（急诊医学专业论文）盐酸戊乙奎醚治疗百草枯急性肺损伤的实验研究.pdf

山东大学顾i ：学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：壁盗 日期：麴! ! ! ! ! 翌 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 鸯盎导师签名：塑堡日 期：垄丝：兰：! ! 山东火学硕：i ：学位论文 目录 中文摘要5 英文摘要8 符号说明10 论文正文1 1 前言1 1月u 舌11 材料和方法一1 3 结果1 5 讨论l8 结论2 1 附图2 2 参考文献2 4 综 述2 6 参考文献3 5 致谢4 0 攻读硕士学位期间发表的论文目录4 1 c h i n e s e e n g l i s ha b s t r a c t 8 e n g l i s ha b b r e v i a t i o n 1 0 t e x t 11 b a c k g r o u n d 11 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 13 r e s u l t s 1 5 d i s c u s s i o n 18 c o n c l u s i o na n dr e c o m m e n d a t i o n 2 1 f i g u r e 2 2 r e f e r e n c e s 2 4 r e v i e w 2 6 r e f e r e n c e s 3 5 a c k n o w l e d g e m e n t s 4 0 c o n t e n t so fp u b l i s h e da r t i c l e s 4 1 4 山东人学硕：i ：学位论文 盐酸戊乙奎醚治疗百草枯急性肺损伤的实验研究 硕士研究生：宁琼 导师：菅向东 中文摘要 背景百草枯( 1 ，1 一二甲基一4 ，4 一二氯二吡啶，p a r a q u a t ，1 ， 1 一d i m e t h y l 一4 ，4 一b i p y r i d i n i u m ，p q ) 早在1 8 8 2 年就被合成，直到1 9 5 5 年 才发现有除草剂的功能，1 9 6 2 年首次在市场上销售。目前，百草枯是世界除草 剂市场上第二大灭草剂，己在1 0 0 多个国家登记注册使用。百草枯是速效触灭型 除草剂，喷洒后能够很快发挥作用，接触土壤后迅速失活。在土壤中无残留。正 常使用情况下对野生动物和环境无危害。正确的使用对喷洒作业人员的健康无不 良影响。在发达国家和发展中国家，百草枯被广泛的应用在多种作物上使用，促 进了农业生产力的提高。使用这种除草剂可减少耕种作业，有助于防止土壤被侵 蚀，保持土壤湿度，有利于促进无需消耗时间和能量的“免耕农业或“直播农 业 开展。在最近3 0 年成为了全球使用最广泛的除草剂，同时在全球也出现了 较多的急、慢性中毒，特别是在农村地区。大多数病人是误服或自杀口服导致中 毒，少量是通过皮肤和呼吸道吸人导致中毒。p q 中毒是一种严重的中毒性疾病 1 ，2 ，因缺少特效解毒剂和能够在血液或组织中与p q 结合的螯合剂，p q 中毒 的病死率可高达9 0 ，然而发病机制尚不明确，目前尚无特效治疗。几年来国内 一些专家也作了不少有益的探索 3 ，4 ，然而目前尚没有突破性的进展。肺是其 毒性损伤的主要的靶器官之一，很多病人死于严重的肺损伤即“百草枯肺 5 。 它是急性呼吸窘迫综合征( a r d s ) 的一种变异形式。长托宁( 盐酸戊乙奎醚注射 液) ，其化学名称为3 一( 2 一环戊基一2 羟基一2 苯基一乙氧基) 奎宁环烷盐酸盐，是 由成都力思特制药股份有限公司与中国军事医学学院毒物药物研究所联合研制 的世界首创的新型抗胆碱药，1 9 9 9 年获国家药品监督管理局颁发的化学药品一 类新药证书。其主要作用特点是对m 受体作用的选择性。