（急诊医学专业论文）依达拉奉对百草枯中毒致大鼠急性肺损伤的保护作用.pdf

一i - 唧 y 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 a l i a r d s d e x e l i s a e d e d h i l e d l i n o s i o d m d a e d m m o d p b s p q r o s s i r s s o d t n f 0 【 啪 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 a c u t el u n gi n j u r y a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e d e x a m e t h a s o n e e n z y m e - l i n k e di m m u n o a d s o r d e n ta s s a y h i g h - d o s ee d a r a v o n e i n t e r l e u k i n i n d u c i b l en i t r i c - o x i d es y n t h a s e i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y m a l o n d i a l d e h y d e m e d i u m d o s ee d a r a v o n e m o d e l p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p a r a q u a t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 中文全称 急性肺损伤 急性呼吸窘迫综合征 地塞米松 酶联免疫吸附测定 依达拉奉 高剂量依达拉奉 白细胞介素 低剂量依达拉奉 诱导型一氧化氮合酶 积分光密度 丙二醛 中剂量依达拉奉 模型 磷酸盐缓冲盐水 百草枯 活性氧簇 s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e 全身炎症反应综合征 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h a w e t d r y 肿瘤坏死因子一仅 湿重干重比 7，舢0舢05 8舢8 ww- 啪y 徐州医学院硕士学位论文 依达拉奉对百草枯中毒致大鼠急性肺损伤的 保护作用 中文摘要 目的采用百草枯( p q ) 中毒大鼠急性肺损伤的模型，研究依达拉奉( e d ) 对 急性p q 中毒所致的大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。 方法雄性s d 大鼠1 4 4 只，随机分为6 组：对照组( c o n 组) 、p q 染毒模型 组( m o d 组) 、p q 染毒+ 低剂量依达拉奉治疗组( e d - l 组) 、p q 染毒+ 中剂量依达 拉奉治疗组( e d m 组) 、p q 染毒+ 高剂量依达拉奉治疗组( e d h 组) 、p q 染毒+ 地 塞米松治疗组( d e x 组) ；6 组再分6h ，2 4h ，4 8h 和7 2h 四个亚组，每组6 只。 c o n 组腹腔内注入生理盐水2 m l ，其余各组腹腔内注入p q 溶液2 5 m g k g ( 用生理盐 水稀释至2 m 1 ) ，注射l h 后，按以下剂量和方法给药：0 ) c o n 组和m o d 组：生理 盐水2 m l e d - l 组：e dl m g k g ；e d - m 组：e d3 m g k g ； e d h 组：e d 5 m g k g ： d e x 组：地塞米松3 m g k g ：各干预药物均用生理盐水稀释至2 m l 后腹腔注射， 每日两次。各时间点亚组分别在染毒后6 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 观察大鼠一般状况变 化，并立即处死大鼠，开胸取右肺中上叶肺组织测定肺组织湿干比( w d ) ，右下 肺行h e 染色观察病理变化，并用免疫组化法测定n f r d 3 表达情况，左肺组织制 作肺组织匀浆检测m d a 浓度和s o d 活性；心腔采血检测血液m d a 浓度和s o d 活性，以及t n f g t 表达情况。 结果1 c o n 组大鼠肺组织结构完整。m o d 组大鼠肺组织中有大量中性粒细 胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，肺泡壁断裂，有些肺泡腔充满粉染均质水肿液， 部分有透明膜形成，严重时出现弥漫性肺出血，肺泡腔塌陷萎缩，甚至结构消失， 随时间的延长肺组织损伤程度加重。而e d m 组、e d h 组和d e x 组肺组织损伤程 度较m o d 组显著减轻。 2 m o d 组、e d l 组、e d m 组、e d h 组、d e x 组( 6 h 、2 4 h 时间点除外) 肺组 2 徐州医学院硕士学位论文 织w d 均较c o n 组显著升高，差异有统计学意义( 氏0 0 5 或p 0 0 1 ) ；但d e x 组及 e d h 组肺组织w d 显著低于m o d 组和e d l 组( 尸 0 0 5 或p 0 0 1 ) 。随着时间点 后移肺组织w d 逐渐升高。 