（蔬菜学专业论文）西瓜愈伤组织分化不定芽体系的建立及耐冷体细胞无性系变异研究.pdf

y1 3 2 9 5 8 5 f t l 码：1 0 3 3 9 研究、 l j ：2 0 2 1 6 0 5 】 浙江大学硕士学位论文 西瓜愈伤组织分化不定芽体系的建立 论文评阅人 答辩委英会士席 答辩委员会成员 及耐冷体细胞无- 性系变异研究 隧：堑盂数擢出迫盘垦 趣逮：随j 椎密受墩必奠业厦一主一 垒煎趣蚕趣篮数i 纽! 丛丝业匠 螨星起筮缝逝江盘鲎 搦! 垣垒煎塾盈逝2 叠纽群差堑纽阻 谢呜 煎整盘逝i 珐嚏堑群受耷当。巨。 隐到聋 型堑煎 逝辽盘垂 酬孑彀扳嘶江六荤 论文咎辩h 期 兰塑堕车目! 生旦 致谢 值此论文完成之际，首先对我的导师张明方教授表示最衰日的感谢r 胸怀宽广，平易近 人，正直、善良的张老师在生活上给予了无微不至的支持、关怀与帮助知识渊博、治学严 谨的张教授在从我的实验选题，设计、实施到我的论文撰写、修改和定稿无不投入了大量的 _ 血张老师三年来苦口婆m 地教我们做人，做事，让我们受益颇深，这也凶将给我今后的 工作和生活带来极大帮助在此我再次对这位恩师表示由衷的感谢和崇高的敬意! 感谢无私博爱的陈利萍副教授在我实验遇到困难时给予指导和鼓励三年来深受蔬菜所 喻景权教授、曹家树教授等各位老师关怀，此时我对这些老师表示诚挚的谢意! 三年来，无论实验上还是生活上都得到诸多同学的关o 、支持在此感谢向庆宁、李志 凌、于天祥、扬景华等师兄和张全美师姐的启迪和帮助；感谢付杰、李春顺、徐春霞、齐晓 花、杨国志，张硕，许智颖、缑艳霞、王艳菊、葛亚明、朱雪云、盂秋风李水凤等同实验 室同学的支持和协作；感谢师恺、孙瑶、陶媛、庄晓英、宰文珊、董德坤、应泉盛、李红斌、 冯壮志等同班同学的关、帮助 还要感谢老同学孟繁花、乔凤云、张艳、张苗、贾纪元、刘同宝和室友王玉清、於雏维 赵晓艳等陪我游遍了杭州美景，伴我度过了开。愉怏的三年校园生活，给我的人生留下了美 好的回忆他们真挚的友情令我终生难忘! 同时感谢父母、弟弟、妹珠无私的付出、支持感谢所有关。我、支持我、鼓励我的亲 朋好友是他们的无私的付出、自始至终的支持、鼓励，使我得以顺利完成学业 最后向参加本论文评阅和答辩工作的专家和对本论文提出宝贵意见的老师、同学表示由 衷的感谢! 闰静 2 0 0 5 年5 月浙江大学 硕十等：镟论文柏瓜愈伤组织分化币定芽体系的建立及痢冷俸细匏无性系变异研究 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s a f l p a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片断长度多态性 6 b a b e n z y l a a s e n i n e 6 - 苄基嘌呤 b pb a s e p a i r 碱基对 d e g r e ec e l s i u s 摄氏度 d d a y 天 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t c 焦炭酸二乙酯 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e be t h i d i u mb r o m i d e澳乙锭 e d t a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d 乙二氨四乙酸 g u s b g l u c u r o n i d a s e b 一葡萄糖营酸酶 hh o u r小时 i a ai n d o l e 3 a c e t i c a c i d e 酵l 哚乙酸 k bk i l o b a s e千碱基对 k t k i n e t i n 激动素 m i nm i n u t e s分钟 r a p dr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a s随机扩增多态性d n a r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性酶切片断多态性 r n ar i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 n a a n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d 禁乙酸 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r t - p c rr e v e r s et r a n s f o r m a t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反向聚合酶链式反应 r n a s er i b o n u c l e a s e s核糖核酸酶 ss e c o n d秒 t d zt h i d i a z u r o n 噻二唑苯基脲 uu n i t单侍 3 硕、：呼犄论艾柏f l ：l 愈移组织分化不定芽体系的建立及耐冷体细缒无性系变异研究 中文摘要 柏瓜属葫芦科作物，原产热带l t i t 。