（果树学专业论文）枇杷eriobotrya+japonica+lindldella基因的克隆与分析.pdf

独创性声明 学位论文题目：批担坦堕鲤业垡迎垒丝丝垡l i 望亟! ：) 丝丝基固鲍 杰隆生佥堑 一一 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：刁场强l 签字日期：y1 年易月r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：日不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：才队导师签名：蝴 签字日期：弘年6 月g - 日 签字日期：y 仂l 年易月弓日 3 3 讨论1 6 3 3 1 枇杷d n a 提取。1 6 3 3 2 枇杷r n a 提取1 7 第四章枇杷d e l l a 基因同源序列克隆与分析1 9 4 1 材料与方法19 4 1 1 材料19 4 1 2 试剂19 4 1 3 仪器设备1 9 4 2实验方法19 4 2 1p c r 引物设计19 4 2 2 枇杷d n a 和r n a 的提取及检测2 0 4 2 3e d n a 第一链反转录2 0 4 2 4p c r 扩增和r t - p c r 扩增2 0 4 2 5 条带的回收及电泳检测21 西南大学硕 1 学位论文 4 2 63 - r a c ec d n a a m p l i c a t i o n 2 1 4 2 7 目的片段与载体的连接。2 3 4 2 8 重组质粒转化入大肠杆菌2 4 4 2 9 重组质粒的提取及电泳检测。2 4 4 2 1 0 阳性克隆的筛选与鉴定2 5 4 3结果与分析2 6 4 3 1d e l l a 蛋白基因同源序列克隆2 6 4 3 2 枇杷d e l l a 基因序列分析2 9 3 4 讨论3 7 3 4 1 同源基因序列克隆法克隆枇杷d e l l a 基因序列3 7 3 4 2 枇杷d e l l a 基因的特征3 8 第五章枇杷d e l l a 同源基因的初步表达4 1 5 1 材料与方法4 l 5 1 1 材料4 1 5 1 2 主要仪器设备4 1 5 1 3 方法4 1 5 2 结果与分析4 1 5 2 1i n a 的定量。4 1 5 2 2 枇杷d e l l a 基因的表达情况4 l 5 3 讨论。4 2 第六章论文结论、创新点与进一步研究设想4 3 6 1 结论4 3 6 2 本研究的创新点4 3 6 3 进一步研究设想4 3 参考文献4 5 硕士在读期间发表论文与参研课题5 5 致 射5 7 摘要 枇杷( e r i o b o t r y aj a p o n i c al i n d l ) d e l l a 基因的克隆与分析 果树学硕士研究生：杨敏 指导教师：梁国鲁研究员 摘要 d e l l a 蛋白位于植物细胞核中，在g a 信号传导过程中起阻遏作用，还广泛参与植物光形 态建成、环境信号传导和激素生长调节反应等生理过程。国内关于d e l l a 蛋白相关基因的研 究起步较晚，但受到研究者的高度重视。近年来，获得了玉米g a 受体基因、拟南芥d e l l a 下 游的g a s a 基因家族、水稻s l r l 基因、茄子s m g a 廛因、海岛棉g h r g l ( r g l l i k e ) 基因等一 批d e l l a 蛋白基因，并开展了载体构建、基因表达和功能分析等相关研究。目前，尚无枇杷 d e l l a 蛋白相关基因的研究报道。本研究采用同源基因序列克隆方法对不同品种、同一品种 不同倍性的枇杷进行d e l l a 基因克隆，再通过r a c e 扩增扩其全长，并进行序列比对分析。同 时通过r t - p c r 扩增对枇杷d e l l a 基因的表达进行初步分析。为继续开展枇杷d e l l a 蛋白的功 能鉴定、时空表达分析等进一步研究奠定基础。本论文主要研究结果如下： ( 一) 枇杷d n a 和r n a 提取方法改良 利用c t a b 改良方法i 、c t a b 改良方法i i 提取基因组d n a 和改良c t a b l i c l 沉淀法提取 r n a ，提取的核酸质量较高，基本克服了多糖、多酚等杂质的影响，可以满足基本分子生物 学实验的要求，保证后续试验的顺利进行。 ( 二) 枇杷d e u 4 基因同源序列克隆 l 、利用正交试验设计筛选得到p r i m e s t a r t mh sd n a p o l y m e r a s e 特异引物p c r 扩增产 物的最优体系：5 x p r i m e s t a b u f f e r ( 含m d + ) 3 皿，d n t pm i x t u r e ( 各1 0m m o l l ) 1 6 i t l ，上 游引物( 1 0r e t o o l l ) 0 4 止，下游引物( 1 0m m o l l ) 0 4l a i , ，模板d n a c d n a ( 2 0n 止) 0 4 此， p r i m e s t a r t mh sd n ap o l y m e r a s e ( 2 5u 仙) 0 2 皿，加灭菌去离子水补足2 0 皿。 2 、根据g e n e b a n k 中登录的苹果d e l l a 蛋白基因序列设计了一对简并引物，对“大五星”( a ) 和“龙泉1 号”( b ) 基因组进行p c r j 广增克隆，得到长度都在7 0 0 b p 左右的片段，其中“大五星”三 条( 暂命名为s e q u e n c e a l - a 3 ，“龙泉1 号”三条( 暂命名为s e q u e n c eb i b 3 ) ，b l a s t 比对发现 与苹果属d e l l a 基因的同源性达9 0 以上，全为外显子序列，无内含子。 