3 m o d 组、e d l 组、e d m 组、e d h 组、d e x 组血清和肺组织m d a 浓度较 c o n 组均明显增加，差异有统计学意义( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) ；但e d m 组( 6 h 亚组 除外) 、e d h 组及d e x 组血清m d a 浓度显著低于m o d 组伊 0 0 5 或p 0 0 1 ) ；与 e d l 组比较，d e x 组( 6 h 亚组除外) 、e d h 组血清m d a 浓度显著降低，差异有 统计学意义( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) 。随着时间延长血清m d a 逐渐升高。 4 与c o n 组比较，m o d 组、e d l 组、e d m 组、e d h 组和d e x 组血清中 s o d 活性下降幅度由大n d , 依次为m o d 组、e d l 组、d e x 组、e d m 组及e d h 组；e d m 组、e d h 组及d e x 组血清s o d 活性高于m o d 组和e d l 组，差异有 统计学意义( p o 0 5 或p 0 0 5 ) 5 与c o n 组比较，m o d 组、e d l 组、e d m 组、e d h 组和d e x 组肺组织s o d 活性呈现先下降后升高的走势，在6 h 和2 4 h 肺组织s o d 活性低于c o n 组，在4 8 h 和7 2 h 各组肺组织s o d 活性均显著高于c o n 组，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) 。 在各个时间点，e d m 组、e d h 组及d e x 组s o d 活性均显著高于m o d 组，e d h 组显著高于e d l 组，差异有统计学意义( p 0 0 5 或p o 0 1 ) 。随着时间延长大鼠 肺组织s o d 活性逐渐升高，各时间点亚组之间比较差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。 6 与c o n 组相比，m o d 组、e d l 组、e d m 组、e d h 组和d e x 组大鼠肺组 织n f r , bp 6 5i o d 值均明显增高，e d m 组、e d h 组及d e x 组又显著高于m o d 组和e d l 组，差异有统计学意义( p o 0 5 或p 0 0 1 ) 。在2 4 h ，m o d 组、e d l 组、 e d m 组、e d h 组和d e x 组肺组织n f r bp 6 5 的i o d 值最高，与6 h 组相比差异 有统计学意义( p 0 0 1 ) 。 结论1 3 m g k g 和5 m g k g 的依达拉奉和地塞米松可以有效改善急性p q 中毒 0 徐州医学院硕士学位论文 大鼠所致的a l i ，其中5 m g k g 效果更显著。 2 腹腔注射依达拉奉对急性p q 中毒大鼠所致的a l i 保护作用的可能机制：( 1 ) 提高机体清除自由基能力和抗脂质过氧化能力；( 2 ) 抑制n f kb 信号转导通路的过 度激活，抑制炎性因子t n f q 过度表达。 关键词依达拉奉；百草枯；急性肺损伤；氧自由基；t n f a ；n f 1 c b 4 徐州医学院硕士学位论文 t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fe d r a v o n eo na c u t el u n gi n ju r y i n d u c e db yp a r a q u a ti nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v et oe s t a b l i s ht h ep a r a q u a t i n d u c e da c t u el u n gi n j u r ym o d e li nr a t sa n d i n v e s t i g a t et h ep r o b a b l em e c h a n i s mo fe d a r a v o n ei nt h ep r o c e s so fp r o t e c t i n ga c u t el u n g i n j u r yi n d u c e db yp a r a q u a tp o i s o n i n g m e t h o d so n eh u n d r e d sa n df o r t y - f o u rm a l es p r a g u e - d a w l e y r a t sw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t os i x g r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ( c o ng r o u p ) ，m o d e lg r o u p ( m o dg r o u p ) ， d e x a m e t h a s o n eg r o u p ( d e xg r o u p ) ，l o wd o s ee d a r a v o n eg r o u p ( e d lg r o u p ) m e d i a m d o s ee d a r a v o n eg r o u p ( e d mg r o u p ) ，h i g hd o s ee d a r a v o n eg r o u p ( e d hg r o u p ) ，t h e r a t si ne a c hg r o u pt h e nw e r ed i v i d e di n t of o u rs u b g r o u p so f6h ，2 4l l ，4 8ha n d7 2h ( n = 6 ) t h er a t s i nt h e p a r a q u a tg r o u p a n dt h