（水产养殖专业论文）环境胁迫对单巢类轮虫不同类别基因差异表达的影响.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名： 日期： 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 摘要 为了从基因表达水平上探讨单巢类轮虫有性生殖发生的分子机理，本研究以 萼花臂尾轮虫为材料，通过温度刺激，分别获取非混交雌体、混交雌体和雄体， 进而币0 用m r n a 荧光差异显示的方法对三种类另进行了研究，取得了下列几个 主要结果和结论： ( 1 ) 用急剧冷休克4 小时的方法，得到的轮虫后代中的混交雌体百分含量 最高。 ( 2 ) 用惭乃0 i 试剂盒提取了萼花臂尾轮虫非混交雌体、混交雌体和雄体的 r n a ，纯度较高。且发现提取雌体的r n a 至少需要雌体3 0 0 只。 ( 3 ) 进行了2 0 个荧光差异显示反应，获得了3 4 个差异片段。进行p c r 二次扩增得到稳定的差异条带1 8 条。约有1 2 的差异条带回收后， 再次扩增时未能扩出条带，可能是假阳性条带。说明萼花臂尾轮虫不 同类别之间在m r n a 水平上确实存在着本质的差别。 ( 4 ) 对差异片段进行克隆测序，获得了1 6 个d n a 片段的序列数据。序 列的编号分别为h 7 1 、h 7 0 2 、f 7 1 、f 7 2 、f 7 - 3 、f 7 - 4 、f 7 6 、 h 8 1 、h 8 _ 4 、h 8 6 、x 9 - 1 、x 9 - 2 、h 1 0 1 、h 1 0 3 、x 1 1 - 1 、 f 1 3 - 1 。n c b ib l a s t 数据库中进行同源性分析结果显示h 7 1 与萼花 臂尾轮虫的内转录间隔区1 、2 的部分序列、5 8 s r r n a 基因、1 8 s r r n a 基因有很高的同源性。而其他的片段没有找到与之匹配的已报道的基 因，推断可能是新基因。 关键词：萼花臂尾轮虫；非混交雌体；混交雌体；雄体；荧光差异显示 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fs e x u a lr e p r o d u c t i o no ft h e m o n o g o n o n t ai ng e n ee x p r e s s i o n ，w eo b t a i n e da m i c t i cf e m a l e ，m i c t i cf e m a l ea n d m a l eb yt e m p e r a t u r es t i m u l a t i n g ，a n dt h e ns t u d i e dt h e i rd i f f e r e n c e si ng e n ee x p r e s s i o n b yf l u o r e s c e n td i f f e r e n t i a ld i s p l a y - p c r t h ef o l l o w i n gr e s u l t sw e r eo b t a i n e d ： ( 1 ) t h ep e r c e n t a g eo fm i e t i cf e m a l ei nt h eo f f s p r i n gi st h eh i g h e s ti nc u l t u r et h a t u n d e r w e n ts u d d e nc o l ds h o c k ( s s ) t r e a t m e n tf o r4 h ( 2 ) w ee x t r a c t e dt h er n af r o ma m i c f i cf e m a l e , m i c t i cf e m a l ea n dm a l eo f b r a c h i o n u s c a l y e i f l o r u sw i t ht r i z o lk i ti na d d i t i o n , w ef o u n dt h a ta tl e a s t3 0 0f e m a l e sw e r e n e e d e di nt h er n ae x t r a e f i o n ， ( 3 ) 1 _ 1 1 i r 移- f o u rd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n af r a g m e n t sw e r eo b t a i n e df r o mt w e n t y d d o p c rr e a c t i o n s e i g h t e e nd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n af r a g m e n t sw e r e a m p l i f i e di nr e a m p l i f i e a t i o nr e a c t i o n s a b o u t1 2o ft h et l l i r 哆一f o u