3 、根据“龙泉1 号”s e q u e n c eb 3 设计特异引物，对“龙泉1 号”二倍体、三倍体的g d n a 和e d n a 进行p c r 扩增，得两条特异片段，片段长度都为7 3i b p 。通过b l a s t 比对，其中为 一条与s e q u e n c e b 3 序列一致，另外一条与s e q u e n c e b 3 同源性达9 4 ，存在单核苷酸变异，暂 命名为s e q u e n c e b 3 a ，经同源性比对均为d e l l a 基因片段。 l 两南大学硕 j 学位论文 4 、根据s e q u e n c e b 3 a 基因序列片段设计r a c e 扩增引物进行r a c e 扩增，得到3 端4 6 4 b p 的序列，在g e n b a n k 上经过b l a s t 分析，发现该片段与苹果属m d r g l 3 a ( g e n b a n k 登录号： d q 0 0 7 8 8 7 ) 同源性为9 7 ，与m d r g l 3 b ( g e n b a n k 登录号：d q 0 0 7 8 8 8 ) 同源性为9 2 ，表明 为d e l l a 同源基因序列。 一 一 7 ” ( 三) 枇杷d e l l a 基因序列分析 l 、比对枇杷不同品种的d e l l a 基因片段，发现“大五星”和“龙泉l 号”6 条序列彼此之间的 同源性都超过6 0 。两个品种之间的3 条d e l l a 基因序列都存在着多个核苷酸差异，而单个品 种的3 条基因序列之间也存在着核甘酸差异。 2 、比对枇杷同一品种不同倍性的d e l l a 基因片段，发现从“龙泉1 号”二倍体g d n a q = 克隆 得至l j s e q u e n c e b 3 和s e q u e n c e b 3 a 两条序列，而c d n a 中只克隆得至u s e q u e n c e b 3 a 。“龙泉l 号”三倍 体g d n a 和c d n a e 3 都克隆得到这两个序列，据此推测二倍体q b s e q u e n c e b 3 发生了基因沉默， 而三倍体中均得到表达。 3 、将克隆得到的7 条基因片段同g e n e b a n k k 已经登录的蔷薇科苹果属d e l l a 蛋白基因序 列一起构建分子进化树，发现该进化树分成三个大的进化分支，枇杷7 条序列分散在其中。 4 、r a c e 扩增拼接得到“龙泉1 号”s e q u e n e e b 3 ae d n a3 端核甘酸序列，长度为1 0 9 5b p ， 包含终止密码子1 a a ，还包含了对应3 端的一段不翻译区。该序列的有效翻译区长度为9 1 5 b p ， 翻译该d e l l a 蛋白c 端序列3 0 4 个氨基酸。分析发现枇杷d e l l a 蛋白c 端氨基酸序列与其 它已报道物种的d e l l a 基因高度同源，包含c 端v h i i d 、r v e r 和s a w 保守结构域。用b i o e d i t 等软件对该序列编码蛋白结构与功能进行了预测。 ( 四) 枇杷d e l l a 同源基因表达的初步分析 利用半定量r t - p c r 的方法对“龙泉l 号”二、三倍体的叶片和初花期、露白期、盛花期、花 末期四个时期花器官d e l l a 同源基因的表达进行了初步研究，结果表明，无论是二倍体还是 三倍体d e u 4 基因在各个器官中都有表达，同一发育时期，三倍体中d e l l a 基因的表达水平 比二倍体高。三倍体d e l l a 基因在上述四个时期花器官的表达量逐渐增大。与二倍体相比， 末花期d e l l a 蛋白表达明显增加。 关键词：枇杷d e l l a 蛋白基因克隆r a c e 扩增序列分析基因表达 n a b s t r a c t l ag e n e sc l o n ea n d a n a l y s i si n l o q u a t ( e r i o b o t r y aj a p o n i c al i n d l ) c a n d i d a t e ：y a n gm i n a d v i s e r s ：p r o f l i a n gg u o l u a b s t r a c t d e l l a p r o t e i n sl o c a t e di nc e l lu n c l e u si nb o t a n y , f u c t i o nb ear e p r e s s o ri ng a c e l ls i g n a l i n g p r o c e s s m o r et h a nt h a t , d e l l ap r o t e i n sw i d e l yp a r t i c i p a t ei np h y s i o l o g yp r o c e s s e ss u c ha sb o n a n y p h o t o m o r p h o g e n e s i s ，p l a n te n v i r o n m e n tc e l ls i n g n a l i n g , a n ds o m eo t h e rp h y t o h o r m o n e sr e s p o n i n g t op l a n tg