因此确瓜耐热性平耐早性强，但耐冷性弱，而且缺 乏耐冷种质资源。曲瓜栽培的地域广泛，但季节性限制人。通过低温诱导结台体细胞无性系 变异对西瓜进行以提高耐冷性为目标的遗传性状改良研究显得尤其重要。 前人的研究大多通过巍瓜茎尖培养、原生质体培养、体细胞杂交、基因导入和诱导体细 胞无性系变异等生物技术途径来改良西瓜现有的品种或创造新种质，而且在西瓜作物上生物 技术的应j = ；i 途径也在不断拓宽。但是西瓜体细胞无性系变异方面的研究还局限在直接再生获 得无性系变异上。若能建立西瓜间接再生实验体系，西瓜体细胞无性系变异频率会大大提高， 从中筛选有用变异的机会也会增加。已有研究表明离体的植物器官和植物体一样，在低温处 理的情况下同样能够产生相应的反应，比如启动相关基因表达诱导一些与冷害有关的热激 蛋白出现，细胞内不饱和脂肪酸提高等一系列适应反应。 本研究建立了西瓜离体培养不定芽间接再生实验体系，并对离体诱导磷瓜耐冷体细胞无 性系变异进行了初步研究。总体上可分为三部分： 第一部分建立了西瓜间接再生实验体系。确定了珏瓜愈伤组织诱导和不定芽分化的最佳 培养基和最佳培养条件，解决了西瓜间接再生无法实现的问题，为诱导西瓜体细胞无性系变 异、基因转化、细胞培养等方面的研究提供有用的参考数据，从而能够实现通过各种方式、 多种途径对西瓜进行遗传改良的目的。我们比较黑暗和光照两种培养条件和各种不同激素组 合的1 8 种诱导愈协培养基和1 2 种不定芽分化培养基，结果表明黑暗条件一i - - 比较容易诱导出 高质量的茜瓜愈伤组织，m s + 1 0m g un a a + 2 0m g lb a + i 0m g n k t 培养基是诱导伊选类 型愈伤组织的晟佳培养基，而m s + i 0m e n n a a + 0 ，5m g lb a + 2 0m g ，lk t 培养基最适合h j 来诱导京欣类犁愈伤组织。两类两瓜愈伤组织均在m s + o 1 0m e n - a a + 2 0m g lb a + 2 0m g l k t 培养基中达士4 是高不定芽分化频率。 第二部分进行了离体条件f 诱导对西瓜耐冷性无性系变异的初步研究。通过离体培养过 程中施加低温胁迫，观察、分析低温条件f 的脱分化、分化情况，进而希望筛选山相对耐低 温的西瓜体细胞无性系变异的并生植株。研究结果显示，无论是直接再生还是间接再生，5 0 c 、1 2d 低温处理基本上选到| 致死程度( 直接再生频率和愈伤诱导频率均降剑5 0 左右) 处理条仆。 最后本研究对筛选的耐低温植株进行耐冷性评价，从分f 水平上通过r t p c r 实验来对 4 颐七鼍：镝论艾曲m 愈伤缎织分化不定芽体襄的建立及耐冷体细胞无性系变异研究 低温处理斤再生的植株羽l 对照植株进行分子鉴定。r t p c r 结果显示，外植体经过低温处理后 再生的植株( 包括直接再生和间接再生植株) 经受冷害t l 亓d r e b l 基因表达明显增强，而对照 植株( 外植体未经低温处理直接再生的植株) 的d r e b l 基因表达没有增强，或者增强不明显， 说明低温诱导结合体细胞无性系变异可以增强再生植株与耐冷性相关基因d r e b 的表达。这些 耐低温候选植株的遗传稳定性有待进一步鉴定。 关键词：两瓜，生物技术，体细胞无性系变异，愈伤组织诱导，不定芽分化，间接再生体系， 低温处理，耐冷性，r t - p c r 硕 碍：镝论艾柏m 愈伤缎织分化不定芽体系的建立及耐冷体细缒无性系变异讲究 e s t a b l i s h m e n to fi n d i r e c tr e g e n e r a t i o ns y s t e mi nv i t r oa n d i n d u c t i o no fs o m a c l o n a lv a r i a t i o nf o re n h a n c e dc o l d t o l e r a n c ei nw a t e r m e l o n ( c i t r u l l u sl a n a t u s ) a b s t r a c t w a t e r m e l o n ( c i t r u l l u sl a n a t u s ) o r i g i n a t e sf r o ma f r i c a ，a n da r eh o ta n dd r a u g h tt o l e r a n t h o w e v e r , w a t e r m e l o ni ss e n s i t i v et oc o l ds t r e s sa n di sd e v o i do ft h eg e r m p l a s mt h a ti st o l e r a n tt o c o l d w a t e r m e l o nc a l lb e 唔r o w na l m o s ta l lo v e rt h ew o r l d ，b u ti t sg r o w i n gl a r g e l yl i m i t e ds e a s o n a l l y