rd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e de d n af r a g m e n t sc o u l dn o tb er e a m p l i f i e d , w h i c hm i g h tb e f a l s e p o s i t i v e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r er e m a r k a b l e d i f f e r e n c e si ng e n e e x p r e s s i o na m o n ga m i e t i ef e m a l e ，m i c t i cf e m a l ea n d m a l e ( 4 ) w ec l o n e da n ds e q u e n c e dt h e s i x t e e nd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dd n af r a g m e n t s t h e s es e q u e n c e sw e r eh 7 - 1 、1 - 1 7 - 2 、f 7 - 1 、f 7 - 2 、f 7 - 3 、f 7 4 、f 7 6 ， h 8 1 、h 8 - 4 、h 8 6 、x 9 - 1 、x 9 - 2 、h 1 0 1 、h 1 0 3 、x 1 1 1a n df 1 3 - 1 t h e a l i g n m e n to f t h e s es e q u e n c e st h r o u g hn c b i b l a s td a t a b a s er e v e a l e dt h a t1 - 1 7 - 1 h a dh i g hh o m o l o g yw i t hb r a c h d n u sc a l y c i f l o r u si n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r1 ， i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r2 5 8 sr i b o s o m a lr n ag e n ea n d1 8 sr r n ag e n e b u t t h eo t h e r sd i dn o tm a t c ha n y r e p o r t e dg e n e sa n dm a y b es o m el l n k n o w l lg e n e s k e yw o r d s ：b r a c h i o n u sc a l y c i f l o r u s ；a m i c t i cf e m a l e ；m i c t i ef e m a l e ；m a l e ；f l u o r e s c e n t d i f f e r e n t i a ld i s p l a yf f d d ) 2 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 第一章前言 1 1 轮虫的主要特征和分类地位 轮虫( r o t i f e r a 或r o t a t o r i a ) 是最小的多细胞动物，与原生动物大小相似，一 般种类为1 0 0 扯r a - 5 0 0 m n ，最小的只有4 0 9 i n 左右，最大的可达4 m m 吐轮虫的重 要特征有三个：l 、有纤毛的头冠( c o r o i l a ) ；2 、特化的咀嚼囊( m a s t a x ) 并有角质化 的咀嚼器( t r o p h i ) 3 、有一对原肾管分列在两旁，原肾管之末端为焰细胞【2 1 。由 于轮虫形态特殊，使它在动物界的位置及其与其他无脊椎动物的关系一直存在争 议。过去轮虫般隶属于线形动物i - j ( n e m a t h e l m i n t h e s ) 的一个纲。此外还有学 者将轮虫、线虫动物和其他假体腔动物一起划归如袋型动物f - j ( a s c h e l m i n t h e s ) 。 k u m a z a k j 【3 】等对褶皱臂尾轮虫和两种线虫的5 sr r n a 基因进行序列分析后发现， 褶皱臂尾轮虫与线虫r r n a 序列相似性为7 8 8 0 ，甚至少于褶皱臂尾轮虫与腕 足动物l i n g u l a 之间r r n a 序列的相似性8 9 ，因此建议把轮虫独立提升为- - i 更为合适。另一个研究得很多的是棘头动物与轮虫在分类地位上的关系；一些学 者研究了棘头动物与轮虫三个大类：尾盘总目( s e i s o n i d e a ) 、单巢总目 ( m o n o g o n o n t a ) 和蛭态总目( b d e l l o i d e ) 之间核编码基因h s p 8 2 序列相似性，得到的 结果表明棘头动物的亲缘关系与轮虫非常接近，所以应归属于轮虫动物门，作为 其下属的一个纲【4 】。 