r o w t hr e g u l a t i o n r e l a t e d g e n e sa b o u td e l l ap r o t e i n sr e s e a r c hr e l a t i v e l yl a t ei nc h i n a , b u t i ti sp l a y e dc l o s ea t t e n t i o nt ob yt h er e s e a r c h i s t f o rt h ep a s tf e wy e a r s ，ab a t c ho fd e l l ag e n e s w e r ec l o n e d ，g ar e c e p t o rg e n ei nm a i z e ，d e l l ad o w n s t r e a mg e n eg a s ag e n ef a m i l yi n a r a b i d o p s i s ，s l r lg e n ei nr i c e ，s m g a ig e n ei ne g g p l a n lg h r g lg e n e ( r g l - l i k e ) i ng o s s y p i u m b a r b a d e n s e ，a n ds oo n f u r t h e r m o r e ，c o r r e l a t i o n a lr e s e a r c ha b o u tt h ec o n s t r u c t i o no fv e c t o r , g e n e e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i sw e r ec a r r y i n go u t a tp r e s e n t , t h e r eh a v en o tb e e nr e l a t i v e r e s e a r c hr e p o r t sa b o u td e l l ag e n e w ec l o n e dd e l l ag e n e si nl o q u a to fd i f f e r e n tv a r i e t i e so r d i f f e r e n t - p l o i d yi nt h es a m ev a r i e t yb yt h em e t h o do fh o m o l o g o u ss e q u e n c ec l o n i n g t h e nw e e x p a n d e dt h eo v e r a l ll e n g t hb yr a c e ，a n da n a l y s e dt h es e q u e n c e sb ya l i g n m e n t a n dt h e nw ed i d t h ep r e l i m i n a r i l yq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa b o u td e l l ag e n e se x p r e s si n l o q u a tb y r t - p c r a m p l i f i c a t i o n t h er e s u l t so ft h es t u d yw i l le s t a b l i s ht h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo f c o n d u c t i n gf u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o n ，s p a c e - t i m eg e n ee x p r e s s i o na n ds o m eo t h e rr e l a t i v er e s e a r c h e s a b o u td e l l a p r o t e i n si nl o q u a t t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w i n g 1 i m p r o v e dt h ee x t r a c t i n gm e t h o do f d n aa n dr n a i nl o q u a t e x t r a c t i n gt h ed n ab yt h em e t h o do fc t a bi m p r o v e dm e t h o d ia n dc t a bi m p r o v e dm e t h o d i i ，a n de x t r a c t i n gt h er n ab yt h em e t h o do fi m p r o v e dc t a b l i c lm e t h o do fp r e c i p i t a t i o n , w e o b t a i n e dd n aa n dr n aw i t hh i g h e rq u a l i t y , b a s i c a l l yo v e r c o m i n gn e g a t i v ei n f l u e n c e so fe p i d e r m i s w i t hm o r ef u z za