t h e r e f o r e ，i ti su r g e n tn e e dt oi m p r o v ew a t e r m e l o ne c o n o m i c a l l yi m p o r t a n tt r a i t sb yu s i n g b i o t e c h n o l o g y m o r ea n dm o r ew a t e r m e l o nr e s e a r c h e r sb e g i nt oi m p r o v ew a t e r m e l o ng e r m p l a s mb y b i o t e c h n o l o g y , s u c h a sm e r i s t e m c u l t u r e ，p r o t o p l a s tc u l t u r e ，s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ，g e n e t r a n s f o r m a t i o na n ds o m a c l o n a lv a r i a t i o n c u r r e n t l ys o m a c l o n a lv a r i a t i o ni s s t i l lt h r o u g hd i r e c t r e g e n e r a t i o ns y s t e m 1 fa ni n d i r e c tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fw a t e r m e l o ni se s t a b l i s h e d ，t h ef r e q u e n c y o fs o m a c l o n a lv a r i a t i o nc o u l db ei m p r o v e d ，a n dt h ec h a n c eo fo b t a i n i n gu s e f u lv a r i a t i o nw i l lb e j n c r e a s e d i th a sb e e ni n d i c a t e db ye x p e r i m e n t st h a tp l a n to r g a n so rt i s s u e su s e d 加v i t r oc u l t u r ew i l l r e a c tl i k ei n t a c tp l a n t sb yi n d u c i n gc o r r e l a t i v eg e n e se x p r e s s i o n i nt h i ss t u d y , w eh a v ee s t a b l i s h e dt h ei n d i r e c tr e g e n e r a t i o ns y s t e mf o rw a t e r m e l o nb yw h i c h c a n d i d a t ep l a n t sc o l do ft o l e r a n c ew e r eo b t a i n e db ya p p l y i n gc o l ds t r e s sd u r i n gs o m a c l o n a l v a r i a t i o n f i r s t l y , i tf o c u s e do ne s t a b l i s h m e n to fi n d i r e c tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fw a t e r m e l o n t h eb e s t m e d i aa n dt h ep r o p e rc o n d i t i o n sf o rb o t hc a l l u si n d u c t i o na n da d v e n t i t i o u ss h o o td i f f e r e n t i a t i o n h a v eb e e nd e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eq u a l i t yo f w a t e r m e l o nc a l l u s e si n d u c e di nd a r ki s m u c hb e t t e rt h a nt h o s ei n d u c e di nl i g h tc o n d i t i o n a m o n gt h ei8m e d i au s e df o rw a t e r m e l o nc a l l u s i n d u c t i o n ，m s + 10m ln a a + 2 0m i b a + 1 0m e - lk ta n dm s + l ，0m ln a a + 0 