（无机化学专业论文）基于水滑石纳米片的电化学dna传感器的探索研究.pdf

摘要 基于水滑石纳米片的电化学d n a 传感器的探索研究 摘要 在d n a 传感器的研究中，d n a 的固定化是一个关键性问题。通 过改进d n a 的固定化工艺，可以减少d n a 固定步骤及固定过程中 化学试剂的使用，提高d n a 传感器的灵敏度。因此d n a 的固定化 对d n a 传感器的性能及应用有着重大影响。 将钴铝水滑石纳米片引入d n a 传感器中，作为固定d n a 的载 体修饰于电极表面，利用其高比表面积和良好的导电性能，能够简 化d n a 固定方法，增加d n a 固定量，增大d n a 电极电流响应， 降低检测限，提高检测的灵敏度，有利于将d n a 电极发展成微量样 品检测装置。本论文采用水滑石纳米片( l d h n s ) 作为固定d n a 的载 体，制备d n l d h n s 修饰电极，构建电化学d n a 传感器，并研 究其检测性能。论文包括以下内容： 1 、采用l d h n s 作为固定d n a 的载体，在玻碳电极( g c e ) 表面 固定鲱鱼精子d n a ；制成的d n a i ，d h n s g c e 在2 0 m o l l 。1m b 5 0 m m o l l 。啊s h c l 缓冲溶液中进行电化学行为的研究，该电极可以 对缓冲溶液中存在的一定量苯酚进行检测，线性范围为4 2 0 u m 0 1 l 1 ，最低检测限为5n m o l l 一；而d n l d h n s g c e 在缓冲溶 液中有挥发酚类、胺类及无机盐等干扰物存在的时候( 干扰物与苯 酚浓度相等) ，其苯酚的峰电流受影响程度均不超过5 ； i 北京化工大学硕i ：学位论义 d n l d h n s g c e 的重复性和稳定性良好，2 0 次重复测试所得数据 的相对标准偏差为1 2 ，在室温下干态保存，1 个月后电流响应为 初始响应的9 2 ，1 0 个月后为初始响应的5 9 。 2 、采用l d h n s 作为固定d n a 的载体，在氧化铟锡电极( i t o ) 表面固定鲱鱼精子d n a ；通过紫外可见分光光度计检测发现，d n a 牢固地固定在l d h n s 层上，并且结构保持不变；在5 0n n 0 1 l 。 t r i s h c l 缓冲溶液和2 0 斗m o l l 。1m b 5 0m m o l l - 1t r i s h c l 缓冲溶液 中对d n l d h n s i t o 的电化学行为进行研究，发现 d n a l d h n s i t o 电极可以对2 0u m 0 1 l 。1m b 5 0m m 0 1 l 1t r i s h c l 缓冲溶液中存在的一定量苯酚进行检测，线性范围为8 4 8 “m 0 1 l ； 此电极对四甲基氢氧化铵( t m a ) 也有一定响应，响应范围为o 2 0 0 “m 0 1 l 。d n a l d h n s i t 0 利用小分子与d n a 的非共价作用对苯 酚进行测试，利用烷化剂与d n a 的烷化作用对t m a 进行测试。 d n l d h n s i t o 重复测试1 0 次，所得数据的相对标准偏差为 3 6 ，在室温下保存，5 个月后电流响应为初始响应的6 5 。 关键词：生物传感器、电化学、d n a 、水滑石纳米片、苯酚 a b s t r a c t g r o p i n gi n v e s t i g a t i o nf o ran e wt y p e o f e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rb a s e do n l d h n a n o s h e e t s a b s t r a c t i nt h ei n v e s t i g a t i o no fd n a b i o s e n s o r s ，i m m o b i l i z a t i o no fd n ai s ak e y ，s i n c et h ei m p r o v e m e n to fw h i c hc a nd e c r e a s et h es t e p so f i m m o b i l i z a t i o n ， a b a t et h ev a r i e t i e so fc h e m i c a lu s e di nm e i m m o b i l i z a t i o na n dm a k et h ed n ab i o s e n s o r sm o r es e n s i t i v e a st h e r e s u l t ，t h ei m m o b i l i z a t i o no fd n ai sav e 巧i m p o r t a n tf a c t o ro fd n a b i o s e n s o r s p e r f o m a n c ea n d 印p l i c a t i