n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，s u c ha sp o l y s a c c h a r i d e ，p o l y p h e n o l ，p r o t e i n ，a n ds oo n , t o t a l l ym e e t i n gt h ed e m a n do fb a s i c a lm o l e c u l a rb i o l o g i c a le x p e r i m e n t s ，a n dg u a r a n t e e i n gt h e e x p e r i m e n t sf o l l o w - u pt og ot ow e l l 2 h o m o l o g o ms e q u e n c ec l o n i n go fd e l l ag e n e si nl o q u a t i i i 两雨大学硕 ：学位论文 ( 1 ) o b t a i n e dt h eo p t i m u ms y s t e mp r i m e s t a h sd n ap o l y m e r a s es p e c i f i cp c r a m p l i f i c a t i o nb yo r t h o g o n a lt e s ts c r e e n i n g ( t o t a l2 0 v l ) ：5 p r i m e s t a r t mb u f f e r ( m 9 2 + p l u s ) 3 此， d n t pm i x t u r e ( e a c h2 5 止) 1 6 1 a l ，f o r w a r dp r i m e r0 4 止，r e v e r s ep r i m e r0 4 1 t l ，t e m p l a td n a e d n a0 4 此，p r i m e s t a r t mh sd n a p o l y m e r a s e ( 2 5u “l ) o 2 此，d d h 2 0u pt o2 0 1 a l ， ( 2 ) d e v i s i n gap a i ro fd e g e n e r a t ep r i m e r sa c c o r d i n gt ot h ed e l l ag e n es e q u e n c e si nm a l u s l o g i n e d i n n c b i ，w eg a i n e d t h e r e f r a g m e n t s ( t e m p o r a r i l y n a m e d s e q u e n c e a 1 - a 3 ) i n d a w u x i n g ( a ) ， a n do t h e r t h e r e f r a g m e n t s ( t e m p o r a r i l y n a m e d s e q u e n c e b i - b 3 ) i n “l o n g q u a n n o 1 ”( b ) ，a l m o s tw i t h7 0 0 b p ，b yd n ap c ra m p l i f i c a t i o na n dc l o n e t h er e s u l t so f b l a s t s h o w e dt h e r eh a db e e nm o r et h a n9 0 i d e n t i t i e sb e t w e e nt h e s ef r a g m e n t sa n dd e l l ag e n e s s e q u e n c e si nm a l u s ，a n dt l l e yw e r ee x o ns e q u e n c e s ，n o tc o n t a i n i n gi n t r o n s ( 3 ) d e v i s i n gap a i ro fp e c u l i a rp r i m e ra c c o r d i n gt os e q u e n c eb 3i n “l o n g q u a n n o 1 ”，w eg m n e d t w os p e c i f i cf r a g m e n t s ，w i t h7 31b p ，b yp c ra m p l i f i c a t i o no fg d n aa n de d n ai nd i p l o i da n d t r i p l o i do f “l o n g q u a n n o 1 t h er e s u l t so fb l a s ts h o w e dt h e yb o t hw e r e 腿己“g e n e sf r a g m e n t s w i t hm o n o n u e l e o t i d ev a r i a t i o n , o n eo ft h e mw a sa c c o r d a n c ew i t ht h es e q u e n c e b 3 ，a n da n o t h e rh a d t h e9 4 i d e n t i t i e sw i t hi t , t e m p o r a r i l yn a m e ds e q u e n e e b 3 a ( 4 ) d e v i s i n gap