et r e a t m e n tg r o u pw e r ea l l i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y 而mp a r a q u a t ( 2 5m g k g ) t oi n d u c el u n gi n j u r y ，t h er a t si nt h ec o n t r o l g r o u pw e r ei n j e c t e di n t r a p e f i t o n e a l l yw i t l lt h es a m ev o l u m eo f n o r m a ls a l i n e 2 m l s a l i n ew a si n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y i n t or a t so fc o n t r o l g r o u p ，嬲t ot h e o t h e r g r o u p s ，p a r a q u a t2 5 m g k g ( d i l u t e dw i t hs a l i n et o2 m 1 ) w a si n j e c t e di n t r a - p e r i t o n e a l l y a n h o u rl a t e r , i n j e c t e dw i t ht h ef o l l o w i n gd o s e ：c o ng r o u pa n dm o dg r o u p s ：n o r m a l s a l i n e2 m l ；d e xg r o u p ：d e x a m e t h a s o n e3 m g k g ；e d - lo r o u p ：e d a r a v o n elm g k g ； e d - mg r o u p ：e d a r a v o n e3 m g k g ；e d - hg r o u p ：e d r a v o n e5 m g k g ；e v e r yt r e a t m e n t g r o u pw a sd i l u t e dw i t hs a l i n et o2 m la n dt h e ni n j e c t e di n t r a p e r i t o n e a l l y , t w i c ead a yu n t i l t h em t sw e r ep u tt od e a t h 6h o u s ，2 4h o u r s ，4 8h o u r sa n d7 2h o u r sa f t e rt h e a d m i n i s t r a t i o n ，o b s e r v et h ec h a n g e so fr a t s b e h a v i o r s ；t h e nk i l l e dt h er a t sa n dm e a s u r e d t h er a t i oo f w e t d r yi nt h er i g h tu p p e rl u n g ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs e r u mm d aa n ds o d u s i n gt h el e f tl u n g ，c l l e c tb l o o d sf r o mt h eh e a na n dt h e nt e s t e dt h ee x p r e s s i o no f m d a ，s o da n dt n f 仅，o b s e r v e dt h ep a t h o l o g yo fl u n gt i s s u eb yh es t a i n i n ga n dt e s t e d t h ee x p r e s s i o no fn f r d 3b yt h em e t h o do f i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y r e s u l t s1 t h el u n gt i s s u ei ss t r u c t u r a l l yc o m p l e t ei nc o ng r o u p i nm o dg r o u p ， i n f l a m m a t o r yc e l l sw e r ei n f i l t r a t e ds u c ha sn u m e r o u sn e u t r o p h i l sa n dm a c r o p h a g ei n l u n gt i s s u e ，a n dp a r to f t h ea l v e o l a rw a l l sr u p t u r e d ，a n dp a r to ft h ea l v e o l a rs p a c ew e r e f i l l e d 、 r i t hp i n kd y eh o m o g e n e o u se d e m af l u i d ，p a r to fh y a l i n em e m b r a n ef o r m a t e d ， 5 徐州医学院硕士学位论文 p u l m o n a r yd i f f u s eh e m o r r h a g ea p p e a r e dw h e ni ti ss e r i o u s ，t h ea l v e o l a ra t r o p h i e da n d c o l l a p s e de v e ns