胆碱能受体( c h r ) 分 为毒蕈碱型胆碱能受体( m c h r ) 和烟碱型胆碱能受体( n c h r ) ，m c h r 又分为m 1 、 山东人学颀i ：学位论文 m 2 、m 3 亚型，而n e h r 分为n l 、n 2 两个亚型。胆碱能受体各亚型在体内分布差 异较大，m 1 主要分布在支气管、胃肠平滑肌以及中枢突触后膜，m 2 主要分布在 心脏、中枢和外周的突触前膜，以及膀胱、子宫平滑肌等也有分布，m 3 只分布 于内脏平滑肌。而n l 主要分布于神经节和中枢，n 2 型主要分布于运动终板。目 前临床上常用的抗胆碱能药物主要是阿托品和东莨菪碱，但是二者对m c h r 各亚 型无明显选择性，因此在产生治疗作用的同时常常为产生一些不良反应。长托宁 为新型选择性抗胆碱能药物，选择性作用于m 1 、m 3 和n 1 、n 2 亚型受体，对于 m 2 亚型无明显作用，能够通过血脑屏障进入脑内，作用于中枢神经系统。盐酸 戊乙奎醚注射液( 长托宁) 是一种新型抗胆碱药，抗胆碱作用强而全面，而且对 肺水肿具有较好的治疗作用 6 。近年来有关长托宁的基础研究和临床应用进展 迅速，然而，有关长托宁治疗百草枯急性肺损伤的研究却未见报道，本文就此进 行了深入细致的实验研究，为进一步临床应用提供了理论依据。 目的研究盐酸戊乙奎醚注射液( 长托宁) 对百草枯急性肺损伤的干预作用及其机 制。 方法选取8 0 只健康成年雄性w i s t a r 大鼠随机分为空白对照组( 1 0 只) 、 l o o m g k g 百草枯染毒非治疗组( 1 0 只) 、l o o m g k g 百草枯染毒+ 3 3ug k g 长托 宁( p h ) 治疗组( 3 0 只) 、l o o m g k g 百草枯染毒+ 6 6ug k g 长托宁治疗组( 3 0 只) 。 两个治疗组于给药后的3 6 h 、7 2 h 、7 d 分别处死。苏木精一伊红( h e ) 染色行肺 组织病理学检查。取肺组织检测基质金属蛋白酶一2 ( m m p 一2 ) 的表达、小窝蛋白 一1 ( c a v e o l i n 一1 ) 表达、羟脯氨酸( h y p ) 表达，取血清、支气管肺泡灌洗液( b a l f ) 进行内皮素( e t ) 的检测。 结果病理学检查证实大鼠急性肺损伤模型复制成功。染毒非治疗组大鼠肺组织 中基质金属蛋白酶一2 和羟脯氨酸含量及血清和支气管肺泡灌洗液中内皮素含量 均高于对照组( 尸 0 0 5 ) ；长托宁两个治疗组的上述各指标较染毒非治疗组均下 降( p 0 0 5 ) ：染毒非治疗组大鼠肺组织中小窝蛋白一l 表达明显低于对照组( 尸 0 0 5 ) ；长托宁两个治疗组的小窝蛋白一l 表达均高于染毒非治疗组( p o 0 5 ) 。 6 一 广 7 ， 山东人学硕：i ：学位论文 l a b o r a t o r ys t u d yo fp e n e h y c h d i n eh y d r o c h l o r i d eo n p a r a q u a t - i n d u c e da c u t el u n gi n ju r y a b s t r a c t p o s t g r a d u a t e t u t o r n i n gq i o n g j i a nx i a n g d o n g o b j e c f i v e t or e s e a r c ht h ei n t e r v e n t i o ne f f e c ta n dm e c h a n i s mo fp e n e h y c l i d i n e h y d r o c h l o r i d eo np a r a q u a t i n d u c e da c u t el u n gi n j u r y m e t h o d sa l l8 0h e a l t h ya d u l tm a l ew i s t a rr a