式对后期酶解工艺的影响甚为重要， 4 。c 和2 5 。c 条件保存及放置时间对后期蚯蚓自溶工艺的水解率产生了显著 的影响，4 。c 存放蚯蚓匀浆物在相同放置时间内水解率均大于2 5 的水解 率，两者差异显著。4 。c 条件下存放有利于后期酶解流程中水解率的提高， 存放时间不宜超过4 h 。 4 编码值温度( a ) 、酶浓度( b ) 、酶解时间( c ) 的响应面分析试 验，利用d e s i g ne x p e r t 7 1 回归分析，得到水解率预测值( y ) 对编码自 变量a ，b ，c 的回归方程为： y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 0 9 2 c + 1 2 3 a b 0 7 0 a c 0 5 5 b c + 1 5 8 a 2 + o 2 4 8 2 - 0 5 c 2 ，系数显著性检验后模型修正：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 1 5 8 a 2 ，模型中 a ，b ，c 求偏导，得出最佳条件：温度= 5 0 ，酶浓度= 5 ，酶解时间= 4 3 4 h 蚯蚓蛋亡| 酶解工艺与氨某酸整合盐的制备及生物效心研究 5 铜螯合的最佳条件：温度4 0 ，时间3 0 m i n ，质量比2 ：l ；锌离 子螯合的最佳条件：温度3 0 ，时间5 0 m i n ，质量比2 ：1 6 发芽率是生物检测的常用方法，a a f e 在1 旺1 0 0m g l 一，对小麦 发芽率的促进和抑制均不明显，2 5 0 m g l 。1 的发芽抑制率突然提高。铁盐 的品种不同对小麦根长的抑制程度不同，超过1 0 0m g l ，三种铁盐均抑 制伸长和质量，抑制率a a f e 最高。 7 三种铁盐浓度与发芽指数( g i ) 间的曲线模型可分析评估三种铁 盐的生物活性，三类铁盐模型分别为l n y = l n ( 9 9 6 3 7 8 ) 0 0 1 6 2 7 x ， y = 9 7 1 6 4 2 2 8 8 9 l g x + 8 5 8 8 ( 1 9 x ) z ，y = 9 9 4 6 4 0 4 7l g x ( x - 铁盐浓度， y ：发芽指数) 。 8 小麦种芽对铁盐的影响尤为敏感，最为直观的反应为芽叶与根的 生物量和伸长度的变化。根在形态与质量上响应敏感度高于芽。浓度大于 1 0 0 m g l 。1 时，三种铁盐对根与芽叶的伸长，鲜重均产生不同程度的抑制， 其中以a a f e 的抑制程度最高，三种铁盐根伸长抑制率a a f e f e s 0 4 e d l a f e 。 9 从铁盐对小麦光合系统影响角度分析，a a f e 的对小麦的抑制起 始浓度在5 旺1o om g l 以之间，f e s 0 4 与e d t a f e 对小麦的抑制起始浓度 在1 0 0 _ _ 2 5 0m g l 。1 之间。三种铁盐对叶绿素的抑制性a a f e 最强，其次 为f e s 0 4 ，e d t a f e 最小 l o 芽叶和根m d a 浓度应铁盐品种和浓度的变化而变化，f e s 0 4 与 e d t a f e 处理的芽叶和根中m d a 的浓度随铁盐浓度提高先上升，后稍有 下降，芽叶m d a 变化幅度分别为4 1 3 2 一1 7 2 和2 4 3 1 一1 4 8 9 6 ， 根m d a 变化幅度分别为7 5 一5 7 1 和9 0 7 8 哆仁乏8 5 8 2 ；a a f e 处理 的芽叶和根中m d a 的浓度随铁盐浓度而提高，变化范围分别为 2 6 0 4 一1 0 3 8 2 和2 l 5 2 4 8 ，m d a 在根中变化幅度大于芽叶。 1 1 测定指标对于铁盐浓度的响应度上，抑制率指标 脂膜过氧化指 标 叶绿素指标，生长指标( 抑制率指标) 的响应度高于生理指标( 叶绿 素指标、脂膜过氧化指标) 。f e s 0 4 作用靶位主要为芽，e d t a f e 与a a f e 作用靶位主要为根；小麦根脂膜系统对f e s 0 4 和a a f e 的响应度高，幼 芽脂膜系统对e d t a f e 相对更敏感。 2 山东农业大学硕上学位论文 关键词：蚯蚓蛋白，自溶，水解，响应面设计，螯合，小麦，生物检测 蚯蚓蛋臼酶解工艺与氨基酸螯合盐的制各及生物效应研究 e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f e a r t h w o r mp r o t e i na n d p r o d u c t i o no f a m i n oa c i dc h e l a t e s a l t a n di t sb i o e f f e c t sc h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t t h eu t i l i z a t i o no fe a r t h w o r mp r o t e i nh a ss w i t c h e dt or e s e a r c ht h e d e v e l o p m e n t o fm u l t i f u n c t i o n a l p r o d u c t s f r o m o r i g i n a l u t i l i z a t i o na s f e e d s t u f f t h ep r e p a r a t i o no fa m i n oa c i dc h e l a t e si sa s y s t e m a t i cp r o c e s sw h i c h r e f e r e dt ot h ep r o d u c t i o no fa