o n s c o - a l l d h n s ，w i t hh i g hs u 渤c ea r e aa n dg o o de l e c t r o c h e m i s t 叫 a b i l i t y ，u s e dt om o d i 矽t h ee l e c t r o d e ，c a nl a 唱e l yi i n p r o v ed n a i m m o b i l i z a t i o n ， e l e c t r i c a l r e s p o n s e s a n dt h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y t h e r e f o r e ，ad n a l d h n sm o d m e de l e c t r o d ea sa ne l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o ru s e dt h em e t h y l e n eb l u e ( m b ) a st h ei n d i c a t o rw a sf i a b r i c a t e d b yi n s t i l l a t i o nd 研n gm e t h o di nt h i st h e s i s i tc o n t a i n st w op a r t s a s f o l l o w s ： 1 t h el d h n sw e r ea p p l i e dt oi m m o b i l i z ed n ao nt h eg l a s s y 北京化t 大学硕i j 学位论文 c a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) c y c l i cv o l t a m m e t uw a su s e dt oc h a r a c t e r i z e t h ee l e c t r o c h e m i c a lp e 墒m a n c eo fd n a l d h n s g c ei n2 0 “m o l l - 1 m b 5 0m m 0 1 l 。1t r i s h c lb u 航rs o l u t i o n d n a l d h n s g c ew a s a p p l i e dt od e t e c tp h e n o lw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni nt h e1 i n e a rr a n g eo f 4 2 0 m o l l 1 ，a n dm ed e t e c tl i m i tw a s5m n o l l 1 i nt h ep r e s e n to f e q u a lc o n c e n t r a t i o n o fi n t e 疵r e n tw i t hp h e n o l ，s u c ha sp h e n o l i c c o m p o u n d ，a n i l i n ea n di n o 玛a n i cs a l t ，t h e i ri n t e r f - e r e n t i a lp e r c e n tw e r ea n b e l o w5 t h er 印r o d u c i b i l i t yo fc vm e a s u r e m e n to fp h e n o lw a s e s t i m a t e dt ob e1 2 o fr e l a t i v es t a l l d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) ，a n dt h e s i g n a lo fc vp e a kc u r r e n tr e m a i n e d9 2 o n em o n t hl a t e r ，a n d5 9 t e n m o n t h sl a t e r 2 l d h n sw e r ea l s oa p p l i e di nt h ei m m o b i l i z a t i o no fd n aa sa m o d i f i e df i l mo ni n d i u mt i no x i d e ( i t o ) e l e c t r o d e 1 j r v - v i sa b s o r b a n c e s p e c t r as h o w e dt h a td n a i m m o b i l i z e df i m l ya n dr e t a i n e di t si n h e r e n t s t r u c t u r ei nt h ef i l m c y c l i cv 0 1 t a 删 1 1 e t 巧w a su s e dt oc h a r a c t e r i z et h e e l e c t r o c h e m i c a lp e r f l o 珊a n c eo fd n l d h n s i t 0i nt h e5 0m m o l l - 1 t r i s h c lb u 仃e rs o l u t i o na n d2 0 肛m 0 1 l 。