t r u c t u r ed i s a p p e a r e d ，a n dg r a d u a l l ya g g r a v a t e do v e rt h et i m e ；t h el u n g t i s s u ei n j u r ys i g n i f i c a n t l yr e d u c e di ne d mg r o u p ，e d hg r o u pa n dd e xg r o u p c o m p a r e dt om o dg r o u p 2c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ew do fl u n go fr a t si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi n m o dg r o u p ，e d - lg r o u pa n de d - mg r o u p ，e d hg r o u p ，d e xg r o u p ( e x c e p t6 ha n d2 4 h ) ， t h ed i f f e r e n c e sw e r es i g n i f i c a n t ( p 0 0 1o rp 2 4 s u b g r o u p 6 hs u b g r o u p ) ，a n dt h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e ne v e r ys u b g r o u pe x c e p tt h e4 8 hs u b g r o u pa n d7 2 hs u b g r o u po fe d h g r o u p ( p o 0 1o rp 0 0 5 ) 3 c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm d a i ns e r u ma n di nl u n gt i s s u e i nm o d g r o u pa n de v e r yt r e a t m e n tg r o u ps i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 5o rp o o 1 ) ； t h ec o n c e n t r a t i o no fm d ai ns e r u mi no t h e rt i m ep i o n t so fe d - mg r o u p ，e d - hg r o u p a n dd e xg r o u pw a ss i g n i f i c a n tl o w e rt h a nm o dg o u pe x c e p tt h e6 hs u b g o u po fe d - m g r o u p ；t h ec o n c e n t r a t i o no fm d a i nl u n gt i s s u ei ne d - mg r o u p ，e d hg r o u pa n dd e x g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l o w e rt h a ni nm o dg o u p ( p o 0 5o rp 0 01 ) ；t h e r ew e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne d lg r o u pa n dd e xg r o u pe x c e p tt h e6 hs u b g o u po f d e xg r o u p ，e d hg r o u p ( p 2 4s u b g r o u p 6 hs u b g r o u p ) ，a n d t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne v e r ys u b g r o u pe x c e p tt h e4 8 hs u b g r o u pa n d 7 2 hs u b g r o u p ( p o o1o rp o 0 5 ) t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne d l g r o u pa n de d hg r o u pi nl u n gt i s s u e ( p 0 0 5 ) 4 c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ea c t i v i t i e so fs o d i ns e r u mi nm o d g r o u pa n de v e r y t r e a t m e n tg r o u ps i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 01 ) ；t ，t h ea c t i v i t i e so fs o di ns e r u mi n e d - mg r o u p e d - hg r o u pa n dd e xg r o u pw a ss i g n i f i c a n tl o w e rt h a ni nm o dg o u pa n d e d lg r o u p ( p 0 0 5o rp 0 01 ) c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ea c t i v i t i e so fs o di nl u n g t i s s u