m i n oa c i d ，c o m p o s i t i o no fc h e l a t ea n db i o a s s a y o f p r o d u c t i o n c h e l a t e s a l th a v e b e e nw i d e l yu s e di nc h e m i c a la n d a g r o c h e m i c a li n d u s t r y , s u c ha sm i c r o n u t r i e n tf e r t i l i z e r s ，l i q u i df e r t i l i z e r s ， a n i m a lf e e da d d i t i v e sa n ds e e dc o a t i n ga g e n t s t i l i sr e s e a r c hu s e dw o r m p r o t e i na sa m i n oa c i dd o n o r ，w a sc o m p a r e dt h ec h a n g e si nh y d r o l y z i n g d e g r e eo fa u t o l y s i sa n do u t e rp r o t e a s et r e a t m e n t s ，a n da l s ot h er e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ( r s m ) w a s i n t r o d u c e dt o o p t i m i z eh y d r o l y z i n g c o n d i t i o n s ，a i m e da tt h eo p t i m u mc o n d i t i o no fm a k i n gc o p p e rc h e l a t e sa n d z i n cc h e l a t e s w h e a tg e r m i n a t i o nr a t ea n db u ds e n s i t i v i t ye x p e r i m e n tw e r e c o n d u c t e da sb i o a s s a ym e t h o d st ot e s tt h eb i o e f f e c t so ft h r e ek i n d so fi r o ns a l t s ( f e s 0 4 ，e d l a - f e ，a a f e ) a n de v a l u a t e dt a r g e tp o s i t i o na c t i o no fi r o ns a l to n w h e a tb u dr e g i o na n df u n c t i o n m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 i nt h ew h o l ep r o c e s s t h ec o n c e n t r a t i o no fa m i n on i t r o g e ni no u t e r p r o t e a s et r e a t m e n tw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a na u t o l y s i s ，w h i c hh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m3 ht o8 h t h ec o n e e n t r a t i o no fa m i n on i t r o g e ni no u t e r t r e a t m e n tw a ss i g n i f i c a n ti n c r e a s e df r o m1 2 7 t o2 2 w h i l ea u t o l y s i s t r e a t m e n tw a si n c r e a s e df r o m6 6 2 t o16 0 5 b u ti n c r e a s e dr a t i oo f h y d r o l y z i n gd e g r e ed e c r e a s e df r o m9 1 8 t o3 7 1 2 n o n - l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sw a sm a d eb e t w e e nh y d r o l y s i st i m e ( x ) a n d a m i n on i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n ( y ) o u t e rp r o t e a s ea n da u t o l y s i st r e a t m e n t sw a s s i m u l a t e db ye x p o n e n t i a le q u a t i o n s ，y = o 4 3 2 x e x p ( o 1 3 0 x ) ，y = o 2 6 0 x e x p ( o 1 4 3 ) ( ) ， c o r r e l a t i o nc o e m c i e n t sw e r e0 9 3 8 3 * a n d0 9 9 2 8 * * r e s p e c t i v e l y t h ee r r o rt e s t o ff i t t