t sw e r er a n d o m i z e d l ya s s i g n e di n t o n o r m a lc o n t r o lg r o u p s ( 10r a t s ) 、l o o m g k gp a r a q u a tg r o u p ( 1 0r a t s ) 、lo o m g k g p a r a q u a ta n d3 3 1 x g k gp e n e h y c l i d i n eh y d r o c h l o r i d et r e a t m e n tg r o u p ( 3 0r a t s ) 、 l o o m g k gp a r a q u a ta n d6 6 t g k gp e n e h y c l i d i n eh y d r o c h l o r i d et r e a t m e n tg r o u p ( 3 0 r a t s ) t h et w ot r e a t m e n tg r o u p sw e r ee x c u t e dr e s p e c t i v e l ya t3 6 h 、7 2 ha n d7 d l u n g t i s s u e sw e r eu s e dt oa s s e s sh i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g eb yh es t a i n i n g 功el e v e lo f m m p - 2 、c a v e o l i n - 1a n dh y pw e r ed e t e c t e di nt h el u n gh o m o g e n a t e t h es e r u ma n d b a l fc o n t e n t so fe tw e r em e a s u r e d r e s u l t s p a t h o l o g yi n s p e c t i o nc o n f i r m e dt h a tt h em o d e lo fa c u t er a tp u l m o n a r y i n j u r yh a d b e e nd u p l i c a t e ds u c c e s s f u l l y t h em m p 一2 、h y p 、t h es e r u ma n db a l fe to f p a r a q u a tg r o u pw e r eh i g h e r t h a nt h a to fc o n t r o l g r o u p ( p 0 0 5 ) t h e a b o v e m e n t i o n e di n d e xo ft w ot r e a t m e n tg r o u p sw a sl o w e rt h a nt h a to fp a r a q u a t g r o u p ( p o 0 5 ) t h ec a v e o l i n - 1o fp a r a q u a tg r o u pw a sl o w e rt h a nt h a to fc o n t r o l g r o u p 垆 o 0 5 ) t h ec a v e o l i n 一1o ft w ot r e a t m e n tg r o u p sw a sh i g h e rt h a nt h a to f p a r a q u a tg r o u p ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o nt h ei n t e r v e n t i o ne f f e c ta n dm e c h a n i s mo fp e n e h