5m g ，l b a + 2 0m g ，lk ta r et h em o s ta p p r o p r i a t em e d i af o r y i x u a n a n d j i n g x i n r e s p e c t i v e l y h o w e v e r 6 硕t 等：谛论艾柏砥龟纺龋织分化不定芽体系豹建立及耐玲俸细雅无性系变异研挖 a m o n g1 2m e d i a t m s + o 1 0m g li a a + 2 0m lb a + 2 0m lk t i st h eb e s tf o ra d v e n t i t i o u s s h o o t sr e g e n e r a t i o nf r o mf u l l yd e d i f f e r e n t i a t e dc a l l u s e s b o t hf o r 。y i x u a n a n d 。j i n g x i n ，t w ot y p e s o f w a t e r m e l o n s e c o n d l yt h i sp a p e ri sf o c u s e do nt h ei n d u c t i o no fw a t e r m e l o ns o m a c l o n a lv a r i a t i o nt h a ti so f e n h a n c e dc o l dt o l e r a n c eb ya p p l y i n gc o l ds t r e s sd u r i n gi nv i t r oc u l t u r e t h er e s u l t si n d i c a t et h a t e x p l a n t st r e a t e da t5 。cf o r1 2d a y si st h ep r o p e rc o n d i t i o nt h a tm a k e st h ef r e q u e n c i e so fc a l l u s i n d u c t i o no rd i r e c ta d v e n t i t i o u ss h o o tr e g e n e r a t i o nb es e ta ta b o u t5 0 ，c a l l e dh a l f l i n g sd e a d l y l a s t l y , t h er e s u l t so fc o l dt o l e r a n c ei d e n t i f i c a t i o nt h r o u g hr t - p c ri n d i c a t et h a t , p l a n t l e t s r e g e n e r a t i o na f t e rc o l ds t r e s sh a v et h ed r e b l g e n ee x p r e s s i o nb ee n h a n c e di n t e n s i v e l yi np l a n t s e i t h e rd i r e c t l yo ri n d i r e c t l ys y s t e mf r o me x p l a n t st h a th a de n d u r e dc o l dt r e a t i n g h o w e v e r , t h eg e n e i nc o n t r o lm a t e r i a lw a sn o tb e e ne n h a n c e da f t e rt h es a m el o wt e m p e r a t u r et r e a t i n g , o rt h e e n h a n c e m e n ti sn o tv i s i b l e t h ec a n d i d a t ep l a n t sf o rc o l dt o l e r a n c en e e dt ob et e s t e do nt h e i rg e n e t i c s t a b i l i t y k e yw o r d s ：w a t e r m e l o n ，b i o t e c h n o l o g y , s o m a c l o n a lv a r i a t i o n ，c a l l u si n d u c t i o n ，a d v e n t i t i o u s s h o o td i f f e r e n t i a t i o n ，i n d i r e c tr e g e n e r a t i o ns y s t e m ，c o l dt r e a t i n g , c o l dt o l e r a n c e ，r t - p c r 7 娘乇 f 论文 内瓜愈伤组织分化不定茅体系的建。