ei nm o dg r o u pa n d e v e r y t r e a t m e n t g r o u ps i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da t6 h o u r s ( p o o1 ) a n dd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t2 4 hi nm o da n de d - lg r o u p ，i n c r e a s e da t 4 8 ha n d7 2 h ( p 0 01 ) ；t h ea c t i v i t i e so fs o di ns e r u mi ne d - mg r o u p ，e d hg r o u pa n d d e xg r o u pw a ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a ni nm o dg o u p ( p 0 0 5o rp o o1 ) ；t h e r ew e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne d lg r o u pa n de d hg r o u p ( p 2 4s u b g r o u p 6 hs u b g r o u p ) ，a n dt h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n e v e r ys u b g r o u ( 尸如0 1o r 户 o 0 5 ) 5 c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ec o n c e n t r a t i o no f t n f ai nm 0 dg r o u pa n de v e r y t r e a t m e n t g r o u p i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) ，c o m p a r e d t om o dg r o u p ，i t s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di ne d - mg r o u p ，e d - hg r o u pa n dd e xg r o u p ( p 0 0 5o rp 4 8 hs u b g r o u p 2 4 hs u b g r o u p 6 hs u b g r o u p ) ；t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e ne v e r ys u b g r o u pe x c e p t2 4 hs u b g r o u pa n d4 8 hs u b g r o u p ，a n da l s oe x c e p t4 8 h s u b g r o u pa n d7 2 hs u b g r o u p ( p 0 0 5 ) 6 c o m p a r e dt oc o ng r o u p ，t h ei o do fn f - r o bp 6 5 i nm o dg r o u pa n de v e r y t r e a t m e n tg r o u pd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 01 ) ；c o m p a r e dt om o dg r o u pa n de d - l g r o u p ，i ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ne d - mg r o u p ，e d - hg r o u pa n dd e xg r o u p ( 尸 o 0 1o r 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dt ot h es u b g r o u po f 6h o u r s ，t h ei o di n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y i l l2 4h o u r ss u b g r o u po fm o d g r o u pa n de v e r yt r e a t m e n tg r o u p ( 尸 3 m g k g ) a n d d e x a m e t h a s o n ec a ni m p r o v et h ea c u t el u n gi n j u r ye f f e c t i v e l yi n d u c e db yp a r a q u a t p o i s i o n i n gi nr a t s ，a n dt h eh i 曲d o s ee d a r a v o n ew a st h eb e s t ；w h i l el o wd o s e so f e d a r a v o n ed o n o th a v ea p p a r e n te f f e c t 2 t h em e c h a n i s mo ft h ep r o t e c t i v ee f f e c to f e d a r a v o n em a y b e ：( 1 ) p r o m o t i n gt h ea n t i o x i d a n td e f e n s e sa n ds c a v e n g i n gt h ed a m