r i m e ra c c o r d i n gt os e q u e n c eb 3 af o rr a c ea m p l i f i c a t i o n , w eg a i n e d3 f r a g m e n t sw i t h6 4 6 b p t h er e s u l t so fb l a s ts h o w e dt h a tt h e r ew e r e9 7 i d e n t i t i e sb e t w e e nm d r g l 3 a ( g e n b a n ka c c e s s i o n ：d q 0 0 7 8 8 7 ) w i t hi t ，a n d9 2 i d e n t i t i e sb e t w e e nm d r g l 3 b ( g e n b a n k a c c e s s i o n ：d q 0 0 7 8 8 8 ) w i t hi t 3 s e q u e n c e sa n a l y s i sa b o u td e l l ag e n e si nl o q u a t ( 1 ) b ya l i g n m e mo f d e l l af r a g m e n t si nl o q u a tf r o md i f f e r e n tv a r i e t i e s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r em o r et h a n6 0 i d e n t i t i e sa m o n gt h e6f r a g m e n t si n “d a w u x i n g a n d “l o n g q u a nn o 1 ” t h e r ew e r em u l t i p l em u t a n t sn u c l e o t i d ea m o n gt h e3f r a g m e n t sb e t w e e nt h et w ov a r i e t i e s ，a n da l s o b e e na m o n gt h e3f r a g m e n t si nt h es a m e v a r i e t y ( 2 ) b ya l i g n m e n to fd e l l af r a g m e n t si nl o q u a tf r o md i f f e r e n t - p l o i d yi nt h es a m ev a r i e t y , t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hs e q u e n c e b 3a n ds e q u e n c e b 3 aw e r ec l o n e df r o mg d n a i n “i o n g q u a n n o 1 ” d i p l o i d , w h i l eo n l ys e q u e n c e b 3 af r o me d n af r o mi t , a n db o t ho ft h e mw e r ec l o n e df r o mb o t h g d n aa n de d n ai n “l o n g q u a n n o 1 ，t r i p l o i d o nt h e s eg r o u n d s w ei n f e r r e dt h a ts e q u e n c e b 3 s h o u l do c c u r g e n es i l e n c ei nd i p l o i d , a n ds h o u l de x p r e s si nt r i p l o i d ( 3 ) s t r u c t u r i n gm o l e c u l a re v o l u t i o n a r yt r e eo ft o g e t h e rt h e s e7f r a g m e n t si ni o q u a tw i t hd e l l a g e n e ss e q u e n c e si nm a l u si nr o s a c e a el o g i ni ng e n b a n k , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r e es e p a r a t e d i n t ot h r e ee v o l u t i o nb r a n c h e s ，t h e s e7f r a g m e n t si nl o q u a tn e s t e di n t ot h e m ( 4 ) w eg a i n e ds e q u e n c e b 3 a3 f r a g m e n t si n “l o n g q u a nn o 1 ”b yr a c ea m p l i f i c a t i o n , w i t h 10 9 5b p ，c o n t a i n i n gt e r m i n a t o re o d o nt 从a n dan ot r a n s l a t i o nr e g i o n t h ee f f e c t i v et r a n s l a t i o n a b s t r a