1 2 轮虫的生活史 双巢类轮虫的雄体( m a l e ) 从未发现过，因此双巢类轮虫终身营无性生殖，而 单巢类轮虫的生活史具有典型的世代交替过程。通常情况下，轮虫通过孤雌生殖 ( p a r t h e n g e n e s i s ) 的方式繁衍种群，在孤雌生殖期间，母体产生的卵排出后通过粘 附在母体身体后端两侧、下沉到水底或浮在水中等方式，不需受精而直接萌发形 成子代幼体，该母体为非混交雌体( a m i e t i ef e m a l e ) ，其产生的卵叫非需精卵 ( a m i e t i ee g 曲，非需精卵个体较大，卵壳较薄而光滑，卵的染色体为双倍体。当 外界环境恶劣不适应轮虫生存时( 如温度骤然升降；种群密度过高；p h 、d o 剧 变；食物的种类改变和数量补充受到限制等) ，种群开始出现混交雌体( m i c t i e f e m a l e ) ，混交雌体所产生的卵，于成熟之前都要经过减数分裂，卵的染色体为单 倍体。只有混交雌体的卵才能受精，因此被称为需精卵( m i c t i ee g g ) ，需精卵一经 3 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 受精，即分泌一层比较厚的卵壳，以抵抗外界不良环境。通常所称的休眠卵( r e s t i n g e g g ) 就是指受精之卵。如果需精卵不经过受精，它就马上发育而孵化出雄体。换 句话说，休眠卵在受精以前有发育为雄体的可能，因为受了精，就进入了休眠阶 段。休眠卵能够抵御外界高度的干燥、低温和高温以及其它化学因子的剧烈变化， 经过不同阶段的滞育，等到外界环境恢复到适合状态时，休眠卵即孵化出非混交 雌体，进入新轮孤雌生殖阶段，这样就完成一个完整的世代交替过程。单巢类 轮虫的生活史可参见图1 1 。 需精卵如不受精，郎成为孵出雄体之卵。每一个混交雌体可能同时或陆续产 生休眠卵和孵出雄体之卵，但绝对不会产生像非混交雌体那样所产的非需精卵， 非混交雌体也只能产生非需精卵，绝对不会产生需精卵。如果雄体与非混交雌体 交配，也绝对不会起受精作用。因此，非混交雌体和混交雌体在体型上虽然看不 出有什么区别，但在生理上却截然不同，彼此不会混淆。 单巢类雄体的大小只有雌体的1 8 至1 3 ，生殖系统和运动器官高度发达， 其它结构尤其是消化系统极度退化，游泳速度极快，出生后不摄食任何食物，通 过混交雌体的体壁把精子输送到雌体体腔，完成交配的雄轮虫几小时后即死亡。 单巢类轮虫的两种雌体外形虽完全相同，但他们所产的卵是很容易区别的。 非混交雌体只产一种非需精卵，卵个体较大、卵壳较薄且很光滑。混交雌体所产 的需精卵有两种：一种是受精的休眠卵，大小虽然和非需精卵差不多，但卵壳很 厚，不透明，外表颜色通常呈暗褐色，壳上常有壳纹或长短不一的壳刺、或其他 装备；另一种是没有受精而发育为雄体的需精卵，卵形很小，几乎只有非需精卵 或休眠卵的一半，卵壳较薄而且光滑。所有单巢类雌体所产的卵，一般就有如上 所述的三种【5 】。 由此可见，虽然混交雌体和非混交雌体外部形态没有明显差别，但内部生理 机制明显不同，可以根据它们携带卵的类型和后代个体来区分。 另外，由于受外界环境的影响及不同轮虫的种间差异，不同轮虫有性生殖出 现的时间和季节也各不相同，例如：喜暖性轮虫常在秋末冬初开始出现雄体和混 交雌体，与之相反，嗜寒性种类常在春末夏初出现有性生殖。同样，在一年中世 代交替发生的次数亦因种而异，有的种类一年只有一个周期，而有的轮虫可以出 现多个周期，如间歇性水体中的轮虫常常因环境条件的频繁改变而出现多个世代 4 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 交替嘲。 1 3 轮虫的生态分布及在生物学研究中的意义 大多数浮游性轮虫是世界性种类，在地球各区域内都可以见到，具有高度的 适应性。水温、溶解氧和氢离子浓度 h ) 是影响轮虫分布的主要生态因子“。 根据在不同温度下出现的种类，轮虫可分为冷水性种类，广温性种类和暖水性种 类。广温性性种类在大部分水体中占优势。 根据p h 的不同，轮虫亦可以分为碱水性，兼性种类和酸水性种类。一般的 规律是在酸性水体中，种类多，数量少，而在碱性水体中则数量多，种类少。随 着水体富营养化程度的增加，水体p h 值上升导致轮虫种类减少而数量增多，因 此轮虫还可指示水质的营养状况。 综上所述，由于轮虫身体结构的简单性( 体细胞总数在1 0 0 0 个左右) 和生活 史的特殊性( 无性生殖和有性生殖分别或同时存在) ，轮虫逐渐成为分子生物学、 发育生物学和生态毒理学的重要研究对象。 1 4 国内外轮虫研究现状 1 4 i 轮虫生态学研究现状 轮虫生态学的研究主要集中在以下几个方面； ( 1 ) 外界环境因子对轮虫生长的影响( 特别是对诱导轮虫有性生殖的影响) 外界环境因子主要包括：非生物因子( 如温度、光照、p h 等) 、生物因子( 如 食物) 以及种群的自我调节。在温度因子方面，最先r u t t n e r - k o l i s k o ( 1 9 6 4 ) 曾经傲 过这方面的实验：第一组，把携带卵的红臂尾轮虫从正常温度移入预先冷至6 c 的培养介质中，在低温条件下经历2 小时，该组作为急剧降温刺激组( s u d d e n c o l d s t i m u l i s ，s s ) 、第二组，把轮虫培养介质在i 小时内从常温降至6 c ，并在该条 件下维持1 小时，记作逐渐降温刺激组( g r a d u a lc o o ls t i m u l i s ，g s ) 。