y c l i d i n eh y d r o c h l o r i d e m a y b ed u et oi n h i b i t a t et h ee x p r e s s i o no fm m p 一2 、h y p ，u p r e g u l a t et h a to fc a v e o l i n 一1 a n dd o w n r e g u l a t et h ec o n t e n to fe t 8 ，- 9 ， m m p 0 2m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n 一2 c 斛 h y p e t b a l f e c m s i r s t g f - b e r k m a p k 心k p k c c p a p t n i 乙q l l p d g f l g i 乙l c a v e o l i n - 1 h y d r o x y p r o l i n e e n d o t h e l i n b r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i d e x t r a c e l l u l a rm a t r i x 基质金属蛋白酶一2 小窝蛋白一l 羟脯氨酸 内皮素 支气管肺泡灌洗液 细胞外基质 s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s e 全身炎症反应综合征 s y n d r o m e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b转化生长因子 e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d 细胞外信号调节激酶 k i n a s e m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂原活化蛋白激酶 c - j u nn - t e m i n a lk i n a s e c j u n 氨基末端激酶 p r o t e i nk i n a s ec 蛋白激酶 c o n t i n o u s p o s i t i v ep r e s s u r e 持续正压通气 v e n t f l a t i o n t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - q肿瘤坏死因子一q i n t e r l e u k i n白细胞介素 p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r 血小板源性生长因子 i n s u l i ng r o w t hf a c t o r 胰岛素样生长因子一1 1 0 山东人学硕i ：学位论文 盐酸戊乙奎醚治疗百草枯急性肺损伤的实验研究 - 上- ! 釜 刖菁 早在1 8 8 2 年百草枯( p q ) 就被合成，直到1 9 5 5 年才发现有除草剂的功能。在最 近3 0 年成为全球使用最广泛的除草剂，同时也出现较多的急慢性中毒，特别在农 村地区。在亚洲、美洲、欧洲，每年都有大量的百草枯中毒致死病例的报道。在 我国，百草枯中毒已经成为内科常见的急危重症，病死率极高，可高达9 0 。百 草枯中毒可引起多脏器损害，肺是百草枯作用的主要靶器官，中、重度中毒如果 能度过急性期，以后则出现不可逆性肺纤维化，另外百草枯对肾、肝、心脏、脑 和消化道均可造成损伤，患者最终多死于多脏器功能衰竭或呼吸衰竭。目前尚缺 乏特效的治疗手段。早期肺损伤和后期肺纤维化亦是其主要死因。百草枯的肺毒 性分为两个不同的阶段。第一阶段，主要是对肺泡上皮细胞的损伤和破坏导致肺 水肿和肺出血。第二阶段，成纤维细胞进入肺泡腔和肺间质并转化为肌成纤维细 胞进而产生胶原。