1m b 5 0m m o l l 1t r i s h c l b u f r e rs o l u t i o n ，a n dd i f l e r e n t i a l p u l s ev o l t a i m e t i y w a su s e dt o c h a r a c t e r i z et h ee l e c t r o c h e m i c a lp e 墒m a n c eo fd n l d h n s i t oi n t h e2 0 肛m o l l 。1 m b 5 0m m o l l 。1t r i s h c lb u f r 趸 s o l u t i o n d n a l d h n s i t ow a sa p p l i e dt od e t e c tp h e n o li nt h e2 0p m o l l 1 m b 一5 0m m 0 1 l 1t r i s h c lb u f r e rs 0 1 u t i o nw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni nt h e i v 北京化丁人学硕i j 学位论文 l i n e a rr a n g eo f8 4 8 “m 0 1 l 。1 ；i tw a sa l s ou s e dt od e t e c tt e t r a m e t h y l a m m o n i u mh y d r o x i d e ( t m a ) w i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f o 一2 0 0 “m o l l d n a l d h n s i t 0u t i l i z e dn o c o v a l e n ta c t i o nb e t w e e n p h e n o la n dd n a t od e t e c tp h e n o l ，a j l da l k y l a t i o nb e t w e e nt m aa n d d n at od e t e c tt m a t h er 印r o d u c i b i l i t yo fd n l d h n s i t ow a s e s t i m a t e dt ob e3 6 o fr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) ，a n dt h e s i g l l a lo fc vp e a kc u 玎e mr e m a i n e d6 5 f i v em o n t h sl a t e r k e y w o r d s ：b i o s e n s o r e l e c t r o c h e m i s t 巧，d n a ，l a y e r e dd o u b l e h y d r o x i d e sn a n o s h e e t s ( l d h n s ) ，p h e n o l l v 符i ) 说明 符号说明 l u p a c d n a d s d n a s s d n a c s d n a a ( a d e l l i n e ) t ( t h y m i n e ) g ( g u a i 】j n e ) c ( c y t o s i i l e ) ( 把e ( 舀a l s s yc a r b o ne l e c t m d e ) g o d l t o ( i n d i u mt i l lo x i d e ) l d h s ( 1 a 司d o u b l eh y d r o x i d e s ) l d h n s ( 1 a y e r 。