第三组，控 制在2 3 c ( c o n t r 0 1 ) 。前两组经历2 小时后均移到2 3 。c 下和第三组一起进行培养。 比较它们后代个体1 ) 的混交雌体占所有后代个体总数的比例。结果 5 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 图1 - 1 单巢类轮虫生活史模式图( 仿n o g r a d y1 9 9 3 ) 6 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 发现：第一组比例最高，第二组次之，第三组最低。统计结果表明：s s 与g s 和c 之间存在明显差异，后两者之间没有差异。他认为该现象是温度剧变所致。 g i l b e r t 1 2 以纤细裸藻喂养萼花臂尾轮虫，经急剧降温处理后能使混交雌体百分率 提高，他认为轮虫的雌体类别是在胚胎发育的早期开始分化的，温度急剧下降时， 能使轮虫的胚胎发育发生改变，诱导混交雌体出现。杨家新【1 3 】用不同温度处理萼 花臂尾轮虫后，母体所产生的后代个体中混交雌体的百分率在恒温组中为1 6 8 7 ， 逐渐冷休克组为2 0 9 6 ，急剧冷休克组为3 2 ，8 5 ，因而认为随着冷休克程度的加深， 后代混交雌体的百分比呈增加趋势。 ( 2 ) 对轮虫休眠卵的研究。 各国学者对休眠卵的形态、营养方面做了一定研究，但更多的是对休眠卵产 生的原因和萌发条件做了大量的探究。p o u r r i o t & s n e l l h 7 认为有四个决定性的因 素影响休眠卵的产生：混交雌体的产生、雄体的活力和生产力、雌体对受精的易 受性以及己受精雌体的产卵率。休眠卵的孵化受温度、盐度以及受精前混交雌体 和雄体的营养状况等因素的影响，另外，休眠卵还具有一些生物学特性( 如卵壳 可以抵抗掠食者消化酶的作用、休眠卵可以通过冬眠逃避不良环境等) 增强了轮 虫对环境的适应。此外，休眠卵的形状还可以用来鉴别不同的种类。杨家新等 认为温度骤变可以诱导休眠卵萌发，光照条件对休眠卵萌发率的影响存在种间差 异，母体轮虫的食物和休眠卵贮存条件影响其萌发率。 ( 3 ) 轮虫的分类( 包括不同类别间的分类) 。 主要通过轮虫形态学的研究与观察，对轮虫进行分类。对于同种轮虫不同类 别间的划分在研究中也存在争议，争议在于有的学者提议把轮虫的雌体再做进一 步的划分，s u d z u l d l l 6 1 根据轮虫的系统发育过程提出：轮虫的雌体类型可分为5 6 种，即7 旱不产卵的雌体( n e ) 、早早产非需精卵的雌体( a m i c t i ce ) 、早6 产雄卵 雌体o 订a l ce ) 、pc 产伪性卵& s e d o s e u a le g g ，p e ) 、b 早双性雌体( a m p h o t e f i c ) 该 雌体既可产混交雌体又可产非混交雌体，b 早双性雌体已被许多学者所证实【8 ，1 7 1 ， 最后一种雌体为只产休眠卵的雌体( d 早) 。 1 4 2 轮虫分子生物学研究进展 最早有关轮虫分子生物学方面的研究始于1 9 7 7 年，i s h i k a e a l 9 1 研究了褶皱臂 尾轮虫和萼花臂尾轮虫核糖体r n a ( r i b o s o m a lr n a ，r r n a ) 的热稳定性。 7 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 g o m e z 2 0 - 2 h 和k i n g 建立了一套轮虫有关酶的测试方法，用以鉴别轮虫品系 间的区别。g o m e z 和k i n g 2 a l 还利用同功酶分析的方法研究了轮虫基因的变异及 有性生殖出现的时机。k i n g 在研究蛭态类轮虫时发现其在电泳过程中，同一种 轮虫不同的发育阶段在同功酶类型上没有任何变化，尽管这可以支持基因组一致 的假设，但不能证明此假设。k i n g 的实验还表明，突变造成的变异比重组造成 的变异更重要。轮虫受同类群当时影响比较大，种群的耐受力对变异的产生有相 反的作用。 k i n g 在研究不同地区的褶皱臂尾轮虫( b r a c h i o n u s p l i c a t i l i s ) 线粒体d n a 限制 性内切酶图谱时，每个样本轮虫的用量为2 3 9 ，为获得足量的实验用d n a ，需 要人工培养轮虫，不仅耗费大量人力和时问，而且迄今为止许多轮虫种类的培养 方法还没有确定，限制了轮虫分子生物学研究的发展。p c r 技术的出现，使实 验对模板d n a 的需求量大大降低，推动了轮虫分子水平的研究。g o m e z 等 2 3 2 4 采用c h e l e x l 0 0 树脂提取单个轮虫的d n a ，扩增了褶皱臂尾轮虫线粒体部分片 段，并利用部分微卫星序列对轮虫种群和休眠卵库遗传结构变化进行了分析。 