c 丁 r e g i o nt r a n s l a t e di n t o3 0 4a m i n oa c i d si nct e r m i n a l ，w i t h9 15 b pn u c l e i ca c i d s t h e r ew e r eh i g h l y i d e n t i f i e sb e t w e e no t h e rv a r i e t i e sr e p o r t e da n dt h i sct e r m i n a l 4 p r e l i m i n a r ye x p r e s s i n ga n a l y s i so fd e l l ag e n e si nl o q u a t s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rw a su s e dt ov a l i d a t et h ea c t u a le x p r e s s i o no fd e l l a h o m o l o g o u s g e n e so fd i p l o i d ya n dt r i p l o i d y “l o n g q u a nn o 1 i nl e a v e sa n df l o w e r sa td i f f e r e n tt i m e sd u r i n g d e v e l o p m e n t t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed e l l ah o m o l o g o u sg e n e sh a v ee x p r e s s i o ni na l lt i s s u e s t h ee x p r e s s i o ni n t r i p l o i d yw a sh i g h e rt h a ni nd i p l o i d ya n di n c r e a s e si nf l o w e r sd u r i n gt h e d e v e l o p m e n t t h ed e l l ah o m o l o g o u sg e n e sw e r eo v e re x p r e s s e di nt h ee n d i n gb l o o m i n g c o m p a r e dw i t hd i p l o i d y k e yw o r d s ：l o q u a t ；d e l l ap r o t e i n s ；g e n ec l o n e ；r a c ea m p l i f i c a t i o n ；a l i g n m e n t ；g e n ee x p r e s s i n v v i 两南大学硕卜学位论文 第一苹文献综述 第一章文献综述 1 1 枇杷研究概况 1 1 2 枇杷基因克隆研究概况 枇杷( e j a p o n i c a ) 原产中国，属于蔷薇科( r o s a c e a e ) ，枇杷属( e r i o b o t r y a ) 。已有2 1 0 0 多年的栽培历史【l 】。枇杷果肉柔软多汁，营养丰富，具有止咳、化痰、润肺、健脾等功效，是 重要的营养和保健果品。枇杷栽培经济效益显著，是我国农业结构调整和果树业结构调整的 重要树种。 枇杷常规育种方式为实生选种、芽变选种或者有性杂交育种。因果树基因杂合性和童期 长等特点，使常规育种受到限制，但是应用生物工程技术有可能打破这种限制而备受关注。 而其中植物基因工程技术无疑已成为当今作物遗传育种、改良品种体系的重要途径之一，其 研究成果和应用前景倍受重视。 基因是遗传物质的最基本单位，也是生命活动的基础。要揭示或者改变某个基因的功能， 都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起 点。基因克隆的方法有多种，对已知序列的基因克隆是其中最为简便的一种。即将别人报道 的基因序列( 参考常用的基因库有：e m b l ，g e n b a n k ，s w i s s p o r t 和t r e m b l ) 直接作为自己 克隆的依据，设计所需要的特异引物，通过p c r 从基因组中克隆该基因，也可以通过r t - p c r 克隆c d n a 。 以枇杷多年生木本果树为试材进行基因工程育种，在世界范围来说都是一个难点，起步 晚，进展慢。枇杷的基因克隆研究主要集中在成花相关同源基因，枇杷类胡萝卜素合成相关 基因，逆境胁迫相关基因，有机酸合成相关基因，等。 成花是高等植物生活史中一个重要的生理现象，研究开花机理是一个涉及到植物发育机 制等许多基本问题的课题。短的开花时间导致了短的子代发育时间，因此有助于加速育种进 程。宋虎卫等以“早钟6 号”枇杷为试材，克隆了枇杷花3 个关键基因f _ , j t f l l 、e j l f y 、e j a p i ， 对这三个基因进行时空表达分析1 2 1 ，认为e j l f y 的表达特性与拟南芥1 3 1 的表达模式基本类似， 而e j a p i 与苹果【4 】a p l 同源基因表达模式类似，e j t f l i 则与楹椁【习的表达模式较类似。