dd o u b l eh y d r o x i d e sn a n o s h e e t s ) m b m q t ( m a c r o s c o p i cq 口a 1 1 n l i i lt u i l i l e l i n g ) p p o q g s ( q u a n z 百a s ss u b s t r a t e ) r r s d t m a ( t e 仃a m e t h y la m m o i l i 啪b n 如o x i d e ) 国际纯粹和应用化学联合会 多聚脱氧核糖核酸 双链多聚脱氧核糖核酸 单链多聚脱氧核糖核酸 互补单链多聚脱氧核糖核酸 腺嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 胞嘧啶 玻碳电极 葡萄糖氧化酶 氧化铟锡电极 水滑石 水滑石纳米片 亚甲基蓝 宏观量子隧道效应 多酚氧化酶 石英玻璃片 线性度 相对标准偏差 四甲基氢氧化铵 北京化工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：兰查星叠 日期： 塑星置五臼2 衄 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：垒鲞 导师签名：扭塞牟一 日期：垫塞生工日兰麴 日期：一型酶丑兰虽 第一审绪论 1 1 生物传感器概述 1 1 1 生物传感器概述 第一章绪论 传感器是一种装置，用来检测或测量一种物理性质并进行记录、显示或以其 他方式作出响应。传感器可分为三类，即：物理传感器，用来测量距离、质量、 温度、压力等；化学传感器，用化学或物理响应测定化学物质；生物传感器，可 视为一类特殊的化学传感器。其中生物传感器因其优良的性能及广泛的应用在近 几十年来一直是人们研究的重点【l 】。 1 1 1 1 生物传感器的定义及分类 为了规范生物传感器这一领域，2 0 0 0 年来国际纯粹和应用化学联合会 ( i u p a c ) 提出了一个非常严格的生物传感器定义 2 】： 生物传感器应是一个独立、完整的装置，通过利用与换能器保持直接空间接 触的生物识别元件( 生物化学受体) ，提供特殊的定量和半定量分析信息。它有 以下几个基本组成部分：生物识别元件、换能器、放大器和数据处理部分等。如 图1 1 ： 生物 生物传感器( b i o s s o r ) 数据采集 化学环境生物识别元件换能器信号 电子放大器和显示部分 b i o i o 西c a l t l 彻s d u c e re l e c t r i c a l 斗 d a 协a c q u i s i t i o n b i o l0 _ 舒c a le l e c 倒c a j r 。c o 阴i t i o n a m p l i f i e r 鲫dd i s p i a y c h 啪i c a l e 1 咖e n t s i 印a l 图1 1 生物传感器的基本组成部分 f i g 1 一lt h em a k e u po f b i o s s o r 它通过各种物理、化学型换能器捕捉被检测物与生物识别元件之间的反应， 然后将反应的程度用离散或连续的信号表达出来，从而得出被测物的浓度。 生物传感器一般可以从以下三个角度来进行分类：根据传感器输出信号的产 生方式，可分为生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器； 北京化t 人学硕 j 学位论文 根据生物传感器的换能器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型 生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等；根据生物传感器中生物 分子识别元件上的生物分子可分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、基因 传感器、免疫传感器等。 1 1 1 2 生物传感器的发展 一般人们认为第一个生物传感器是由c l a r k 和l y o n s 于1 9 6 2 制作的葡萄糖传 感器。术语“生物传感器”就来自于他们以及g u i l b a u l t 等人的研究工作【3 】。从那 以后，带有生物分子识别元件的各式传感器迅速发展起来，这些传感器被统称为 生物传感器，可以对化学或生物化学物质的浓度产生信号函数 4 】。 与传统的分析方法相比，生物传感器这种新的检测手段具有如下的优点：( 1 ) 生物传感器是以生物活性物质( 生物分子) 为识别元件构成的检测装置，一般不 需要样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不 需加入其他试剂；( 2 ) 它的体积小、响应快、样品用量少，且由于生物识别元件 是固定化的，可以反复多次使用，因此可以实现连续在线检测；( 3 ) 传感器连同 测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。 生物传感器在环境检测、食品分析、生物医学和军事上都有重要的价值，但 是由于生物识别元件由生物分子构成，而生物分子具有不稳定性和易变性，因此 在生物传感器实用化过程中还存在着不少问题，而解决这些问题、提高生物传感 器性能是很多研究者关注的重点。 1 1 2d n a 传感器概述 1 1 2 1d 眦简介 脱氧核糖核酸是遗传信息的承担者，具有储存和传递信息的功能，是绝大多 数生物体的遗传信息的载体，其复制是遗传的分子基础。d n a 即多聚脱氧核糖 核酸，其组成如图1 2 ，是由脱氧核糖( 戊糖) 、碱基和磷酸三部分组成的。