茁及耐冷体缨匏无性襄变异硼究 1前言 硝瓜( c i t r u l h t sl t z n a t u s ) 属葫芦科，原产热带非洲，耐热性和耐旱性强，但耐冷眭弱， 而且缺乏耐冷种质资源。前瓜栽培的地域广泛，儿乎遍及世界各地，居世界十人水果的第五 位。 西瓜作为一种重要的经济作物，其果实汁多味甜，营养丰富，是盛夏季节消暑、解渴的 佳品。据医学资料记载，两瓜还具有清热解暑，生津利尿的功效。凡中暑、内热、心烦口渴 及喉痹、小便短赤等，皆可将其作为食疗用品：西瓜籽仁，可治疗肺热咳嗽、咯血、疲多等 多种疾病，效果也十分明显：艇瓜皮可治疗暑热尿少、黄疽、水肿、舌疮等。在传统种植、 销售和消费西瓜的基础上，近年来相继出现了无籽职瓜、微型西瓜、印字或印圈西瓜、方形 西瓜等，它们在品质、形状、外观、成熟期等方面都有较大的改进，因此深受人们喜爱，一 上市就十分走俏。在崇尚同归自然的今天，使用天然植物化妆品当为首选。美容西瓜根快受 到一些消费者的青睐，将有很人的市场潜力。以色列最近培育出了一种西瓜，其含糖量比普 通西瓜丈幅减少，单位重量所含的热量比普通西瓜要少2 0 - - 4 0 。因此，被认为是一种非 常好的减肥西瓜。 由于具有上述优点，两瓜不仅深受广大生产者、经营者和消费者欢迎，也受到了很多育 种家、研究者的重视。目前西瓜研究主要集中在病虫害防治，无公害栽培，冷藏保鲜和品质 育种。抗病、抗逆育种等方面。西瓜的种植、加工和储藏等工作都必须以优良品种为前提。 如果不能经常提供优良新品种、专刑品种供栽培，其产品很难受到消费者的欢迎，也不会有 市场竞争力，囡此也不会得到生产经营者的重视。从l ：l 前形势和研究热点来看，荫瓜种质资 源创新研究显得尤为重要。特别是在中国这样一个荫瓜生产消费大国，话瓜品种选育和创新 显得尤为重要。 1 1 生物技术在西瓜遗传改良上的应用 随着生物技术、细胞生物学年| 1 分子生物学簿学科的不断发展，曲瓜育种途径也得到了拓 宽。目前除了传统杂交选育矾瓜优良品种以外现代的研究者人多通过曲瓜莩尖培养、原生 质体培养、体细胞杂交( 林伯年，1 9 9 4 ) 、基闪转化( t - 大祥张明方2 0 0 3 ) 和l 诱导体细胞 无性系突变( 马国斌等，2 0 0 3 ) 等生物技术途径来改良曲瓜现有的鼎种或创造曲瓜新种质。 这儿种途行共同的特点是一般需要对村瓜进行离体培养( 细胞、组织歧器官土矗养) 。获得培养 8 陬 哗辅瓷艾“7 l 愈移j 组织分化币定芽体系桷建立及耐冷体镪瞻无性系变异研究 材料后，往往需要通过细胞生物学羽1 分子生物学实验进行遗传分析，希望筛选到期望的州瓜 新种质。f 面对上述儿种途径分别介纠一f 。 1 1 1 西瓜组织培养研究 1 - 1 1 1 组织培养研究进展 自从a n d m s 等( 1 9 7 1 ) 刚无耔西瓜f 胚轴进行培养、诱导形成芽丛，建立了砥瓜的无 性系。以后分别采用西瓜顶芽、子叶等进行培养研究，获得了一定的进展，持别是利用项芽 进行无籽西瓜苗的快速繁殖研究进展较快取得了良好效果。近年来西瓜离体培养技术已经 被广泛用于快速繁殖、遗传改良和诱导变异等方面。但是，由于西瓜再生能力比较弱。不易 通过愈伤组织途径获得再生植株。而鉴于通过愈伤组织再生植株的一些优点，研究者们还在 不断探索西瓜愈伤组织诱导和问接植株再生。 1 1 1 2 组织培养与三倍体无籽西瓜 三倍体无籽西瓜长势旺盛、结果力强、产量高而稳定，耐湿抗病，根系深生，吸肥力和 耐早力较强，果皮较坚韧，不易破裂，瓤肉不易变质，耐贮运，颜色均匀且较浓，糖度高 方便儿童和病人食用，因此具有较好的发展前景。但其种子外壳厚硬，发芽困难，发芽率和 成苗率较低，而且制种繁琐，种子价格昂贵，在一定程度上制约着它的发展。应用组培快繁 技术进行组培苗工厂化规模生产将降低无籽西瓜的瓜苗成本。二倍体无籽西瓜母本的获得也 往往通过离体诱导四倍体的途径来实现。因为染色体自然加倍的频率报低，要想获得四倍体 西瓜来作为三倍体西瓜良种的母本，需要通过化学、物理方法来诱导四倍体。化学物理方法 诱导整个植株突变，往往出现嵌合体，而通过离体培养对两瓜组织或细胞进行诱变能夫人降 低再生植株的嵌台体比例；因此，曲瓜组织培养对三倍体无籽两瓜生产非常重要。 1 i 1 3 西瓜组织培养与遗传资源创新 婀瓜遗传基础十分狭窄，野生种及近缘物种的相天收集整理 ：作较少。扩人变异来源， 二# 富选择的遗传基础，是当前植物育种获得较大进展的天键。通过常规育种方法对品种进行 更新较为凼难而利 通过离体培养可以对西瓜进行快速繁碴、基冈改良、诱导变异，丰富 9 颚鼍：帑论爻曲蹑龟伤组织分化币定贯体系的建立疑硪冷体镪匏无性不变异研究 供选择的遗传基础，从而更盘j 的满足种植_ 手i i m 费的需求。 1 1 2 西瓜等作物原生质体培养和体细胞杂交方面的研究 植物原生质体培养( p l a n tp r o t o p l a s tc u l t u r e ) 就是将去掉细胞壁的植物细胞接种到特定培 养基进行脱分化形成愈伤组织，进而在分化出植株的过程。原生质体培养过程中可能会发生 细胞突变，从而能够达到对植物遗传改良的目的。由丁单独的原生质体培养产生变异的频率 比较低而且变异的方向性不明确，所以往往在原生质体培养的基础上进行体细胞杂交研究， 以便改良优良品种的个别不良性状，综合多个亲本的优良特征。 