同时刘 月学等以“早钟六号”为试材，克隆了l e a f y 、f _ j a p 同源基因片段、c d n a 和d n a 全长的克 隆，对部分枇杷属野生种进行特异p c r 扩增研究，并且用定量r t - p c r 的方法对这两个基因 的时空表达进行了研究 6 1 ：刘月学等从枇杷栽培品种“香钟1 1 号”和野生种栎叶枇杷基因组 d n a 中各扩增出1 个3 5 0 左右的片段，在g e n b a n k 中的登录号分别为a y 5 4 9 3 0 6 和a y 5 7 1 7 8 6 ， 同源性比对发现该基因片段与其他作物中已经报道的a p l 同源基因的同源性都在8 0 以上， 特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高，栽培种“香钟1 1 号”达到9 1 而野生种栎叶枇杷 达到9 4 ，推测它们具有相似的功能【7 】。此外还有鞠玉栋等以早钟6 号，为试材，克隆了一条 长5 1 7 b p 枇杷花发育相关的基因e j m a d s i ，该基因属于m a d s - b o x 基因【引。 1 两雨大学硕t 学位论文 枇杷果实中的类胡萝卜素的组成及含量既是决定枇杷果实外观色泽的主要因素，又是衡 量其营养成分。番茄红素1 3 环化酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中处于上游的关键酶，它 催化番茄红素向p 胡萝卜素转化，进而为下游后续的叶黄素( 含氧的类胡萝卜素) 类物质的 合成提供基础。陶俊等根据蔷薇科植物番茄红素1 3 环化酶基因的保守区序列设计了1 对p c r 引物，以枇杷基因组d n a 为模板扩增了一条长约3 1 2 b p 的番茄红素b 环化酶基因片段，该片 段编码1 0 2 个氨基酸，不含内含子，属于开放阅读框的一部分；在g e n b a n k 中进行同源性比对， 结果显示该序列与苹果番茄红素d 环化酶基因同源性为9 7 1 9 1 。 植物r o p 蛋白与低氧、高盐、病虫害、高温等逆境胁迫的研究已取得进展，但r o p 与低 温胁迫的研究还未见报道。金微微博士研究了对低温敏感的“洛阳青”枇杷假j a p o n i c a l i n d l c v l u o y a n g q i n g ) 在不同贮藏温度下果实品质变化和r o p 基因表达模式的关系，以及程序 降温( l o wt e m p e r a t u r ee o n d i t i o n i n g , l t c ) 处理对r o p 基因表达的调控，克隆得到4 个含3 味端 序列的r o p 基因家族成员，名为e j r o p l 1 ( 8 0 8b p ) ，e j r o p l 2 ( 7 5 6b p ) ，e j r o p 2 ( 8 1 8b p ) 和 e 3 i r o p 3 ( 8 8 1b p ) ，系统树分析显示，其中e j r o p 3 属于r o p 蛋白家族的t y p ei i ，而另外属于 t y p ei 。由不同贮藏温度下r o p 基因表达峰型图得出e j r o p i 2 p p r o p l 和p p r o p 2 这三个基 因可能与采后枇杷果实木质化有关，并在其中起着正向协同调控作用。同时得出结果，l t c 处理能减轻枇杷果实冷害，而且能抑制e j r o p l 2 ，p p r o p l 和p p r o p 2 三个基因的表达【1 0 】。 有机酸含量和组分是决定果实风味品质的重要因素之一。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ，p e p c ) 和n a d p m e 在果实有机酸的合成调节中起着非常 重要的作用。谢成字以福建福建主栽品种，低酸的长红3 号和高酸的解放钟为试验材料， 从枇杷果肉中克隆出n a d p m e 和p e p c 基因保守区e d n a 片断，并且与其他物种相关序列 保持着较高的同源性，作者通过n o r t h e r n 杂交分析基因的表达水平，得出品种间成熟果肉苹 果酸含量的差异可能受到n a d l ) _ 小便和p e p c 基因表达水平的调控，同时还可能受转录后和 翻译后等的调控【1 1 1 。杨林通也克隆了低酸的长红3 号和高酸的解放钟枇杷果实发育过程中 果肉相关酶基因的保守区片段，如细胞质型c y n a d - m d h 、细胞质型c y n a d p i d h 、线粒体 型m n a d - m d h 、液泡膜v - a t p a s ea 亚基基因和v - p p a s e 基因，通过比对发现所得到的核苷 酸序列和氨基酸序列与已报道的其他物种上的对应基因有很高的同源性f 1 2 】。 上述枇杷基因的克隆及表达分析结果，对枇杷成花分子机理、枇杷果实类胡萝卜素形成 过程、枇杷抗逆机理以及枇杷有机酸合成机理奠定基础，并为生产实践中缩短枇杷童期、改 进枇杷果实品质、加速枇杷育种进程提供理论依据。 1 1 2 枇杷育性研究概况 枇杷育性研究主要体现在三倍体枇杷的育性研究上。三倍体枇杷品种培育可以实现品种 的无核化育种目标，但是与二倍体相比，三倍体枇杷育性很低，不能形成正常的种子，因此 不能正常结果。为了揭示这一原因，梁国鲁为首的研究团队对其此进行了研究。 2 第一章文献综述 他们认为三倍体枇杷具有一定育性。而且三倍体花粉同二倍体一样，具有具有正常萌发、 生长和完成生殖核分裂的能力1 1 3 】。但是三倍体花粉的萌发率较低，萌发力较弱。以二倍体花 粉为对照，对7 个品种3 4 个株系的天然三倍体枇杷做离体萌发实验，统计萌发率结果得出二 倍体平均花粉萌发率有8 7 8 4 ，而3 4 个三倍体株系中，只有1 9 个株系花粉能够萌发，平均 萌发率之哟2 4 1 ，且花粉管生长二倍体生长慢4