e dv a l u ei n d i c a t e dt h a t ，f i t t e dl e v e lo fa u t o l y s i st r e a t m e n tw a sl o w e rt h a n o u t e rp r o t e a s et r e a t m e n t j 玉er e s u l ta l s os h o w e d 函甜t h ea u t o l y s i so f e a r t h w o r mw a sa nu n s t a b l er e a c t i o np r o c e s s 3 s t o r a g em e t h o d so fm a t e r i a li np r o d u c t i o nw e r ei m p o r t a n tt oh y d r o l y s i s 4 山东农业大学硕士学位论文 p r o c e s s ，a n ds t o r a g et i m ea n dt e m p e r a t u r e ( 4 a n d2 5 c ) h a ds i g n i f i c a n t e f f e c t so nh y d r o l y z i n gd e g r e e n eh y d r o l y z i n gd e g r e eo fw o r mp u l pa t4 c w a sh i g h e rt h a na t2 5 u n d e rs a m es t o r a g et i m e ，w h i c hr e a c h e dv e r y s i g n i f i c a n tl e v e l s o4 cw a sb e n e f i c i a lt oh y d r o l y s i sp r o c e s sa n ds t o r a g et i m e s h o u l dn o te x c e e d4 h 4 t h r e ec o d e st e m p e r a t u r e ( a ) ，p r o t e a s ec o n c e n t r a t i o n ( b ) ，t i m e ( c ) ，a n d t h r e el e v e l sw e r ei n c l u d e di nr s md e s i g n d e s i g ne x p e r t7 1 r e g r e s s i o n a n a l y s i sw a su s e dt oo b t a i nr e g r e s s i o nb e t w e e np r e d i c t e dv a l u eo fh y d r o l y z i n g d e g r e e ( y ) ，a n dc o d ei n d e p e n d e n tv a r i a b l ea ，b ，c ：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 0 9 2 c + 1 2 3 a b 0 7 0 a c o 5 5 b c 十1 5 8 a + o 2 4 b 二一o 5 c 2 a f t e r c o e f ! f i c i e n t t - t e s t ，m o d e l w a sm o d i f i e d i n t o ：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 1 5 8 a 2 ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o nw e r ec a l c u l a t e d ：t e m p e r a t u r e = 5 0 ，c o n c e n t r a t i o n = 5 ， t i m e = 4 4 3 h 5 t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fc o p p e rc h e l a t e ：t e m p e r a t u r e4 0 c ，t i m e3 0 m i n ， m a s sr a t i o2 ：1 ；t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fz i n cc h e l a t e ：t e m p e r a t u r e3 0 c ，t i m e 5 0 m i n m a s sr a t i o2 ：1 6 g e r m i n a t i o nr a t ew a sac o m m o nm e t h o df o rb i o a s s a y , a t1m 一10 0m g l 一 a a f eh a dn om a r k e ds t i m u l a t i o na n di n h i b i t i o ne f f e c to nw h e a tg e r m i n a t i o n r a t e ，b u tt h ei n h i b i t i o nr a t i oo fa a f ea t2 5 0m g l 。