a g e o ff r e er a d i c a l s ；( 2 ) i n h i b i t i n gn u c l e a rt r a n s c r i p t i o nf a c t o ra n da f f e c t i n gt h ee x p r e s s i o no f i n f l a m m a t o r yf a c t o r k e y w o r d se d a r a v o n e ；p a r a q u a t ；a c u t el u n gi n j u r y ；f r e er a d i c a l s ；t n f - a ；n f - r , b 7 徐州医学院硕士学位论文 静士 日盯吾 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) 是一种广泛应用的非选择性触杀型除草剂，对人畜有较 强毒性，可经皮肤、呼吸道、消化道造成急性中毒，口服是主要的中毒途径，人 经h 致死量约3 0 4 0 m g k g 。中毒后可累及人体多个重要器官，肺为其主要靶器官， 大剂量口服后可在短时间内迅速发生急性肺损伤( a l l ) 进而出现急性呼吸窘迫综合 征( a r d s ) 【l i 。 由于肺泡细胞对p q 具有主动摄取和蓄积特性，中毒后肺组织p q 浓度可达血 浆浓度的1 0 9 0 倍，p q 中毒的特征性改变是肺损伤，表现为早期肺泡上皮细胞受 损，肺泡内出血水肿，炎性细胞浸润，晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化，称为 “百草枯肺 2 1 ，是急性呼吸窘迫综合征( a r d s ) 的- - 种变异形式，也是急性p q 中毒患者的主要死亡原因 3 1 。急性p q 中毒致急性肺损伤的机制目前尚未完全阐明， 中外学者进行了较多的研究，目前主要集中在以下方面： 1 氧自由基生成学说。目前普遍认为急性p q 中毒所造成的a l l 主要与活性氧、 过度脂质过氧化反应产生的脂质过氧化氢物以及还原型谷胱甘肽( g s h ) 含量减少 有关【4 】。p q 接受电子后，经微粒体还原型辅酶i i 、细胞色素c 、还原酶等催化下 经过一系列氧化过程产生有毒的h 2 0 2 、0 2 及o h 等自由基，同时，由于氧自由基 生成增多，导致细胞抗氧化酶系的耗竭，使膜脂质失去了保护作用，更加重了活性 氧类物质如超氧阴离子对膜脂质的过氧化损伤，可直接损害主要细胞成分，从而造 成组织细胞损伤1 5 j 。 2 炎症因子损伤学说p q 通过促进肺炎症细胞基因的表达来加重炎症反应， 从而加重肺损伤【6 1 。其中最主要的一条途径就是n f r , b 信号转导通路【7 1 。n f r b 是调控炎症反应的一种重要核转录因子，可在多种细胞中被激活，通过调节多种 前炎性因子趋化因子、黏附分子、生长因子等的表达，在应激反应、炎症和免疫 反应等过程中发挥重要甚至中心作用。一方面，n f r b 活化后可使宿主细胞细胞 徐州医学院硕士学位论文 因子的基因转录增加，并激活其它细胞合成i l 6 、i l 8 等因子，形成一个n f 1 c b 与细胞因子网络之间的正反馈圈，放大炎症反应，使肺损伤进一步加重【硼；另一方 面，n f 1 c b 基因调控范围十分广范，除上述的前炎症因子外，还参与了一氧化氮 合酶( i n o s ) 的基因转录，对诱导型一氧化氮合酶( i n o s ) 的基因转录均有调控作用 【9 】，使肺内n o 含量增加，后者作为自由基成分加重肺损伤。佟飞等在研究急性 p q 中毒大鼠肺组织n f 姐及其i n o s 表达变化的研究中发现，肺组织n f r b 活性 及其i n o s m r n a 表达明显增强，可能是氧自由基的激活而使i n o s 基因转录增 加【1 0 1 。 3 基因和分子水平的研究p q 在分子水平上对细胞的损伤表现为d n a 的氧 化性损伤，主要表现为d n a 的碱基改变和链的断裂【1 1 】。以碱基改变和链断裂为主， 且羟基的作用最为明显，易与d n a 和碱基反应而改变结构。国外学者通过基因原 位杂交显示，急性p q 中毒大鼠肺c l a r a 细胞和肺泡巨噬细胞的碱基序列t a t a 结 合蛋白相关因子、r n a 聚合酶i i 和一个可能和脂质营养不良有关的基因l p i n z 明 显上调【1 2 】。这些表明，p q 可能直接作用于某些基因片段，影响其表达，从而造成 细胞损伤。 4 其他机制急性p q 中毒致a l i 的其他机制还有线粒体的损伤，线粒体内出 现钙超载，加重细胞损伤，同时胞质中过多的钙可形成磷酸盐沉积于线粒体，使线粒 体结构和功能被破坏【1 3 1 。 急性p q 中毒的治疗目前仍处于探索阶段，现行的治疗药物及方法包括洗胃、 导泻、血液灌流、抗自由基药物、免疫抑制剂以及中药治疗等综合措施，但疗效 不确切，寻找特异性的、有效的治疗方法一直是临床医师追求的目标。 依达拉奉( e d a r a v o n e ) ，化学名为3 甲基1 苯基2 比唑啉5 酮，是目前在临床 上使用的自由基清除齐i j 【1 4 1 ，对脑缺血的治疗表现出良好的疗效【1 5 】。许多研究表明 依达拉奉对心肌和肺脏的急性损伤有明显的保护作用【1 6 】。近年来研究还发现依达 拉奉在临床治疗脑梗塞方面有较好疗效、对氧化应激因素参与的疾病也具有一定 9 徐州医学院硕士学位论文 的治疗作用。动物实验研究发现依达拉奉可抑制i n o s 的m r n a 的表达，减少活 化的小神经胶质细胞的活性氧簇( r o s ) 和n o 的产生，减轻小胶质细胞诱导的神经 元死亡和树突毒性现象f 1 7 】；依达拉奉可能通过抑制大鼠肝脏巨噬细胞或肝内其它 细胞的n f 1 c b 的活化，进而抑制血清中，i n f 吨、i l 1 、i l 1 2 等释放，并减少肝内 t n f - a 、i l 一1 2 和i n o s 的含量，降低血清肝酶和m d a 水平，抑制肝脏炎症反应， 减轻肝损害1 1 8 】。