其中 组成d n a 的碱基有四种：腺嘌呤( a ) 、胸腺嘧啶( t ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) ，并 且a 与t 等量，c 与g 等量。d n a 的碱基组成具有物种的特异性，即不同物种 的d n a 具有不同的独特的碱基组成 5 。 北京化t 人学顺i ：学位论文 图l - 2d n a 的组成 f 吨1 - 2t h ec o m p o n e n to fd n a ( a d 翎诬壕 ) _ 脚峨a ( c 蚋嘴i 鸭c ) m 声动o ，d d n a 的结构分为一级结构和空间结构，一级结构是核苷酸通过3 ，5 磷酸二 酯键连接成没有支链的直线形或环形；空间结构可分为二级结构和三级结构。 1 9 5 3 年3 月，w a t s o n 和c 五c k 提出了d n a 双螺旋模型的二级结构 6 】，即d n a 分子由两条脱氧核糖核酸链组成，链的内侧是碱基，两条链以反平行方向盘绕同 一条轴形成右旋的双螺旋结构，两条链上的碱基是匹配的，称为碱基互补，腺嘌 呤和胸腺嘧啶以两个氢键连接，鸟嘌呤与胞嘧啶以三个氢键连接；而在二级结构 的基础上，d n a 分子还可以扭曲或卷曲形成超螺旋三级结构。 1 1 2 2 渊 传感器简介 d n a 传感器，是将作为生物识别元件的寡核苷酸、单链d n a ( s s d n a ) 或双 链d n a ( d s d n a ) 固定在换能器上，然后将其与互补d n a ( c s d n a ) 、药物、化合 物、自由基等相互作用的生物学信号转变为电、光、声等信号而进行检测的器件。 分子生物学和基因工程的迅速发展为人类基因的研究提供了大量信息，为遗传疾 病的检验和诊断带来了革命性的变革。而d n a 传感器与传统的标记基因技术方 法相比，具有快速、灵敏、操作简便、无污染的优点，在基因序列检测、突变检 测、病源检测和对疾病的早期诊断及治疗中起着重要的作用，在药物筛选、临床 医学、法学鉴定、环境监测等方面也被广泛应用，已成为当今生物传感器领域中 的前沿性课题。 北京化r t 人学硕i ：学位论文 1 1 2 3d n a 传感器的工作原理 d n a 传感器和其它的生物传感器一样，其基本组成包含有两部分，即分子 识别元件( d n a ) 和换能器。识别元件主要用来感知样品中是否含有或含有多少待 测物质，换能器则将识别元件感知的信号转化为可以观察记录的信号( 如电流大 小、频率变化、荧光强度和吸光强度等) 。在待测物、识别元件以及换能器之间 由一些生物、化学、生化作用或物理作用彼此联系。其工作原理是将作为生物识 别元件的寡核苷酸、s s d n a 或d s d n a 固定在换能器上，然后将被检测的寡核 苷酸、d n a 片段、c s d n a 与s s d n a 的相互作用，及药物、化合物、自由基等 与d s d n a 的相互作用所产生的生物学信号转变为离散或连续的信号，再通过这 些信号进行检测 7 。 1 1 2 4d 传感器的分类 d n a 传感器根据传感器识别模型的不同，可分为s s d n a 传感器，即利用 固定化s s d n a 探针，在碱基配对原则基础上进行分子识别检测，通过分子杂交 反应，直接或间接产生的信号变化检测目的基因；d s d n a 传感器，即固定化 d s d n a ，利用d s d n a 与其他分子或离子间的相互作用产生的信号进行检测。 按照换能器的不同，d n a 生物传感器可分为三类： ( 1 ) 第一类是采用质量敏感性换能器的d n a 传感器，称d n a 压电传感器。 压电d n a 传感技术是把电子学、声学及分子生物学等学科结合在一起的新型的 基因检测技术。其理论基础是石英谐振器表面质量的变化与频率的变化成负相关 关系。如果设法在石英谐振器上固定一条s s d n a ，通过d n a 分子杂交，对另 一条含有互补碱基序列的c s d n a 进行识别，结合成d s d n a ，便能构建成压电 式d n a 传感器。该技术方法不需要任何标记，且仪器简单、操作方便 8 1 1 】。 ( 2 ) 第二类是采用光学换能器的d n a 传感器，称d n a 光学传感器 1 2 1 5 。 可采用发光法、椭圆光度法及假布儒斯物角反射法等作为光学检测手段。 ( 3 ) 第三类是采用电化学换能器的d n a 传感器，称d n a 电化学传感器。其 基本原理是：当一条s s d n a 与样品中与之互补的c s d n a 相遇时，两者发生杂 交反应，反应体系的电压、电流或电导等电化学信号会发生变化，通过对电化学 信号的检测可测定样品中d n a 的结构和含量等信息 1 6 】；或者当d s d n a 遇到 药物、化合物、自由基等时发生相互作用而导致体系的电压、电流或电导等信号 发生变化【1 7 】。这是目前研究较多的一类d n a 分析方法。 4 北京化丁人学颤i ：学位论文 1 1 3 电化学州a 传感器概述 1 1 3 1 电化学d n a 传感器简介 电化学d n a 传感器是将作为生物识别元件的寡核苷酸、s s d n a 或d s d n a 固定在电化学换能器上，然后将与c s d n a 、药物、化合物、自由基等相互作用 所产生的生物学信号转变为电化学信号而进行检测的器件。 