1 w a sg r e a t e rt h a nf e s 0 4 a n de d t a f e t y p e so fi r o ns a l th a dd i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c t so nl e n g t ho f w h e a tr o o t ，c o n c e n t r a t i o no v e r r u n e d10 0m g l 一，t h el e n g t ha n db i o m a s sw e r e r e s t r a i n e db yt h r e ei r o ns a l t s ，t h eg r e a t e s ti n h i b i t i o nt r e a t m e n tw a sa a - f e 7 c u r v er e g r e s s i o nm o d e l ，b e t w e e nc o n c e n t r a t i o no fi r o ns a l ta n d g e r m i n a t i o ni n d e x ( g i ) ，w a sa ne f f e c t i v ew a yt oa n a l y z ea n de s t i m a t et h e b i o e f f e c t so fi r o ns a l t t h r e em o d e l sw e r el n y = l n ( 9 9 6 3 7 8 ) 0 0 16 2 7 x y = 9 7 16 4 2 2 8 8 9 l g x + 8 5 8 8 ( 1 9 x ) 上，y = 9 9 4 6 4 0 4 7l g x ，r e s p e c t i v e l y ( w h e r ex i sc o n c e n t r a t i o no fi r o ns a l t ；yi sg e r m i n a t i o ni n d e x ) 8 w h e a ts h o o tw e r ee s p e c i a l l ys e n s i t i v et oa d d i t i o no fo u t e rc h e m i c a l s u b s t a n c ea n dt h ee f f e c tc a nb eo b s e r v e di nl e n g t ha n db i o m a s so fs h o o ta n d r o o t 。r o o t m o r p h o l o g y a n d g r o w t h w a sm o r es e n s i t i v et h a ns h o o t c o n c e n t r a t i o no v e r r u n e d1 0 0m g l ，d i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c to ft h r e ek i n d s o fi r o ns a l to nt h el e n g t ha n dw e i g h to fr o o ta n ds h o o tw e r eo b s e r v e d a n d a a f ew a st h eg r e a t e s t ，i n h i b i t i o nr a t eo nr o o tg r o w t hw e r e ：a a f e f e s 0 4 e ：d t a f e 5 蚯蚓蛋 j 酶解t 艺与氨基酸螯合盐的制备及生物效心研究 9 t h r o u g ha n a l y z e dt h ee f f e c to fi r o ns a l to nw h e a tp h o t o s y n t h e t i cs y s t e m ， t h eb e g i n n i n gi n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o no fa a - f ew a sb e t w e e n5 0 - 1 0 0m g l ， w h i l e f e s 0 4a n de d t a f eb e t w e e n1o o 2 5 0m g l - 1 t h ei n h i b i t i o no f c h l o r o p h y l lw a s ：a a f e f e s 0 4 e d 7 f a f e 10 t h em a l o n a l d e h y d e ( m d a ) c o n c e n t r a t i o nw e r ec h a n g e dw i t ht y p e sa n d c o n c e n t r a t i o no fi r o n s a l t i n f e s 0 4a n de d t a f et r e a t m e n t s ，m d a c o n c e n t r a t i o ni ns h o o ta n dr o o ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e m e n to fc o n c e n t r a t i o n o fi r o ns a l t a n dt h e nd e c r e a s e ds l i g h t l y t h ec h a n g eb o u n do fm d ai ns h o o t w a s 一4 1 3 2 一1 7 2 a n d2 4 3 1 一1 4 8 9 6 i nr o o tm d ac h a n g eb e t w e e n 7 5 一5 7 1 a n d9 0 7 8 - 2 8 5 8 2 r e s p e c t i v e l y i n c r e m e n t o fa a f