c h r i s t i n el e n t b e c h e i d 2 s l 曾用三种轮虫的单只个体的基因组d n a 进行r a p d 分析， 他描述了几种轮虫的p c r 应用，他们的程序需要至少5 0 个样本，这种r a p d p c r 技术运用，使基因组d n a 的需要量大大减少，也无须对基因序列有预先的了解， 分析也比较快速。董云伟等嘲利用w i z a r d t m 基因组d n a 纯化试剂盒提取了单只 轮虫的d n a ，并以提取的d n a 为摸板，利用c oi 通用引物，扩增并测定了萼 花臂尾轮虫( b r a c h i o n u sc a l y c i f l o r u s ) c oi 部分基因的序列。与褶皱臂尾轮虫c oi 基因序列比较表明，此片段确为轮虫c oi 基因片段，从而证明使用其方法所提 取的单只轮虫痕量d n a 的可靠性。b r i a nj o s e p hd m 留吡姗【2 刀用t r i z o l 试莉盒，取 1 0 0 m g 净重的褶皱臂尾轮虫提取r n a ，并利用其提取的r n a 建立了e d n a 文库。 h e l e ni cb e r r i e m a n ，g i l b e r t ，s e r g ic a m p i l l o ，c w m i 锄b k k yj r 等1 蕊- 3 5 】用现 代分子生物学技术，进行了一些系统发生与进化的研究，而且逐渐把对进化的研 究转向对进化的机理的研究，研究的内容主要体现在：蛋白质进化、核酸进化和 遗传体系进化。比如r u m e n g a n 研究了轮虫染色体进化，w e l c h 从蛭态类轮虫和 单巢类轮虫的热休克基因方面研究了轮虫的进化【”d 9 ) q 。 哈佛大学对蛭态类轮虫的基因组进行了研究，主要是研究了非减数分裂下的 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 基因序列的长期演化，并研究了蛭态类轮虫能保持无性生殖，没有基因改变的生 理机制。 可以说，轮虫的分子生物学研究相对于其生态学研究起步较晚，研究的深度 和广度都有待加强。因此，进行研究时不妨参考其他水生动物( 如枝角类) 的研究 成果。r a c h e la s u 的n 口刀通过提取枝角类d n a ，并核对了h e b e r t 序列，以此区 别了某一种来自两种不同枝角类的基因。陆开宏等【3 8 1 按照优化的r a p d 条件进 行实验，研究了两种裸腹蚤在盐胁迫条件的种群遗传多样性，发现同种裸腹蚤不 同生存盐度之间的种群遗传相似度较高，而种间的遗传相似度较低。 他们的研究主要是集中在轮虫分类学和系统进化上。虽然轮虫分子生物学方 面已有一定的研究，但是用分子手段对轮虫混交雌体形成机制方面的研究仍是空 白。 1 5m r n a 差异显示技术 m r n a 荧光差异显示技术( f l u o r e s c e n td i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，f d d ) 是用于研究基 因的差异表达的新方法。该技术是1 9 9 2 年由l i a n g 和d a r d e c 以研究与癌症发生 有关基因为目的，创立的一种鉴定和克隆哺乳动物正常生理状态与异常生理状态 之间差异表达的基因的方法，首次报道后，即已其不可替代的优势被广泛应用于 生物医学领域，在应用过程中不断得到改进。1 9 9 4 年i | o 建立的m r n a 荧光差 异显示技术是对原有技术加以改进而建立的一种快速、安全、可靠、敏感而且能 同时检测大量样本的m r n a 差异显示方法。此技术的基本原理与方法是：所有 m r n a 都有p o l y ( a ) 尾，在p o l y ( a ) 前面的第一位的碱基( a 除外) 有3 种可能( g ， c 或1 ) ，第二位的碱基有4 种可能( g ，c ，t 或a ) ，这2 个碱基共有1 2 种组合。 与此对应，可合成1 2 种引物，即在o l i g o ( d t ) 后面接上2 个碱基，通常表示为 t 1 2 m n ( i v l 、n 表示4 种碱基中的一种，m 不能为t ) ，如t 1 2 c a 引物，将覆盖 1 1 2 的m r n a 群体，用这种引物进行反转录，将获得1 1 2 的e d n a 亚群体。然 后用一个5 端的任意引物( a r b i t r a r yp r i m e r ，a p ) 对这个e d n a 亚群体进行p c r 扩 增。因为5 端的任意引物将随机结合在c d n a 分子上，因此来自不同m r n a 的 扩增产物大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨出来。在p c r 反应时加入放 射性同位素标记，电泳后对光片曝光或其他显示反应，可发现一对细胞群体中有 差异的d n a 片段。这些有差异的片段就是差异表达基因的e d n a ，从胶上切下 9 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 这些片段，再扩增后进行克隆分析，就能从e d n a 库或基因组d n a 库中筛选到 全长e d n a 或基因组克隆。扩增片段也可作为探针用于n o t l l e m 杂交分析【3 9 1 。 