体细胞杂交( s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) 即原生质体融合( p r o t o p l a s tf u s i o n ) ，是生物技术中重 要的领域之一，在植物种质资源创新和品种改晓中发挥了独特的作用，并获得了一些新种质。 它是指双亲的原生质体( 可以是种间、属间、甚至科问) 在特定的物理或化学因素作用下诱 导融合成杂种细胞( 核质杂种或胞质杂种) ，通过细胞分裂形成愈伤组织，并分化和再生出植 株。这项技术是建立在原生质体培养基础上，主要包括：原生质体分离、体细胞杂交、融合产 物的培养和杂种的鉴定等技术环节。作为传统育种的辅助手段，体细胞杂交不仅可以克服有 性杂交的不亲和性、不育性，还能够快速组合蔬菜作物的一些优良农艺性状，或者将野生种 的个别有_ ! i 性状引入蔬菜栽培种。与有性杂交相比，应用该技术可以获得有性杂交难于获得 的远缘杂种。当用二倍体植物做亲本进行体细胞杂交时，没有减数分裂，等位基因不进行独 立分离，因此，它能够保持亲本原有的杂合性。另外，体细胞杂交明显优于有性杂交的是， 它可以对细胞质进行遗传操作，引起线粒体、叶绿体等细胞器基因组的重组。由此可见，体 细胞杂交创造变异的潜力很大，能够丰富种质资源，保持和促进生物多样性。 体细胞杂交在植物新遗传变异的创造，细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y ，c m s ) 性状的转移创造和机理研究，抗病、抗虫、抗逆育种等方面具有其独特的优势。郭得章等( 2 0 0 3 ) 已经建立了黄瓜原生质体培养及植株再生实验体系，如果能够通过体细胞杂交技术对确瓜进 行遗传改良，提高西瓜的耐冷、抗病能力，改善西瓜的品质不再是梦想。因为常常做西瓜嫁 接砧术的葫芦具有根强的抗病能力，而且比西瓜耐冷。前阶段我 f j 也对两瓜体细胞杂交进行 了初步研究，其他研究者也曾经试探过曲瓜体细胞杂交研究但是目前为l t ，还没有良好的两 瓜间接再生实验体系两瓜原生质体或杂种细胞脱分化形成愈伤组织以及再分化很困难。因 此，要想实现通过体细胞杂交改良曲瓜遗传性状，首先需要解决曲瓜的问接再生问题，建立 高频有效的曲瓜间接再生实验体系。这也止是本瀑题研究的部分。 0 颀十专。博论艾 阳胍愈伤级织分化不定芽体系盼建、z 及耐冷体细礁无性系变异研究 1 1 3 西瓜转基因技术研究和应用 通过有效的方法将外源基阅导人植株是转基因技术的关键。葫芦科作物的子叫外植体具 有高效的转化再生频率，j “泛h 转基因再生体系。目前葫芦科作物转基因研究主要集中在， 抗病，耐逆境，延熟，品质等方面的品种改良研究。 葫芦科作物病毒病是世界性的病害。凡种植地区几乎都有发生，严重影响了葫芦科作物 的产颦和品质。常见病害有黄瓜花叶病毒，西瓜花叶病毒，南瓜花叶病毒，两葫芦花叫病毒 等。传统的育种方式对抗病基因的筛选监测非常困难，同时通过常规育种育成的抗病品种， 根据基因对基因假说，病毒又要不断分化出新的株系，要不断育出新的品种增加对病毒的抗 性；并且常规育种周期长，难度大，获得的性状不易稳定。通过基因工程育种创造新种质为 这些问题的解决提供了一条新的途径，成为葫芦科作物品种改良的前沿生物技术。目前，人 们己将许多种来自病毒本身的基因导入植物，获得了抗病毒的工程植物。如外壳蛋白( c p ) 基 因，病毒r n a 基因和病毒核酸等。另外，西瓜枯萎病是由尖抱镶刀菌西瓜专化型引起的土传 毁灭性病害，世界各地均有发生。而瓠瓜适应性广，对硒瓜枯萎病免疫。将瓢瓜的d n a 导 入两瓜，有可能获得高抗两瓜枯萎病或具特异性状的新材料( 于天祥，张明方2 0 0 3 ) 。 以两瓜、黄瓜等瓜类为主的葫芦科作物需要解决的另一问题是急需提高其耐冷等方面的 能力。细胞膜是冷冻伤害的原初部位，而冷冻低温引起的氧自由基积累引发膜脂过氧化是导 致细胞膜伤害的主要原因，植物本身也有分解氧自由基的解毒体系航氧化酶系统，因而 植物抗冻力与其对氧自由基的清除力密切相关旧。已经有人通过基因枪法将抗坏血酸氧化酶 基因导人黄瓜，g u s 监测结果显示抗坏血酸氧化酶基因导人黄瓜，转化黄瓜植株抗寒能力显 著增强。 近年来转基冈技术越来越r 泛、深入的应用到鹾瓜等葫芦科作物遗传改良研究中。但是 植物转基因的发展还受技术、观念等方面的限制。一方面，由于植物转基冈往往以植物离体 培养为基础，一些植物的转基囡研究受离体培养的限制。另一方面，转基冈植物的安全性问 题已成为国f 1 4 外关注的热点，转基因食品还不能为人们广泛接受。所以目前来看，曲瓜辞作 物转基因研究成果转化成生产力尚存在观念上等方面的障碍。 1 2 体细胞无性系变异育种 体细胞无性系( s o m a c t o n e ) 是指从个村1 尢通过无性繁殖方式，产生出贝有0 其 i i 先相同遗 i 诞、：孳t 论文柏瓜愈伤缎织分纯不定芽髂系建立发耐玲体细袍无性系交舁研究 传性状的后代群体。人们发现，在植物组织培养过样中，从离体的植物组织政体细胞产t 的无 性系，常常会出现各种变异，即体细胞无性系变异( s o m a c l o n a lv a r i a t i o n ) 。