e c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dm d ai ns h o o ta n dr o o t ，a n dm d ai n c r e a s e db v 2 6 0 4 一10 3 8 2 a n d21 _ 6 5 2 4 8 r e s p e c t i v e l y t h ec h a n g eb o u n do f m d ai nr o o tw a sw i d e rt h a ni ns h o o t 1 1 f o rr e s p o n s ed e g r e e ，i n h i b i t i o nr a t ei n d e xw a sg r e a t e s t ，f o l l o w e db yl i p i d p e r - o x i d a t i o ni n d e x ，a n dc h l o r o p h y l li n d e xl e a s t ；b e s i d e s ，g r o w t hi n d e xw a s h i g h e rs e n s i t i v et h a np h y s i o l o g yi n d e x a c t i o nt a r g e tp o s i t i o no ff e s 0 4 f i x e di ns h o o t s a n da a f ea n de d t a f ef i x e di nr o o t s 耶1 er o o tl i p i d p e r o x i d a t i o nw a sm o r es e n s i t i v et of e s 0 4a n da a f e ，a n ds h o o tw a st o e d t a f e k e y w o r d s ：e a r t h w o r mp r o t e i n ；a u t o l y s i s ；h y d r o l y s i s ；r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ；c h e l a t e ；b i o e f f e c t 6 缩写 a a f e e d t a f e f e s 0 4 m d a c o n r i r s i r t q i r r q i r s q i r c h l a c h l b c h l a b c a r m d a r m d a s a a c u a a z n r s m g i g 4 8 g 1 0 0 h s l d h 英文缩略表 英文 a m i n oa c i dc h e l a t ei r o n e d t ai r o n i r o n ( i i ) s u l f a t e m a l o n d i a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n r o o ti n h i b i t i o nr a t i o s h o o ti n h i b i t i o nr a t i o t o t a lq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o r o o tq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o s h o o tq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o c h l o r o p h y l la c h l o r o p h y l lb c h l o r o p h y l la + b c a r o t e n o i d m a l o n d i a l d e h y d ei nr o o t m a l o n d i a l d e h y d ei ns h o o t a m i n oa c i dc h e l a t ec o p p e r a m i n oa c i dc h e l a t ez i n c r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y g e r m i n a t i o ni n d e x g e r m i n a t i o nr a t ei n4 8h g e r m i n a t i o nr a t ei n10 0h k m n 0 4 一t r e a t e ds e e d s s a n d f i l t e rp a p e r d e g r e eo fh y d r o l y s i s 中文说明 氨基酸螯合铁 乙二胺四乙酸螯合铁 硫酸亚铁 丙二醛 浓度 根伸长抑制率 芽叶伸长抑制率 总质量抑制率 根质量抑制率 芽质量抑制 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总量 类胡萝卜素 根中丙二醛浓度 根中丙二醛浓度 氨基酸螯合铜 氨基酸螯合锌 响应面设计 发芽指数 4 8 小时发芽率 1 0 0 小时发芽率 高锰酸钾处理种子 沙子 滤纸 水解度 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交 论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山 东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所 将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向社 会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 蛋白质水解产物的特殊价值和开发 1 1 1 多( 小) 肽物质的价值 组成蛋白质的氨基酸构成的物质中，有一类不同于蛋白质的中间物 质，这种物质具有特殊的功能，人们称之为肽( p e p t i d e ) ，由两个氨基酸组 成的肽称为二肽，多个氨基酸分子以肽键相连接则称为多肽( 王镜岩， 2 0 0 2 ；刘玉德，2 0 0 2 ) 这些多肽多以非活性状态存在于蛋白质长链中，当 被酶解成适当的长度时，它们的活性就会表现出来。 