目前国内外用m r n a 差异显示方法研究轮虫的文献还没有，但很多研究者 用此方法对其它植物和动物进行了研究。孙杰等以陆地棉开花后9 d 、2 1 d 、2 7 d 三个不同发育时期的棉花纤维为材料，利用m r n a 荧光差异显示技术，筛选到 1 0 9 个差异显示的c d n a 片段。在此基础上，结合两轮反n o r t h e r n 杂交筛选和 n o r t h e r n 杂交分析，获得了多个仅在棉花纤维细胞中特异表达或在纤维中优先表 达基因的e d n a 片段。王振英【4 1 】等利用m r n a 差异显示方法分析经 2 5 0 m m o l l n a c l 处理3 天的黑麦幼苗，1 4 个差异c d n a 片段，包括了8 个诱导 表达片段，2 个增强表达片段和4 个抑制表达片段被检测到。n o r t h e r nb l o t 分析 证实其中3 个e d n a 片段有强烈阳性信号，证明了与盐胁迫有关。徐家萍【4 习等 利用荧光差异显示技术分离了家蚕抗n p v 相关基因s 3 a 。刘红【4 3 】等用荧光差异 显示技术分离了果蝇七氟醚敏感性相关基因。张义兵 4 4 1 等构建了鱼类培养细胞抗 病毒基因差显c d n a 文库。 1 6 实时定量p c r 实时定量p c r ( r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r tp c r ) ，是指 在p c r 指数扩增期间透过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的 量，并据此推断目的基因的初始量1 4 5 1 。 实时定量p c r 的发明归功于两个重要的发现：一是发现d n at a q 酶有5 一3 外切酶活性；二是利用荧光能量传递技术( f l u o r e s c e n c e ：r e s o n a n c ee n e r g yi r a n s f e r ， f e r t ) f 4 6 j 构建了双标记寡核苷酸探针，l i l t a q m a n 探针。随后相继出现了分子信 标( m o l e c u l a rb e a c o n s ) 、s e o r p i o n s 和杂交探针( h y b r i d i z a t i o np r o b e s ) ，虽然这些探针 不依靠d n a t a q 酶有5 一3 外切酶活性，但都利用了f e r t 原理，最后又出现了能 非特异的与双链d n a 结合而发荧光的染料，如s y b rg r e e ni 。在p c r 过程中，这 些荧光信号可以被探测器“即时”捕获，电脑软件可以通过等式r n = i h + r n 计算矗r n ，其中r n + 是表示每点铡量的荧光强度，r n 表示荧光基线强度 4 7 1 。厶 r n 的值表示p c v d 生程中探针降解的量，也即p c r 产物的量。以r n 的值对循环数 作曲线，选择一个荧光阂值，荧光达到荧光阈值的循环数叫做阈值循环数 ( t h r e s h o l dc y c l e ，c t ) ，而c t 值随这起始模板量的增加而线性降低，从而可以通过 1 0 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 c t 值推算起始模板量【4 引。该方法的特异性由引物和探针的特异性所决定，只有在 p c r 过程中探针退火到目标片段才能发出荧光信号。 实时定量p c r 技术与以前的以终点法进行定量的p c r 技术相比具有无与伦 比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效、高通量，而且具有很高的敏感性、 重复性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大 降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。同时，它还可以通过不同的引 物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增 4 9 - 5 0 】。 目前实时定量p c r 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研 究及药物研发等领域【5 “。其中最主要的应用集中在以下几个方面：1 、d n a 或r n a 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝 数的检测，r n a i 基因失活率的检测等。2 、基因表达差异分析。例如比较经过不 同处理样本之间特定基因的表达差异( 如药物处理、物理处理、化学处理等) ，特 定基因在不同时相的表达差异以及e d n a 芯片或差显结果的确证。3 、基因分型。 例如s n p 检测，甲基化检测等。李文海等【5 2 】利用抑制性消减杂交技术( s s i ) 结合 实时定量p c r 技术研究双肌臀猪肌肉组织的差异表达基因，发现了3 个很可能与 猪双肌臀性状有密切关系的基因。 1 7 本实验研究的日的及主要方法 轮虫在淡水生态系统结构组成、能量传递中具有重要意义。