肺纤维化的发生发展是以肺泡炎、间质性肺炎以及肺泡上皮和 胶原的异常聚集为特征的。许多组织都能发生纤维化，说明在纤维化的进程中有 着共同的途径，尽管确切的机制还不明了。目前普遍认为：其病理特点包括肺组 织间质细胞增殖、细胞外基质( e c m ) 增生沉积及肺实质的重构，应激的增强及e c m 代谢失衡在肺纤维化的发生发展中具有重要的作用。长托宁( 盐酸戊乙奎醚注射 液) 是由成都力思特制药股份有限公司与中国军事医学学院毒物药物研究所联合 研制的世界首创的新型抗胆碱药，1 9 9 9 年获国家药品监督管理局颁发的化学药品 一类新药证书。该药不但抗胆碱作用较强，而且作用全面。具有选择性的抗胆碱 药，有对抗外周毒蕈碱症状，因能透过血脑屏障，亦具有抗中枢神经症状。毒性 小，对m 2 受体无明显作用，故不影响心率，肌注后约0 5 6 小时血药浓度达到峰值， 半存期为1 0 3 5 d , 时，2 4 d x 时排出率为给药总量的9 4 1 7 。由于半衰期长，重复 用药间隔较长。近年来该药用于治疗呼吸道有关疾病，如急性鼻炎，成人呼吸窘 迫综合征( a r d s ) 、肺炎、肺水肿和支气管哮喘等，不但可取得较好疗效，而且不 良反应也较少。但其用于治疗百草枯中毒引起的肺损伤的作用机制尚不明了。本 实验通过 及肺组织 肺泡灌洗 用。 1 2 山东人学硕i ：学位论文 材料与方法 1 1 动物及材料成年健康s p f 级w i s t a r 雄性大鼠8 0 只，山东大学实验动物中心 提供，证书号s c x k ( 鲁) 2 0 0 3 0 0 0 4 ，体重2 5 0 - 2 9 0 9 百草枯由江苏先正达南通作物 保护有限公司生产，批号为2 0 0 8 0 4 3 0 0 1 。盐酸戊乙奎醚注射液购自湖北拓朋医 药股份有限公司，批号为0 7 0 1 0 4 。删p 一2 、小窝蛋白一l 、羟脯氨酸、内皮素试剂 盒由上海蓝基生物科技有限公司提供。 1 2 动物处理将上述大鼠随机分为8 组，每组1 0 只。分别为对照组、百草枯( p q ) 染毒非组治疗、p q 染毒+ 3 3ug k g 长托宁治疗3 6 h 组( t 。组) 、p q 染毒+ 6 6l ag k g 长托宁治疗3 6 h 组( t ：组) 、p q 染毒+ 3 3l jg k g 长托宁治疗7 2 h 组( t b 。组) 、p q 染毒 + 6 6ug k g 长托宁治疗7 2 h 组( t 。：组) 、p q 染毒+ 3 3ug k g 长托宁治疗7 d 组( t 。组) 、 p q 染毒+ 6 6i jg k g 长托宁治疗7 d 组( k 组) 。除对照组以外均给予2 0 百草枯原液 稀释至l m l ，灌胃染毒。对照组则给予相应剂量的蒸馏水灌胃。治疗组于半小时 后给予上述相应剂量的长托宁肌肉注射，q 1 2 h ，对照组给予生理盐水肌肉注射。 染毒非治疗组观察动物自然死亡，治疗组分别于染毒后3 6 h 、7 2 h 、7 d 三个时i 刨段 处死动物，对照组于灌胃7 d 后处死动物。观察并记录各组动物表现。 1 2 1 百草枯给药剂量和方法按雄性大鼠l o o m g k g 计算，取2 0 百草枯原液用 生理盐水稀释至l m l 灌胃。 1 2 2 长托宁使用剂量和方法染毒半小时后治疗组大鼠分组分别给予长托宁3 3 | lg k g 、6 6ug k g 肌肉注射，其后为q 1 2 h 等量给药。 1 3 标本采集及检测各组动物均于观察结束后麻醉动物，腹腔注射1 0 水合氯醛 0 4 m l l o o g 麻醉大鼠，仰卧位固定，采用下腔静脉穿刺取血约5 m l 后，将大鼠气管 切开，插管，每次取生理盐水l m l 进行支气管肺泡灌洗，共灌洗2 次，收集灌洗液后 处死动物。血液、b a l f 静置2 0 分钟，离心后取血清、b a l f 上清液，一7 0 冰箱冻 存备用，待检测内皮素含量。各组大鼠开胸均加取肺组织，左肺组织留做病理切 片； 含量 1 4 埋切 1 5 分析 1 4 山东人学颂。