固定的探针种类不同，其工作原理是不同的： ( 1 ) 固定的探针为寡核苷酸或s s d n a 时，探针由含有十几到上千个核苷酸的 s s d n a 片段组成，包括天然的s s d n a 片段和人工合成的寡核苷酸片段。由于 探针与其互补链c s d n a 杂交的高度序列选择性，使得探针具有极强的分子识别 能力。探针与靶序列杂交后导致换能器表面结构改变，这种杂交前后的差异可以 通过电化学信号的改变来识别，从而达到检测的目的： ( 2 ) 固定的探针为d s d n a 时，探针可为d s d n a 段或整体d s d n a ，该种探 针主要是利用多种小分子与d s e l n a 的非共价作用，使得d s d n a 的结构有所变 化，而这种变化将如实地在电化学信号上反映出来，从而达到检测的目的。 按电化学换能器的不同，电化学d n a 传感器可以大致分为场效应管d n a 传感器和d n a 修饰电极传感器两种： ( 1 ) 场效应管d n a 传感器，是在场效应管的栅区固定一条含有十几到上千个 核苷酸的s s d n a 片段，通过分子杂交对待测c s d n a 进行识别，同时形成 d s d n a ，待测c s d n a 含量通过换能器表达出来。d n a 场效应管传感器把生物 敏感栅的敏感特性和场效应管的场致响应结合起来，其作用机理是分子生物学， 结构形式是膜，表现的现象是电。场效应管在饱和区的阈电压为v 尸v d 2 i d p “2 当c s d n a 与敏感栅作用时，发生电荷转移，导致功函数变化，使阐电压偏移， 其改变量v t ，可用i d 保持恒定时的漏电压表示出来 1 8 】。 ( 2 ) 而一般所指的电化学d n a 传感器是指由d n a 修饰电极制作的传感器， 也是目前文献报道较多，研究较成熟的一种。国外w a n g 和p a l e c e k 等多名学者 就近1 0 年来d n a 传感器方面的文献进行了综述 1 9 2 1 】。国内庞代文 2 2 、高志 贤 2 3 、彭图治 2 4 】、刘盛辉 2 5 】等人也发表了相关的d n a 传感器综述。 根据是否标记电活性物质( 电化学杂交指示剂) ，电化学d n a 传感器可分 为非标记型和标记型两类： 非标记型电化学d n a 传感器是利用d n a 杂交前后本身碱基的电化学信号 ( 如电流、电容、电阻等) 的变化而进行检测的传感器。w a n g 研究了一种无需 指示剂的d n a 传感器，可利用鸟嘌呤易于被氧化的特点，通过这一氧化反应所 北京化_ t 人学倾i ：学位论文 引起的电信号变化，可实现对杂交过程的直接检测 2 6 】。还有其他学者利用电子 长程传递的性质，利用d n a 自身的“分子导线”性质做成无需指示剂的d n a 传感器【2 7 ，但是在电子长程传递的原理上有分歧【2 2 ，2 8 】，且基于此原理的电化 学d n a 传感器的杂交时间较长，因此尚在发展初期。 标记型电化学d n a 传感器是利用具有电化学活性的物质指示d n a 杂交前后 电化学信号的变化而进行检测的传感器。标记型电化学d n a 传感器以其高灵敏 度备受人们关注。 电活性杂交指示剂与d n a 的结合方式主要有以下三种：( 1 ) 静电作用：电活 性杂交指示剂与s s d n a 或d s d n a 带负电荷的磷酸骨架之间因静电力而结合 2 9 】；( 2 ) 嵌插作用：电活性杂交指示剂嵌插入d s d i n a 双螺旋结构中 3 0 ；( 3 ) 沟 渠作用：电活性杂交指示剂与d s d n a 分子扭曲区的小沟结合，由于这种小沟只 存在于d s d n a 分子中，s s d n a 并不具有，因此利用沟渠作用与d s d i n a 结合的电 活性杂交指示剂对d s d n a 有更好的选择性。电活性杂交指示剂主要有金属配合 物和有机化合物，前者主要有c o ( b p y ) 3 3 + 、c 0 0 h e n ) 3 ”、f e ( b p y ) 3 2 + 、f e ( p h e f l ) 3 2 + 等，它们能与d n a 发生嵌插作用以及和磷酸基上的电荷发生静电作用；后者主 要有吖啶橙( a 丽d i n eo r a n g e ) 、吩噻嗪( p h e n o t i a z i n e s ) 、溴化乙锭( a 嘶d i n eo r a n g e ) 、 盐酸阿霉素等，它们能嵌入d n a 的双螺旋结构中。 1 1 3 2 电化学d n a 传感器特点 与常规的核酸检测相比，电化学d n a 传感器有以下特点： ( 1 ) 与荧光方法相比可以不考虑样品的浑浊与否，也不需要激光器和光谱仪 器判读； ( 2 ) 直接利用电信号检测d n a 序列的方法更趋精细和灵敏； ( 3 ) 可以对活体内核酸动态进行检测。目前尚缺乏有效的方法对活体内核酸 直接进行研究，电化学d n a 传感技术为对活体内的核酸代谢转移等动态过程研 究提供了可能； ( 4 ) 袖珍式、电池驱动、价格低廉的电化学d n a 检测仪在诊断行业具有巨大 的发展潜力。 