其在淡水浮游动 物总生物量中一般占1 5 2 5 ，有的可高达3 0 。轮虫能摄食一些微小而又不能 被鱼类直接利用的细菌和碎屑，而其本身又被鱼类等水生动物摄食。在渔业生产 中，当鱼苗刚从受精卵中孵出时，卵黄囊中营养已差不多被耗尽，此时鱼苗还不 能摄食较大的食物，轮虫由于其个体较小且富含营养而成为鱼类幼苗的良好开口 饵料。利用轮虫作为活饵料投喂鱼类幼苗时，鱼苗成活率高，体质健壮，绝大多 数鱼类幼体在从内源性营养转向外源性营养阶段中，都以轮虫作为开口饵料，有 些鱼类甚至可以终身摄食轮虫。我国特有的四大家鱼“草、青、鲢、鳙”在其幼 苗阶段无法摄食较大的枝角类，轮虫是最好的开口饵料，据分析养鱼池中轮虫的 数量直接影响鱼苗的成活率和健康情况【5 3 1 。许多渔区采用“肥水下塘”的原理就 是基于此，因为肥水能适当增加水体的营养，从而促进轮虫的生长，最终为鱼类 提供丰富的饵料，同时轮虫还能起到净化水体的作用，使水中致病菌减少，鱼类 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 发病率降低。 萼花臂尾轮虫( b r a c h i o n u sc a l y c i f l o r u s ) 是单巢类轮虫的一个常见淡水种，个 体微小，分布广泛，营养丰富，是养殖幼仔鱼理想的开口饵料，在名特水产品的 育苗阶段作为开口生物饵料具有不可替代的重要地位。g u i s a n d e 5 4 j 的测定结果显 示：萼花臂尾轮虫含有丰富的蛋白质，其碳水化合物含量为0 0 2 7 1 tg i n d l ，带一 个卵时的含量为0 0 5 2ngi n d 1 ，带两个卵时为0 1 1 81 tgi n d ，而且萼花臂尾轮虫 含有多种鱼类必须的氨基酸。但有时在水产育苗阶段需要轮虫时，萼花臂尾轮虫 种群出现大量混交雌体和休眠卵，造成轮虫种群突然崩溃，给育苗带来巨大损失； 而在非育苗阶段，人们反而需要混交雌体大量生成，产生轮虫休眠卵，为渔业生 产单位次年的育苗生产提供轮虫种源“休眠卵”。遗憾的是，目前由于对混交雌 体发生机制不甚清楚，轮虫高密度产业化一直难以实现，制约了名特水产品育苗 生产。 混交雌体的发生与环境条件是否有直接的相关性，对轮虫混交雌体和非混交 雌体的生理差异以及混交雌体形成的机制一直没有确切定论。目前部分学者认为 种群密度、温度刺激、饥饿、光照周期的长短和光照强度的变化可诱导非混交雌 体形成混交雌体 5 5 侧。g i l b e r t t 6 0 l ：还认为在单巢纲轮虫体内，具有无性生殖向有性 生殖转化的刺激临界点，只有在特定环境胁迫下，刺激达到临界阈值时，开始出 现混交雌体，进行有性生殖。也有人认为混交雌体形成是物种进化的结果，有性 生殖是轮虫在进化过程中的一种适应。种群繁殖到一定的代数后，无论条件多么 适宜，混交雌体仍然会出现陋1 删。那么，萼花臂尾轮虫性别分化究竟是由单纯的 环境变化引起，还是要通过遗传背景的改变才能发生呢? 非混交雌体和混交雌体 在遗传的物质基础上是否存在差异呢? 目前，国内外还没有这方面的研究报道。原因可能在于萼花臂尾轮虫个体微 小，不同类别的雌体外观上也没有明显差异，仅仅内部生理机制不同，目前只有 根据它们携带卵的类型和后代个体来区分，因此实验材料的获取比较困难。但非 混交雌体、混交雌体遗传物质基础上的差异又是解决萼花臂尾轮虫性别分化的一 个不可回避的问题。 因此本研究试图从单巢类轮虫的世代交替现象切入，通过环境胁迫( 如温度 剧变) 并加以严格的材料挑取，获得非混交雌体、混交雌体和雄体，进而利用 南京师范大学硕士学位论文 磨晟凯 m r n a 荧光差异显示和实时定量p c r 等研究手段，找到单巢类轮虫( 以萼花臂尾 轮虫为材料) 的三种类别的分子水平上的差异，并最终找到影响单巢类轮虫有性 生殖的相关基因。 从基因表达水平上确定单巢类轮虫有性生殖发生的分子机理在国内外尚属 首次。研究结果将有利于揭示混交雌体发生的原因。为轮虫动物特殊生殖进化途 径( 纯无性生殖一无性生殖和有性生殖并存一纯有性生殖) 以及其他具有类似世 代交替现象动物( 如枝角类和部分昆虫) 的生殖进化研究提供分子生物学研究的 范例。另一方面，找到“无性生殖一有性生殖”的触发阈值( t h r e s h o l dv a l u eo f t r i g g i n g ) 也可以为水产渔业实际生产服务。 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 第二章萼花臂尾轮虫的培养与获取 2 1 引言 如前言所述，当无性生殖的非混交雌体在环境胁迫下，其内部的生理机制会 发生变化，这时种群中的混交雌体所占百分率会提高。种群密度、p h 、食物种 类或浓度、温度、光照周期和光照强度、维生素含量、金属离子浓度的变化都可 以对轮虫的混交雌体百分率产生影响 6 3 - 7 9 1 。本实验采取的是温度刺激的方法。 蒜头藻( m o n o d u ss u b t e r r a n e o u s ) 是本实验室从以色列引进的淡水藻种，隶属 于绿藻门的真眼点藻纲，是一种具有高效生产二十碳五爝酸( e v a ) 和二十二碳六 烯酸h 的优质淡水藻株，国外对从蒜头藻中提取e p a 作了大量研究8 3 1 。 