i ：学位论文 结果 2 1 动物观察染毒非治疗组大鼠于染毒后出现烦躁，少动，萎靡，呼吸急促等 表现。大鼠染毒第l d ，大鼠肺体积j 下常，局部出现暗红色的轻度充血区域；第2 7 d 肺充血加重，肺体积均变钝圆，体积变大，局部有明显的出血点或淤血。染毒 非治疗组病死率4 0 ，治疗组总体病死率8 3 ，差异有统计学意义( p 以0 5 ) ， 见表1 。 表l各组大鼠病死率比较 注：治疗组与染毒非治疗组病死率比较，| p 口0 5 0 2 2 各组肺组织m m p 一2 含量测定如表2 所示：各组之问肺组织m m p 一2 含量差异有 统计学意义( f = 2 9 7 7 ，胞0 5 ) 。经两两比较，染毒非治疗组大鼠肺组织m m p 2 的表达增强，显著高于对照组，差异有统计学意义( 尸以0 5 ) 。长托宁高低浓度 治疗组的m m p 2 较染毒非治疗组表达下降，较对照组增高( 尸以0 5 ) 。长托宁高 低浓度治疗组之间的差异无统计学意义( 力现0 0 3 。见表2 。 1 5 山东大学硕： ：学位论文 2 大鼠肺组织l v l m p 一2 、小窝蛋i t - 1 、羟脯氨酸以及血清内皮素、b a l f 内皮素含量( i l - s ) 注：与对照组比较，9 现0 5 ：与染毒非治疗组比较，“尸姐0 5 2 3 各组肺组织小窝蛋白含量测定结果如表2 所示：各组之间肺组织小窝蛋白 一1 含量差异有统计学意义( f = 2 9 7 7 ，尸以0 5 ) 。经两两比较，肺组织小窝蛋白 一1 在染毒非治疗组的表达较对照组显著降低，差异有统计学意义( 胞0 5 ) 。 长托宁高低浓度治疗组的小窝蛋白一l 较染毒非治疗组表达增强，较对照组降低 ( 尸m0 5 ) 。长托宁高低浓度治疗组之间的差异无统计学意义( 现。见表2 。 2 4 各组肺组织羟脯氨酸含量测定结果如表2 所示：各组之间肺组织羟脯氨酸含 量差异有统计学意义( f = 3 2 6 0 ，尸以彻。经两两比较，染毒非治疗组的大鼠肺 组织羟脯氨酸表达较强，显著高于对照组，差异有统计学意义( 尸以彻。长托 宁高低浓度治疗组的羟脯氨酸较染毒非治疗组表达下降，较对照组增高，差异有 统计学意义( 尸泡彻。长托宁高低浓度治疗组之间的差异无统计学意义 ( p k 口0 5 ) 。见表2 。 2 5 各组动物血清内皮素含量的变化结果如表2 所示：各组之间血清内皮素含量 1 6 山东人学硕：i ：学位论文 差异有统计学意义( f _ 2 6 1 2 ，r 仫0 5 ) 。经两两比较，染毒非治疗组的大鼠血清 内皮素含量增高，显著高于对照组，差异有显著意义( 尸_ 以0 5 ) 。长托宁高低浓 度治疗组的血清内皮素含量较染毒非治疗组表达下降，较正常组增高，差异有统 计学意义( 胞0 5 ) 。长托宁高低浓度治疗组之间的差异无统计学意义( 抄现彻。 见表2 。 2 6 各组动物b a l f 内皮素含量的变化结果如表2 所示：各组之间b a l f 内皮素含量 差异有统计学意义( f = 4 9 11 ，t 9 ( 0 0 5 ) 。经两两比较，染毒非治疗组的大鼠b a l f 内皮素含量增高，显著高于正常对照组，差异有显著意义( 尸i 以0 5 ) 。长托宁高 低浓度治疗组的b a l f 内皮素含量较染毒非治疗组表达下降，较对照组增高，差异 有统计学意义( 尸以0 5 ) 。长托宁高低浓度治疗组之问差异无统计学意义 ( 尸m0 5 ) 。见表2 。 2 7 病理学改变正常对照组肺泡壁结构完整，肺泡腔内无分泌物，无炎性细胞 浸润，肺泡间隔无增宽，无肺萎陷及血管壁增厚( 图1 ) 。百草枯染毒非治疗组 显示肺组织大量炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、巨噬细胞聚集，充血明显，结构 改变，在肺泡壁和间质中可见纤维化改变( 图2 ) 。