1 1 3 。3 电化学d n a 传感器的应用 电化学d n a 传感器具有很广阔的应用前景。目前，电化学d n a 传感器被 广泛应用于环境检测、临床疾病检验和药物检测及新药开发中。 6 北京化t 人学颂i j 学位论文 随着现代工业的快速发展，环境污染成了全世界面临的重大问题，环境检测 也越发重要。d n a 传感器因为其高选择性和高灵敏度而被应用于环境检测中。 w 锄g 等报道了利用d s d n a 测定胼类化合物的电化学d n a 传感器【31 ，灵敏度 较高，能测定水中1 1 0 母g m l 一的不同肼类化合物。该传感器基于检测d n a 自 身的电极响应在与肼类化合物作用前后的变化实现对肼类化合物的检测，无须指 示剂和标记物。主要利用肼类化合物与d n a 作用后形成的n 甲基鸟嘌呤引起鸟 嘌呤响应峰的减弱的原理，实现了环境中微量肼类污染物的检测。w 抽g 等还利 用d s d n a 与芳香胺之间的键合作用，设计了一种新型亲和电化学生物传感器 3 2 】，对芳香胺类化合物的检测限可以达到n m o l 级。该传感器主要应用于天然 地下水污染的监测。w 撕g 等利用丝网印刷转换器，研制了测定环境中大肠杆菌 序列的电化学d n a 传感器 3 3 】。w a n g 等人将1 9 9 7 年以前关于利用电化学d n a 传感器进行环境污染物检测的文章进行了评述 2 0 】。 传统的细菌感染检测需要利用培养方法来分离与鉴定细菌，但该种方法通常 耗时一到两周，严重延误疾病的治疗，而电化学d n a 传感器可以快速检测细菌 和病毒，并且可以应用于基因诊断。w - 锄g 等在碳糊电极上固定了两个长度分别 为2 7 和3 6 个碱基的d n a 探针，对艾滋病免疫缺陷病毒i 型相关的短d n a 序 列进行了测定，其检出限为4 1 0 母m o l l 1 3 4 】。h a s h i m o t o 等 3 5 】采用一个2 0 聚 体的核苷酸探针修饰金电极，利用h o e c h s t 3 3 2 5 8 为杂交指示剂，通过观察其阳 极峰电流的变化，实现了对p v m 6 2 3 的致癌基因的检测。m i l l a i l 等 3 6 用s s d n a 修饰了碳糊电极，在较高离子强度下与c s d n a 快速杂交，用该传感器测定了1 8 个碱基长度的囊性纤维变性基因序列，得到了令人满意的结果。 在药物分析和新药开发中，电化学d n a 传感器也越来越受到关注。b r e t t 等【3 7 】利用d n a 修饰电极研究一种用于治疗查格斯氏病的药物硝苄咪唑，以期 解决药物毒副作用强等问题。d n a 研究不仅有助于加速新药开发的过程，也有 助于改变新药开发的方式。传统的方法是先分析与某种疾病相关的生理过程，鉴 定药物靶位，然后再筛选能改变这种生理过程的药物。目前人们正逐步应用生物 信息学工具来分析基因序列数据库，以鉴定与某种疾病相关的基因，再通过研究 分子与疾病基因的相互作用来筛选可用于治疗的药物。 1 2 生物传感器在苯酚检测中的应用 1 2 1 苯酚简介 苯酚俗名石炭酸，分子式c 6 h 5 0 h ，比重1 ，0 7 l ，熔点4 2 4 3 ，沸点1 8 2 ， 7 北京化丁人学硕j j 学位论丈 燃点7 9 。无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味。暴露于空气中或同光下会氧 化逐渐变成粉红色至红色，在潮湿空气中，吸湿后，由结晶变成液体。酸性极弱 ( 弱于h 2 c 0 3 ) ，有特臭，有毒，有强腐蚀性。室温下微溶于水，能溶于苯及碱 性溶液，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、甘油等有机溶剂中，难溶于石油醚。 苯酚是重要的化工原料，主要用于制造酚醛树脂，双酚a 及己内酰胺。其 中生产酚醛树脂是其最大用途，占苯酚产量一半以上。此外，有相当数量的苯酚 用于生产卤代酚类。从一氯苯酚到五氯苯酚，它们可用于生产2 ，4 一二氯苯氧乙酸 和2 ，4 ，5 三氯苯氧乙酸等除草剂；五氯苯酚是木材防腐剂；其他卤代酚衍生物可 作为杀螨剂、皮革防腐剂和杀菌剂。由苯酚所制得的烷基苯酚是制备烷基酚甲 醛类聚合物的单体，并可作为抗氧剂、非离子表面活性剂、增塑剂、石油产品添 加剂。苯酚也是很多药品( 如水杨酸、阿司匹林及磺胺药等) 、合成香料、染料 的原料。此外，苯酚的稀水溶液可直接用作防腐剂和消毒剂。 水溶液中的苯酚具有挥发性，易挥发进入大气，造成对水和空气的污染。且 苯酚因为其结构中的苯环为平面共轭结构，可以嵌插入d n a 碱基堆积中，导致 d n a 结构扭曲，在d n a 转录复制时可能引发错误，属于间接致癌物。苯酚与 d n a 的嵌插为非共价结合，是可逆反应，不会对d n a 的组成有所影响，因此其 致癌性比其它与d n a 发生化学反应的致癌剂弱，被归类于弱致癌剂或疑似致癌 剂。尽管如此，如果长期接触苯酚对人体的危害同样严重。苯酚是很多地区污水 中都含的常见污染物，长期使用或饮用含过量苯酚的水会造成苯酚在人体内的大 量积累导致d n a 病变及其他皮肤病变等。