许多研究表明，体 细胞无性系变异是植物组织培养过程中出现的普遍现象，不限于某些植物，也不限于某些器官， 变异所涉及的性状也相当j 泛。迄今为i t ，己在2 9 种植物中观察到体细胞无性系变异。这些变 异包括：外部形态、育性、生k ：势、抗性、次生代谢、染色体数目和d n a 结构等各个方面。 这些变异，有些是不能遗传的生理变异，有些则是属于遗传性的变异。这些可遗传的变异经人 工选择和培育，能获得既具有亲本原来的优良性状，义带来某一些新性状的新品种这就是植 物体细胞无性系变异育种。体细胞无性系变异是继花粉和花药培养之后的又一种实用化的细胞 一口呈育种新方法，在再生植株中能够找到在常规诱变育种和杂交育种中所观察到的各种变异或 重组类型。通过诱导愈伤组织然后再生植株，高等植物的各种类型的变异频率会大大提高。 1 2 1 体细胞无性系变异育种的特点 利用无性系变异进行植物品种改良具有下述特点：一是它可以在保持优良品种特性不变 的情况下改进个别农艺性状：二是它与辐射诱变相结合可成为高敏细胞诱变育种方法，提高 植物品种改良的效率：三是体细胞无性系变异遗传稳定、后代稳定，育种年限短；四是可通 过在培养基中加入一定的选择压力而筛选到特定的突变体：五是因其存在细胞质突变，因此 有可能选择到新的细胞质雄性不育系等方面的细胞质基因突变体。 金润洲，王景余等( 1 9 9 6 ) 认为，植物体细胞无性系变异由于具有变异频率高、幅度大、 稳定快等优点，越来越受到育种家的重视。除有性杂交和辐射及化学药品之外，此项技术是 植物育种中诱发遗传变异的第三种手段。由于体细胞无性系变异是离体细胞在组织培养过程 中产生的，因而对丁= 这类变异的选择既可在无性系后代群体中进行，也可在离体细胞的组织 培养过程中进行。在培养过程中增加适当的胁迫条件，对突变的细胞可进行定向选择，使植 物育种操作微型化，在细胞水平上实验室内进行选择，人大节省人力、物力及时间，提高育 种效率。因此，体细胞无性系变异能够丰富植物育种需要的遗传资源。 1 2 2 利用体细胞无性系变异育种的潜在要求 一个理想的体细胞无性系选择技术应该满足v u j l 点：在预定的选择条什f ，能选出具 有日标抗性的突变细胞或者愈舒j 组织；这种抗性在继代培养中麻保持稳定：这些被选择细胞 和愈伤细纵必须具有再生植抹的能力；目标的抗性能够在再生的无性系中表达，并稳定遗传 1 2 坝 ：鼍：镣论文 柏瓜愈伤龋织努他不定芽体系建立发耐冷俸细匏无性系变异研究 给无性系的后代；抗性突变体除具有目标突变性状外，麻保留原亲本品种的优良性状。可是 在植物各种抗性突变体的筛选中，得剑完全符合上述条件的突变体报难。 1 2 3 体细胞无性系变异的鉴定 分子生物学鉴定已经被j 1 泛应月； 到植物体细胞无性系变异鉴定领域。目前应用最多的分 子标记方法是r a p d 和r h p 和a f l p 等方法。但是，本实验采用低温处理的方法诱导体细 胞变异，鉴定的目标也是与西瓜耐冷性相关的基因表达情况因此，选择有明确目标的分子 鉴定方- - r t - p c r 。这样可以根据相关基因的表达情况从分子水平上对再生楂株的耐冷性变 异进行解释。 1 2 4 体细胞无性系变异育种研究现状 目前已经利用体细胞无性系变异选育出水稻、小麦、大麦等作物的耐冷突变体，并的它 们的耐冷性遗传规律、分子基础进行了研究。马国斌，王呜等对西瓜体细胞无性系变异进行 了初步研究，结果表明：西瓜未成熟子叶和幼苗子叶的再生楂株中存在明显的变异，其中以 四倍体变异最为普通，此外再生植株中还出现无权、浅裂刻叶和扳叶变异类型，且有嵌合变 异现象。他们还对再生植株进行r a p d 分析，结果表明，西瓜再生植株的基因组d n a 在供 试的部分引物上表现出d n a 多态性。但是与西瓜耐冷性有关的体细胞无性系变异研究还 处于起步阶段。因为西瓜再生能力弱，现在还没有良好的闻接再生( 通过愈伤组织再生) 体 系：其耐冷性状的遗传规律也不清楚：以及耐冷性与其它性状的关系等也都不清楚。从西瓜 间接再生体系建立、低温条件下愈伤组织诱导、低温处理后各种再生能力( 直接再生和问接 再生) 的变化等方面入手，研究西瓜体细胞无性系变异以及与两瓜耐冷性相关基阏表达等方 面的问题，是本研究的土要内容。 1 3 植物冷害相关研究 低温或偏低温对植物影响很久特捌是对热带、热带以及起源丁热带、热带的植物 危害更人。植物的耐冷性与其起源有很人关系，但是通过遗传改良或者耐冷驯化筲，植物的 耐冷性可以得纠提高，从而降低或免除低韫造成的危害。 强七一。镛论苴曲瓜愈魏掘织分他不定芽体系的建童硬确冷体掘瞧无性系变异职究 1 3 1 植物耐冷相关基因研究 许多研究表明：低温和干旱、高盐等逆境相似，可以诱导植物许多基因和基因家族的表 达，并在m r n a 、蛋白或者不饱和脂肪酸等各种上水平上表现出来。另一方面，植物抗寒性 是其对低温k 期适应的一种遗传特性，只有一定条件f ( 如低温、短日j 等) 抗寒基因才得以 表达，抗寒性才得以发展为植物抵御寒害的能力即抗寒力。在抗寒基因表达前植物抗寒能 力仅是一种潜能。这就是抗寒植物会受到突然寒潮冻害的原因。而且抗寒基因是一种诱发基 因，只有在特定条件诱导f ，启动抗寒基因表达，进而发展为抗寒力。