在临床病例观察中发现依达拉奉对急性p q 中毒导致的急性肺损伤 有治疗作用【1 9 1 ，但具体作用机制尚不明了，我们试图从细胞因子网络层面探讨其 可能的作用机制。 l o 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 1材料 1 1 实验动物 雄性s d 大鼠1 4 4 只，体重2 3 0 9 - - 2 6 0 9 ( f l j 徐州医学院实验动物中心提供) 。 生产许可证号为：s v x k ( 苏) 2 0 0 2 0 0 3 8 ，符合国家健康一级动物标准。大鼠均给予 标准饲料喂养，自由摄食及饮水，独立通风隔离笼具饲养，室温保持在( 2 5 士3 ) ，避免噪音干扰，保持环境安静。 1 2 主要仪器 名称产地 b i o t a k e l x 8 0 0 酶标仪 s a n i et e c a n 7 2 1 分光光度仪日本 高速低温离心机( 5 8 0 4 r )德国 超低温冰箱h e t o 丹麦 恒温振荡水浴箱s h a c 金坛市 电子天平上海第二天平仪器厂 电热恒温干燥箱2 0 2 2上海实验仪器厂 石蜡切片机德国l e i e a 公司 o l y m p u s b x 5 1 显微图像采集系统日本 1 3 主要药品和试剂 名称来源地 2 0 百草枯浓缩液山东农药股份有限公司 依达拉奉注射液吉林博大制药有限公司 地塞米松注射液山东鲁抗辰欣药业有限公司 兔抗大鼠核因子n f r bp 6 5 抗体美国b i o w o r l d 公司 2 实验方法 2 1实验分组 将1 4 4 只雄性s d 大鼠随机分为对照组( c o n 组) 、p q 染毒模型组( m o d 组) 、 p q 染毒+ 低剂量依达拉奉治疗组( e d l 组) 、p q 染毒+ 中剂量依达拉奉治疗组( e d - m 组) 、p q 染毒+ 高剂量依达拉奉治疗组( e d - h 组) 、p q 染毒+ 地塞米松治疗组( d e x 组) ；6 组再进一步分为6h ，2 4 h ，4 8h 和7 2h 四个亚组，每组6 只，动物在实验 前禁食1 2 h ，禁水8h 。 2 2 动物模型的制备 采用腹腔注射2 0 p q ( 2 5m g k g ，用生理盐水稀释成5m g m 1 ) 1 2 0 1 方法制备急 性p q 中毒大鼠模型，c o n 组大鼠经腹腔注射等容的生理盐水。2 3 给药方法和剂 量腹腔注射l 小时后，按以下方法和剂量给药： c o n 组和m o d 组：生理盐水 2 m l e d l 组：e dl m g k g ；e d - m 组：e d3 m g k g , e d - h 组：e d 5 m g k g ； d e x 组：地塞米松3 m g k g ；各干预药物均用生理盐水稀释至2 m l 后腹腔注射， 每日两次，用药至处死动物的前一天。 2 4 标本采集 在各时间点用1 0 水合氯醛腹腔注( 3 0 0 m g k g ) 麻醉大鼠，将其仰卧、四肢与 头部固定在大鼠解剖台，沿胸骨正中剪开胸骨，打开胸腔，暴露心脏和肺脏，直 接心脏采血，采血的注射器及试管均在实验前用5 0 0 u m l 肝素湿润，血样在4 徐州医学院硕士学位论文 条件下离心1 0m i n ( 3 0 0 0r m i n ) ，取上清，8 0 c 保存，待检。采血后放血处死大鼠， 剪开胸腔结扎左右肺并取左肺组织制备肺组织匀浆；右肺上中叶组织测定肺湿干 比( w d ) ；右肺下叶组织于l o 甲醛固定，2 4h 后做石蜡包埋，做成4g m 厚的切 片，h e 染色行光镜检查；并用免疫组化法检测肺组织n f r bp 6 5 的表达。 2 5 肺组织匀浆制备 取左肺组织在冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放在匀浆管 口部，用眼科剪尽快剪碎组织块( 此操作在冰面上进行) ，每份样本先加入l m l 预 冷生理盐水作为匀浆介质，用高速分散器匀浆，匀浆转数为8 0 0 0 r m i n ，匀浆时间 5 s 次，间隙3 0 s ，连续3 次，匀浆需在冰水中进行。然后向每个样品匀浆中补足 剩余的冷生理盐水，最终每个样品加入的冷生理盐水总量是组织块重量的9 倍， 制成1 0 的组织匀浆。用低温离心机离心，离心速度3 5 0 0 r m i n ，离心1 5 m i n ，取 上清液，即刻集中检测。 2 6 肺组织湿干比( w d ) 测定 将待测肺组织剔除多余结缔组织，吸水纸拭干表面血液，用电子天平精确称 其重量( w ) ，然后放入8 0 电热恒温箱烘烤4 8h 后，再次称其重量( d ) ，计算肺 湿干重比( w d ) 。 2 7m d a 测定( 采用硫代巴比妥酸( t b a ) 比色法) 基本原理：氧自由基可氧化细胞质中的不饱和脂肪酸，生成多种脂质过氧化 物。丙二醛( m d a ) 是脂质过氧化反应的主要产物，在醋酸酸性条件下加热可与硫 代巴比妥酸( t b a ) 发生反应，生成红色的化合物，该化合物为一种荧光物质，在 5 3 2n m 处有最大吸收峰。 试剂盒组成与配制： ( 1 ) 试剂一：液体2 0 m l ，室温保存。 ( 2 ) 试剂- - 液体1 2m l ，用时每瓶加3 4 0m l 双蒸水混匀，4 c 冷藏。 ( 3 ) 试剂三：粉剂一支，用时加入到9 0 1 0 0 。c 双蒸水，充分溶解后用双蒸水 徐州医学院硕士学位论文 补足至6 0 “，再加冰醋酸6 0 m l 混匀。 ( 4 ) 标准品：1 0n m o l m l 四乙氧基丙烷5m l ，4 冷藏。 具体步骤： ( 1 ) 在标准管、空白管和测定管中分别加入相同体积( o 2 m 1 ) 的