由于e p a 、d h a 是蟹类幼体的必需脂肪酸，在体内用于构成磷脂双层膜，同时也 是幼体蜕皮激素的前体物质，对于幼体正常生长、发育、脱壳和存活起重要的促 进作用阱8 6 1 。微藻是水域生态系统初级生产力的主要来源，很多种类能自身合 成e p a 和d h a 等多种p u f a ，通过食物链作用，把微藻中的脂肪酸直接或者经动 物性饵料强化过程传递给养殖对象( 如虾、蟹幼体) ，成为e p a 、d h a 等p u f a 的 有效供给途径8 7 。8 9 】。本实验室曾用经海水驯化的蒜头藻，连续测定并分析e p a 、 d h a 等h u f a 在食物链：蒜头藻一轮虫一潘状幼体中的传递状况以及对涵状幼体 蜕皮时间、存活率、交态率的影响。一方面为河蟹育苗生产提供参考，一方面也 证明了蒜头藻是良好的轮虫强化剂 9 0 - 9 2 1 。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 轮虫的采集与培养 本实验室的萼花臂尾轮虫是在温度2 2 c 左右时用浮游生物网从池塘中捞取 的样品，在解剖镜下挑选一个健壮、携带非混交卵的雌体为实验亲本，在实验室 内进行“克隆”培养，经多代培养所得。将轮虫放入广口瓶中，然后置于l r h - 2 5 0 g 型光照培养箱中，昼夜比为l ：d = 1 2 ；1 2 ，光照强度约4 0 0 0i x ，温度2 2 + 1 ， 定期投喂蒜头藻。培养期间每天更换一次培养液，并检查轮虫产卵的状况。 2 2 1 2 蒜头藻的培养 1 4 南京师范大学硕士学位论文唐最凯 蒜头藻用b g 1 1 培养基培养，与轮虫置于同一光照培养箱中。每天充气3 次，每次l h 左右。 2 2 1 3 主要试剂和仪器 ( 1 ) b g 1 1 培养基： n a n 0 3 1 5g k 2 h p 0 4o 0 4g m g s 0 4 7 h z o 0 0 7 5g c a c l 2 2 h 2 0 0 0 3 6g c i t r i ca c i do 0 0 6gf e r r i ca m m o n i u mc i t r a t e0 0 0 6g e d t a ( d i s o d i u ms a l t l0 0 0 1gn a 2 c 0 3 o 0 2g t r a c em e t a lm i xa 51 , 0m l a g a s ( i f n e e d e d ) 1 0 0g d i s t i l l e dw a t e r1 0l t r a c em e t a lm i x a s ： h 3 8 0 32 8 6gm n c h 4 i - 1 2 0 1 8 1g z n s 0 40 , 2 2 2gn a m 0 0 4 ，2 h 2 0 0 3 9g c u s 0 4 ，5 h 2 00 0 7 9gc o ( n 0 3 h 6 1 - 1 2 0 4 9 4m g 蒸馏水1 0 l 以上所用药品均为上海试剂一厂生产，均为分析纯。 ( 2 ) 离心机 飞鸽牌l x j - i i 型 o ) l r h - 2 5 0 g 型恒温光照培养箱广东省医疗器械厂 ( 4 ) 解剖镜 上海 ( 5 ) 显微镜 o l y m p u sc h 2 0 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 萼花臂尾轮虫雌体的鉴剐和计算 待轮虫带卵后，根据其携带卵的大小、数目、颜色、形态以及卵的胚胎发育 状况鉴别雌体类型( 具体区别方法可见前言) 。混交百分率的计算方法同c l e m e n t 和p o u r r i o t 9 3 1 ； 混交雌体百分率= m f 舱伍电气f ) x1 0 0 m f ：混交雌体a f ：非混交雌体 2 2 2 2 温度刺激实验 从培养的轮虫中挑出日龄少于8 小时的轮虫为实验材料，按照以下方法进行 1 5 南京师范大学硕士学位论文唐晟凯 处理： 取三组容量为2 m l 的培养皿，加入1 0 m l 含蒜头藻的悬液，蒜头藻浓度约为 2 0 1 0 6 c e l l sm l ，第一组预先把轮虫培养液从2 2 。c 降至4 1 ，移入轮虫后， 置于4 1 状态下，分男u 培莠1 小时、2 小时，4 小时、6 小时，作为急剧冷休 克( s u d d e nc o l ds h o c k ，s s ) 处理，第二组移入轮虫后，在1 小时内从2 2 c 逐渐降 至4 。c ，并便之在此状态下分别培养1 小时、2 小时、4 小时、6 小时，作为逐渐 冷休克( g r a d u a lc o l ds h o c k ，o s ) 处理，第三组维持在2 2 1 作为对照组 ( c o n t r a s t , c ) 。经降温处理的s s 、g s 组重新转置于2 2 1 状态并同c 组一起 按照2 2 1 1 中方法进行培养，4 8 h 后观察并对非混交雌体和混交雌体迸行计数。 每组的每种时间段都设置5 个重复。 2 2 2 3 萼花臂尾轮虫不同类别的大规模培养与获取 根据温度刺激实验的结果，选择其中最易得到混交雌体的方式，培养并分别 挑取大量的非混交雌体、混交雌体和雄体，备提取r n a 之用。 2 3 结果与分析 表2 - 1 不同温度处理对非混交雌体