在长托宁治疗各组中，其3 6 h ( 图3 、图4 ) 和7 2 h ( 图5 、图6 ) 组肺组织可见炎细胞浸润，局部淤血；7 d 组肺 组织仍可见一些炎性细胞，局部可见轻度纤维化改变，周围可见相对正常肺组织 ( 图7 、8 ) 。详见病理附图。 1 7 山东人学硕：l ：学位论文 讨论 急性肺损伤是由多种原因引起的肺部弥散性损害，以顽固性低氧血症、呼吸 窘迫、肺顺应性下降和弥散性渗出为主要特征。肺脏是百草枯中毒损伤的主要靶 器官。i 型和i i 型肺泡上皮细胞则是百草枯选择性毒性作用的主要靶细胞。百草 枯中毒的病理表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，炎细胞浸润；晚 期则出现肺泡内和肺间质纤维化，即“百草枯肺 。研究表明，对m 胆碱能受体 亚型有选择性的新型莨菪类药物盐酸戊乙奎醚注射液能显著减轻急性肺损伤大 鼠肺部炎症改变，抑制中性粒细胞肺内扣押 7 。 近年来研究表明，基底膜损伤是急性肺损伤过程中的重要事件。基质金属蛋 白酶一2 ( 删p 一2 ) 是基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l - - l o p o r t e i n a s e s ，m m p s ) 家族 中成员，是降解基底膜主要成分型胶原的重要酶系 8 。引发急性肺损伤的各 种因素如环境及内源性毒素，均能触发多种效应细胞、炎症介质和细胞因子参与 反应。近来发现，在急性肺损伤过程中基底膜的断裂与m m p s 有关 9 ，尤其是m m p 一2 被认为与急性肺损伤密切相关 1 0 。删p 一2 是一种广泛分布的明胶酶，正常上皮 细胞和内皮细胞均有表达，可降解基底膜的多种成分，参与基底膜的转换 1 1 。 在肺内参与细胞外基质( e c m ) 降解的酶系为m m p s ，其中m m p 2 又称为胶原酶a ，系 型胶原酶，由各种胶原组织细胞产生，活化后即分解胶原明胶，也分解、v 、 型胶原纤维连接蛋白。e c m 合成和降解平衡失调，e c m 的合成增多而降解减少， 沉积于肺内形成肺纤维化 1 2 ，肺纤维化时m m p 2 的阳性表达增强，染毒非治疗组 的大鼠肺组织m m p 2 的阳性表达较强，显著高于正常对照组，差异有显著意义( 尸 0 0 5 ) 。长托宁高低浓度治疗组的m m p 一2 较染毒非治疗组表达下降，其机制可能 是通过下调m m p 一2 表达，减轻肺水肿、出血和炎性细胞浸润，达到抗肺纤维化作用。 小窝是细胞质膜向内凹陷形成的囊状结构，直径约5 0 1 0 0n m 。过去一直 认为其功能是参与跨膜物质转运。近来的研究显示，小窝还是细胞信号分子富集 区，能整合多种信号通路，是信号转导的枢纽。小窝广泛存在于机体多种细胞 内特别在血管内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞、肪细胞以及骨骼肌细胞中含 量丰富 1 3 。小窝主要由脂类和蛋白质组成。脂类成分主要为胆固醇、鞘磷脂和 鞘糖脂。这些脂质分子特别是胆固醇对于小窝的正常结构和功能的维持非常重 1 8 r 山东大学硕：l ：学位论文 要。其主要的结构蛋白一小窝蛋白对许多信号分子的活性起直接调控作用 1 4 。 小窝蛋白一1 作为小窝膜内的支架蛋白，是内皮细胞中小窝的主要结构和调节成 分，是膜整台蛋白，能引起信号分子变构或共价修饰，对大多数信号分子主要发 挥负调节作用，甚至有人认为它是一种“广谱激酶抑制剂 1 5 - 1 7 3 。小窝蛋白 一1 在染毒组表达明显下调，大大降低了其对多条信号传导通路如转化生长因子 1 3 ( t g f _ 1 3 ) 一s m a d 信号转导途径、细胞外信号调节激酶( e r k ) 丝裂原活化蛋白 激酶( m a p k ) 信号转导途径、c j u n 氨基末端激酶( j n k ) 丝裂原活化蛋白激酶( a p k ) 信号转导途径、蛋白激酶c ( p k c ) 的负性调控作用，进而导致肺泡上皮细胞损伤、 成纤维细胞增殖及表型转化、e c m 重塑，引发肺纤维化发病进程 1 8 。