抗寒力发展过程即为 基因蛋白质( 酶卜栽谢一一生理功能的过程。可见抗寒力的形成是一些非常复杂的生 理生化反应的结果，而且每种酶都是基因的产物。研究还表明，植物的耐寒性是由多基因控 制的数量遗传性状，通过传统育种途径选育出耐冷性良好的作物新品种很难，而且周期很长。 从9 0 年代起c d n a 文库构建、d n a 序列测定、和同源性分析、体外轷录及翻译技术、和r i l l - - o n 转录、扣除杂交法、定位突变以及基因转化等分子生物学手段被r 泛应用于植物冷害研 究。目前为止，不仅从分子水平上对与植物冷害有关的基因、m r n a 、蛋白及其它诱导产物 有了深入研究，还分离出许多对低温敏感和不敏感的突变体，给研究带来很大方便。特别在 模式植物拟南芥的冷害机理研究过程中已经分离得到对低温、干旱等逆境敏感的l o s 5 突变体、 不饱和脂肪酸合成缺陷的f a d 3 - 2 f a d 7 - 2 f a d 8 三联突变体，并对这些突变位点进行了深入研究， 对研究其他植物冷害机理研究有根人启发和帮助。 1 3 。2 植物离体培养与耐冷性提高 已经有实验表明，离体的植物器官和植物体一样，在低温处理的情况下同样能够产生相 应的反应。比如启动相芙基闲表达，诱导一些与冷害有关的热激蛋向出现，细胞内不饱和脂 肪酸提高等一系列适应反应。 金润洲，王景余等( 1 9 9 6 ) 将来白1 1 个基因型的粳稻愈伤组织在1 5 c 下继代培养，每隔 5 大调壳愈伤组织块的直径。从中发现在1 5 c 冷温f ，第1 5 3 0 大的愈伤组织净生长量与供 试基冈型完禳植株的孕穗删耐冷性( 结实指数) 早止相关。其中2 5 大的相关系数最大，达剑 1 显教水平。囡此住1 5 c 冷温p 培养2 5 大后的粳稻愈伤组织净生k 龄可以作为鉴定愈付j 组织耐冷性的形态指标，也可以作为愈伤组织耐冷性的鉴定方法及耐冷愈伤2 r 织的选抒技术。 p i e r r eb e r t i n 嗣lj u l e sb o u h a r m o n lt1 9 9 7 ) 研究表明水稻愈移j 细织低濡处理厉的雨生频率与雨 颐、：昏论文曲瓜憩伤纺织分纯不走矛体系的建立硬耐冷体缬匏无性系变异研究 生柚株往低温条t l ：f 的存活率成高度相关。两瓜同水稻一样，属丁喜温不耐寒型植物。其早 春戡墉受冷害限制很人。冈而研究曲瓜离体培养与提高其耐冷- 陛的芙系，进而提高其耐冷性 显得尤为重要。 1 3 3 西瓜冷害情况 近年来在早春大中棚中进行早熟西瓜栽培的面积越来越人。露地种植西瓜，为提早上市， 也大多采用地膜覆盖，在晚霜来临之前，提早直播或定植。因此在西瓜早春种植时，常会 受到低温的不良影响，其中包括0 c 左右的冻害与偏低温( 小于或等于1 5 c ) 冷害。由于西 瓜原产非洲，属喜温耐热植物，现有抗低温的两瓜种质资源很贫乏。目前为止，还没有品质 优良且耐低温的优良西瓜品种。因此，西瓜早春栽培还必须依靠塑料棚、地膜覆盖等措施， 很浪费人力物力。r p r o w i d e n t i ( 2 0 0 3 ) 认为如果有耐冷西瓜品种可供广泛栽培的话，那么西瓜 陆地栽培不仅可以提前几个周，而且可以避免早春栽培可能遇到冷害带来的巨额经济损失。 虽然西瓜等葫芦科蔬菜受早春冷害危害很人，严重影响其陆地早春栽培，但目前为止 对西瓜等葫芦科植物的冷害研究还停留在通过栽培措施来预防冷害水平上。通过良种选育、 遗传改良等途径来彻底解决西瓜的冷害问题将是一个很有意义的事情。至于分子、基因水平 上对两瓜冷害方面的研究还刚刚起步。深入西瓜冷害研究之所以还处在起步阶段原因主要 有两方面：一方面是对其冷害分子机理不清楚第二方面是缺乏对研究冷害有用的相关突变 体。因此，从离体水平甚至分子水平上研究两瓜冷害问题。匝l 临很人挑战。但是，如果通过 离体培养、低温诱导并筛选出西瓜耐冷突变体，进而找出与西瓜耐冷性相关基因，西瓜耐冷 性研究将有突破性进展解决两瓜早春陆地栽培也将不会成为问题。 1 4 展望 目前，分子生物学、细胞生物学等学科已经取得了高度发展，植物体细胞无性系变异研 究划如虎添翼越来越r 泛地被应j 到各种作物和各种目的的研究中。 白州瓜组织培养诞生以来生物技术在西瓜品种改赶上的应用得到了速发展，并在抗病 育种、晶质育种等方面取得了可喜的成绩。而且，生物技术在曲瓜上的戍川途释也不断拓宽， 已经不再局限在单纯的组织培养快速繁殖方面，而是组织培养与基阅转化、四倍体诱导、体 细胞杂交和l 体细胞无性系突变筛选苫方注相结合，为两瓜品种改良、种质创新做山了很人贡 鼹十2 ：昏瓷芟 曲瓜愈锟掘织分化币定芽体系的建叠及剐冷体细瞻无性系变异磅究 献。现在阿瓜体细胞无性系变异研究还局限在直接雨生获得变异上，若能建立肛瓜间接再生 实验体系，阳瓜体细胞无性系变异频率会人人提高，从中筛选有圳变异的机会也会增加。两 瓜体细胞无性系变异研究虽然还处丁起步阶段，但从其创新种质资源、拓宽变异来源的满力 来看，将越来越受重视。 鉴下硒瓜在经济、生活上的重要性和其受低温危害的严重性，西瓜耐冷性研究越来越受 栽培者窜l 育种专家的重视。仅仅局限在栽培技术和措施上来预防西瓜冷害很费入力物力，从 经济上考虑不是长久之计。为了能够从遗传基础上根本解决矾瓜的冷害问题我们选择