无论是植物蛋白还是动物蛋白经水解后都可以得到肽。大豆分离蛋 白经酶解后，易于被人体消化吸收，同时生成的多肽具有很多生物学功能 特性( 肖怀秋，2 0 0 7 ；刘文辉，2 0 0 3 ) 。如干酪蛋白酶解液对人肠杆菌，金 黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌均有很强的抑制作用，证明该酶解液不仅对 阳性菌和阴性菌有较强的抑制作用，而且对球菌和杆菌都有较强的抑制作 用，超滤后的活性测定说明活性物分子量均在3 0 0 0 u 以下( 李海芹，2 0 0 6 ) 。 h e e g u kb y u n 等( 2 0 0 1 年) 从阿拉斯加青鳕皮中提取的胶原蛋白并采用 a l c a l a s e ，p r o n a s ee 和胶原蛋白酶在三步循环的酶膜反应器中依次顺序 水解，发现第二步采用p r o n a s ee 水解完分子量在l1 5 1 5 k d a 肽组成的 产物抗氧化能力最强。 蚯蚓蛋白水解液含有丰富的氨基酸和多种矿质元素，其中游离的氨基 酸以分子状态穿过细胞膜进入植物细胞内，容易被植物吸收。蚯蚓水解液 中含有的多功能多肽具有抗病和促进植物生长作用，是多功能生物农药的 开发依据( 蔡明才，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 蚯蚓蛋白质水解产物的功能 抗菌肽是动物机体具有天然免疫力的重要原因，到目前为止已发现5 大类约5 0 多种。研究最多的是杀菌肽( e i e r o p i n ) ，爪蟾抗菌肽( m a g a i n i n ) 和防卫肽( d e e f n s n i ) ( 付清泉等，2 0 0 2 ) ，其分子量一般在1 0k d a 以下( 王冲， 孙振钧，2 0 0 6 ) 。蚯蚓经过长期的进化逐渐形成了抵抗外来微生物侵袭的机 制，自身也产生一些抗菌成分。蚯蚓体液中分离到了三种分子质量为4 0k u ， 4 2k u 和4 5k u ，具抗菌、溶血和凝血功能的蛋白质命名为f e t i d i n s ，近来发 现的e p l 6 的不同分子大小的小肽结构，其对鹑鸡肠球菌、绿脓杆菌、鲍 7 蚯蚓蛋 j 酶解工艺与氨基酸螯合盐的制各及生物效应研究 氏不动杆菌、土生克雷伯氏菌、粪肠球菌有一定的抑制作用( 张希春，孙 振钧2 0 0 2 ) 。 蚯蚓氨基酸生物制剂对小麦生理代谢和生长的都有促进作用。使用蚯 蚓氨基酸生物制剂，在小麦种子萌发期其过氧化氢酶、酸性磷酸酯酶活性 和三磷酸腺苷酶含量分别比对照提高1 1 9 1 ，1 1 9 和3 7 5 。在小麦幼苗 时期，硝酸还原酶活性和幼苗吸收磷的能力分别比对照提高9 8 6 和 2 8 2 。在小麦发芽期，种子活力指数比对照提高2 8 9 ，小麦三叶期苗 高、根长和干重分别比对照提高1 3 2 ，1 9 2 和2 4 1 ( 刘大永，万兆良 1 9 9 4 ) 1 2 蛋白酶解条件的研究 1 2 1 氨基酸的制备工艺 1 2 1 1 蛋白的预处理 通常作为氨基酸供体的蛋白多为动物蛋白，少量为植物蛋白( 大豆 蛋白) 。但由于蛋白体通常与角质油脂物成为复合体，水解加工前为提高 水解效率常采用一些方法，增加蛋白与酶的接触面积，减少油脂等的负效 应。如有机溶剂脱脂法( 敬承衡，1 9 9 5 ) ，这其中包括索式提取法和浸提 发( 郑仕远，2 0 0 3 ；钱俊青，2 0 0 2 ) ，郑仕远( 2 0 0 7 ) 提出索式提取法优于 浸提法，有机提取剂丙酮为佳。如蚕蛹含油高，也有采用氢氧化钠分离蛋 白和甲壳，指出氢氧化钠溶液浸泡0 0 0 。c 、2 0 m i n ) 脱脂蛹，引起蛋白质、 甲壳素膨胀，且对蛋白层与甲壳层的层间有劈开作用等组织结构的变化 ( 郑仕远，2 0 0 7 ) 1 2 1 2 化学工艺与生物工艺的利弊 蛋白质的水解方式较多，主要有化学降解法和生化降解法即酶法降解 ( 王镜岩，2 0 0 2 ) 。化学方法是利用酸或碱水解蛋白质，虽然方法简单、成 本低廉，可是反应条件剧烈，生成过程中氨基酸受损严重，破坏了氨基酸 的构形，使l 一氨基酸变成d 一氨基酸，而且很难按规定的水解程度控 制水解，故现在很少采用。而酶解能在温和的条件下进行，并且可以在特 定的条件下进行定位水解，分裂产生特定的肽，水解的程度易于控制，因 而能很好的满足生产活性肽的需要。反应产物与相同组成的氨基酸具有特 殊的理化性能和生理功能，己成为蛋白质水解制品的主要发展方向 8 山东农业大学硕上学位论文 ( a d u a m a n k w ab ，19 81 ；s u t h a s i n e en i l s a n g ，2 0 0 5 ；郝晓霞，2 0 0 7 ) 。 利用酸法或碱法进行氨基酸制备的研究不是太多，马建滨( 2 0 0 1 ) 等 利用酸解毛发蛋提取胱氨酸时，指出温度、毛酸比、时间等因素影响到毛 发蛋白的水解率和产品肽氨酸的总收率。乌云( 2 0 0 2 ) 利用6 m 0 1 l 1 盐酸 溶液酸解羊胎盘下脚料，在1 0 5 1 1 0 水解2 4 h 。