肺组织小 窝蛋白一l 在染毒非治疗组的表达较对照组显著降低，而3 6 h 、7 2 h 、7 d 长托宁治 疗组的小窝蛋白一l 表达增强，进而抑制肺纤维化的进一步发展，达到保护肺组 织的作用。 羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，是胶原蛋白的重要组成部分，约占其含量的 1 0 - - 一1 3 ，是胶原特有的氨基酸，胶原以外的其他蛋白质除弹性蛋白含l 的羟脯 氨酸外均不含有羟脯氨酸。通过测定羟脯氨酸的含量可反映细胞合成和分泌胶原 蛋白的功能，因此组织中羟脯氨酸为胶原纤维所特有，其含量可作为胶原组织代 谢的重要指标，即胶原的沉积可用羟脯氨酸的含量来作为肺纤维化的指标，可以 判断肺纤维化的程度，对肺纤维化的进展有重要意义 1 9 ，2 0 。肺纤维化时羟脯 氨酸含量明显增加，7 天长托宁治疗组的h y p 含量显著低于染毒非治疗组，其机制 可能为通过降低羟脯氨酸含量达到抗肺纤维化的作用。 血浆内皮素是一类由内皮细胞释放的2 l 肽，不仅具有强烈、持久的缩血管和 支气管收缩作用，而且还可成倍提高对平滑肌细胞和成纤维细胞的促有丝分裂作 用，导致平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞d n a 合成，加速细胞增殖，并促进 成纤维细胞合成i 型和m 型胶原分解。内皮素除了促进胶原合成外还抑制其降解 2 1 。内皮素通过与其相应受体结合而起作用，受体广泛分布于心血管系统、支 气管和肺等。肺组织内存在着高水平的内皮素，主要由内皮细胞、平滑肌细胞、 气道表皮细胞分泌，也可由黏膜细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞和成纤维细胞分 泌。内皮素在促炎性反应和促有丝分裂的生物学活性中起到了主要作用。百草枯 中毒后内皮素含量升高与肺脂质过氧化损伤引发的全身低氧血症有关，低氧刺激 能在几分钟内诱导内皮素的m r n a 的翻译与合成；肺脏还是内皮素的重要代谢器 1 9 山东人学硕：i ：学位论文 官，体内约2 3 内皮素经肺脏代谢失活，肺损伤可致内皮素灭活减少。内皮素在 肺纤维化过程中有过度表达，与对照组比较，染毒非治疗组的内皮素生成增加， 灭活减少，因此含量明显增加，有统计学差异。而长托宁治疗组的内皮素含量显 著低于染毒非治疗组。长托宁可能通过降低内皮素水平减轻大鼠的肺缺血缺氧状 态，减轻肺细胞损伤和肺水肿从而改善大鼠的纤维化。目前已有多个博莱霉素致 大鼠肺纤维化和转基因小鼠的实验动物的研究充分证实内皮素参与了肺纤维化 发病。已在博莱霉素致肺纤维化大鼠的研究中发现内皮素免疫反应活性明显增 强。转基因小鼠内皮素的过度表达促进了肺纤维化的进程和肾脏的改变但不出现 肺动脉高压。本实验也证实染毒大鼠血清和支气管肺泡灌洗液中内皮素含量显著 增高。因此，内皮素作为一种具有促炎性反应和促纤维化作用的细胞因子，可以 作为判断疾病活动性的标志之一。 有学者认为新型抗胆碱药长托宁( 盐酸戊乙奎醚注射液) 2 m g 以内的小剂量 能解痉、止痛、抑制腺体分泌、稳定呼吸循环；3 m g 以上的大剂量能抑制应激反 应、解除气道高反应状态、阻断迷走神经过度兴奋以及解除肺血管痉挛、改善肺 微循环、减轻全身性炎症反应综合症( s i r s ) ，防止急性肺损伤，达到保护呼吸 系统的正常功能。长托宁治疗百草枯中毒引起的急性肺损伤国内外尚未见报道， 我们的研究结果表明，长托宁治疗百草枯中毒具有较好的疗效，可明显降低中毒 的病死率，保护肺脏，因此具有较好的治疗作用。 百草枯致大鼠急性肺损伤模型成功建立，各组大鼠给予长托宁相应剂量治疗 后肺损伤程度减轻，肺纤维化得到改善。这提示如果能够在百草枯中毒发病早期 即给予长托宁治疗，干预基质金属蛋白酶一2 和羟脯氨酸的表达，减少内皮素含 量以及增加小窝蛋白一1 的表达，将为百草枯中毒早期治疗提供新的思路。目前 因为尚无百草枯特异性解毒药。