林瑞余( 2 0 0 2 ) 比较了酸 解和碱解的区别，得到了硫酸水解率高，水解率高达7 9 4 4 ，碱解法得 到水解率5 8 6 ，硫酸浓度为3m 0 1 l 一，可以看出酸解和碱解的特点是水 解率高，能耗也高，同时水解物的分离利用工序复杂，成为利用的瓶颈。 1 2 1 3 水解过程不同酶的运用 工业化生产中水解蛋白关键是选好酶，可供选择的酶众多，其作用 机制对于氨基酸的生产至关重要。蛋白质水解酶根据来源可分为来自植物 组织的蛋白酶( 如木瓜蛋白酶、菠萝蛋自酶、无花果蛋白酶等) ，来自动物 组织的蛋白酶( 如：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等) 和来自微生物的 蛋白酶( 刘文辉，2 0 0 3 ) 。一般来说，来自动、植物的蛋白酶安全性较高，但 是其产量低，价格高，催化活性普遍较低，微生物蛋白酶与动物蛋白酶和 植物蛋白酶相比溶解性好，活力高，对蛋白质作用强烈，非常适合于对蛋 白质进行较深度的水解。根据酶作用靶位功能来分，分为内切蛋白酶，如 a l c a l a s e ( a l c ) 和n o v op r o d ( n p d ) ；肽链端解酶，如风味蛋白酶( f l a ) 和c o r o l a s e ( f o r ) ( c h u l a p o mk a m n e r d p e t c h ，2 0 0 7 ) 目前，三种较为常见的微生物蛋白酶是：地衣芽抱杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 深层发酵产生的碱性蛋白酶，在碱性条件下具有较高的催化 活性；枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 深层发酵产生的中性蛋白酶，在中性条件 下具有较高的催化活性；5 7 9 酸性蛋白酶，一种在酸性环境下催化蛋白质 水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。文献中常出现的有 丹麦诺和诺德( n o v o n o r d i s k ) 公司生产的碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 和中性蛋白 酶( n e u t l a s e ) ，中国无锡星达生物工程有限公司( 原无锡酶制剂厂) 的酸性蛋 白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等( 刘文辉，2 0 0 3 ) ，北京东华强盛生物技 术有限公司( 原房山酶制剂总厂) 的5 7 9 酸性蛋白酶、2 7 0 9 碱性蛋白酶 和1 3 9 8 中性蛋白酶( 王彬彬，聂俊华2 0 0 9 ) 。 目前酶解处理在蛋白酶品种上的选择，还出现了多酶联合作用的研 9 蚯蚓蚯白酶解t 艺与氨基酸螯合盐的制备及生物效心研究 究，提出由于酶的专一性，采用单酶水解时它只能从几个固定的氨基酸残 基进水解，因此水解率并不会特别高，而采用双酶水解则可以提高它的水 解速度。原因为蛋白质先经酶解后，所生成的肽片断已大大减小，消弱了 侧链集团对肽的屏蔽保护作用，减小了它们之间的空间阻挡效应，再用另 一种酶进行水解就能使得水解较为彻底( 王文亮，2 0 0 6 ) 。c h u l a p o m k a m n e r d p e t c h ( 2 0 0 7 ) 等利用两种蛋白内切酶( a l c 、n p d ) 和肽键外 切酶( f l a 、c o r ) 进行的单因素和两因数对马铃薯蛋白的水解率的比较， 发现由于蛋白的某些特性，酶的作用程度是有很大区别的，a l c 和f l a 适合马铃薯蛋白的酶解，n p d 和c o r 处理的水解率就很低，最高水解率 4 4 来自2 a l c + 5 f l a ( w w ) 。王文亮( 2 0 0 6 ) 利用的胰蛋白酶和木 瓜蛋白酶的双酶酶解研究，研究发现不同浓度的酶配比均对水解率有不同 程度的提高。 s t e i ni v a ra s p m o ( 2 0 0 5 ) 采用鱼内脏胞外蛋白酶配以七种商业蛋白酶 每一种进行单独组合溶解蛋白效能的研究，发现鱼内脏胞外蛋白酶的溶解 产率达到7 5 ，虽然其他处理最高到9 5 ，提出加入外源酶是否是经济 的考虑。 1 2 2 水解条件的优化研究进展 1 2 2 1 影响水解率的各因素条件优化 影响水解过程的主因素条件包括酶浓度、酶解时间、酶解温度、底物 浓度( 王镜岩，2 0 0 2 ；肖怀秋，2 0 0 7 ) ，还与反应体系的离子强度、产物 类型和其它组分等构成因子有关( 刘文辉，2 0 0 3 ) 。m c m a 7 r q u e z ( 1 9 9 9 ) 等人提出了酶解因素( 底物浓度、酶浓度、温度、反应时间) 与水解度的 酶动力模型，这为简化酶解试验设计提供了参考，但运用的不是很广泛。 肖怀秋等采用a s l 3 9 8 中性蛋白酶作为水解大豆分离蛋白的酶源， 通过对酶解效果和影响因素的研究，确定最佳水解工艺条件，正交试验表 明，以温度对水解率影响最为显著，优化方案为：5 底物浓度，5 0 0 0 u g ， 5 5 和水解4 5 h 。孙卫青( 2 0 0 7 ) 探究了不同种的蛋白酶对新鲜羊骨的酶 解，提出中性酶效果理想，发现酶解温度，底物浓度，酶用量对水解率有 重要影响，而作用时间和p h 的影响不显著。木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶酶解鲤鱼在最佳条件下酶解效能分析可知，枯草杆菌蛋白酶 1 0 山东农业人学硕- 上学位论文 酶解效果较好( 殷金莲，2 0 0 7 ) 。 钠、钾、钙、镁、锌离子等均对胰蛋白酶酶解黄粉虫蛋