因此其浓度的测定对环境检测具有重 要意义。 对于常量苯酚的测定，一般采用普通的化学方法，而微量苯酚的测定则有 4 氨基安替比林萃取光度法、紫外可见分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、 色质联用法等。4 氨基安替比林萃取光度法前处理繁琐，而且需要进行多次蒸馏、 分液、混匀、放置和萃取，并且还需添加多种其他试剂，操作复杂且干扰因素多 3 8 】；而紫外可见分光光度法即是在h c l 溶液中k b r 0 3 与k b r 反应生成b r 2 ， 一部分b r 2 与苯酚发生特征反应，剩余的b r 2 与i 反应生成1 2 ，1 2 的浓度利用紫外 可见分光光度法测定，该方法步骤过多，系统误差较大，且需要添加多种试剂 f 3 9 ；气相色谱法可单独应用于苯酚测试，也可与质谱法联用，比如吹扫捕集气 相色谱质谱联用法 4 0 ，但此法样品预处理步骤过多，整体检测时间长，仪器使 用成本高；液相色谱法一般为高效液相色谱法或高效液相色谱法与其他方法的联 用，比如超声萃取快速高效液相色谱即是用萃取液富集被检测物质再将萃取液 用滤膜过滤后，滤液直接用配置荧光检测器的快速分离柱高效液相色谱进行分 析 3 8 】，与气相色谱法及气质联用法相同，液相色谱法样品预处理步骤多，仪器 北京化t 人学顾i ：学位论文 使用成本高。与4 氨基安替比林萃取光度法相比，利用紫外可见分光光度法、 气相色谱法、液相色谱法、气质联用法等仪器分析方法灵敏度高、检测限低，但 是样品预处理步骤过多，需要昂贵的仪器，且无法携带至野外或现场进行检测。 由于这些限制，研究者丌始大力发展新型的、微型的、便携的传感器式测量仪器。 1 2 2 生物传感器在苯酚检测中的应用 由于常用的苯酚检测手段需要昂贵的仪器，且无法携带至野外或现场进行检 测，研究者又开始大力发展新型的、微型的、便携的传感器式测量仪器，因此， 电化学测试技术开始逐步兴起，由最初的库仑滴定法、溶出伏安法发展至现在的 电化学生物传感器。 随着对酶等生物活性大分子的研究深入，利用酶构建的电化学生物传感器的 研究工作首先得到发展，许多酶分子都被尝试用于制备生物传感器，其中酪氨酸 酶、多酚氧化酶( p p o ) 、儿茶酚氧化酶、虫漆酶、胆碱酯酶可以氧化苯酚，而酪 氨酸酶对苯酚的选择性很高，因此国内外多个研究小组都在研究利用这几种酶构 建可以测定酚类的电化学生物传感器。 国内北京工商大学的实验小组研究了用麦芽糊精固定酪氨酸酶修饰的碳糊 电极构成电流型生物传感器测水中酚类污染物质的方法 4 l 】。此电极对其他酚类 物质如邻苯二酚、对氯苯酚、邻甲酚等均有良好的响应，利用此种电极可用来检 测工业废水中的酚类物质的含量。雷存喜等人则是将天然聚合物褐藻酸钠添加到 无机硅溶胶凝胶膜中，获得一种新型的无机有机杂化膜【4 2 】。用此杂化膜包埋 酪氨酸酶，制备电化学苯酚传感器，来达到检测水溶液中苯酚的目的。而复旦大 学的学者利用a 1 2 0 3 溶胶凝胶成膜，并控制a 1 2 0 3 与h 2 0 的比率，使得膜上形成大 小不一的孔状结构，使酪氨酸酶分子固定于较大的孔状结构中，而指示剂分子固 定于较小的孔状结构中，从而得到酶与指示剂联合固定的电化学苯酚传感器，并 得到了良好的效果 4 3 。 s e t a 等国外学者利用电镀法制得的聚吡咯将酪氨酸酶固定在碳糊电极上，测 定动物组织中的苯酚 4 4 ；r o y 等人则是利用环糊精固定虫漆酶制得生物传感器， 用于测定2 氨基苯酚、邻甲氧基苯酚、儿茶酚等 4 5 】；s o l n a 等利用丝网印刷方 法，将胆碱酯酶、酪氨酸酶、过氧化物酶等多种酶分别固定在不同电极上，然后 将这些电极固定在同一器件板上形成复合酶电极，不同被测样可用不同的分电极 进行测试，复合电极可用于多种样品的测试 4 6 ；c o s n i e r 与将p p o 用戊二醛固定 于玻碳电极表面修饰的纳米碳酸钙之上，制得电化学酶电极，然后用于酚类物质 检测 4 7 】。 9 北京化t 人学硕i ：学位论文 电化学酶传感器比之大型仪器有着简单便携、操作方便、无需样品预处理等 多种优点，并有可能被微型化，应用于多种环境中的酚类物质测定。但是作为生 物大分子的酶，其活性难于维持，而且就以上各个研究中最常用的酪氨酸酶、虫 漆酶、p p o 和胆碱酯酶为参考标准，其价格均十分昂贵，且保存条件严格，根据 制备电极的方法不同，酶的用量也有很大差异。最终制作出来的酶电极测量效果 良好，但是长期稳定性较差，成品电极的存放复杂。 与酶传感器不同，电化学d n a 传感器广泛应用于环境检测，且电化学d n a 传感器相对于大型仪器测试，简单便携、操作方便、无需样品预处理，相对酶传 感器，d n a 稳定性更好，保存条件简单，价格低廉，但将电化学d n a 传感器应 用于苯酚检测还未见报道。 1 3 纳米材料在d n a 传感器中的应用 1 3 1 纳米材料概述 纳米是一种度量单位，以纳米来命名的材料始于2 0 世纪8 0 年代，它作为一 种材料的定义，把材料尺寸限制到1 1 0 0 衄范围内，其物理和化学性质与常规 尺寸的材料有着明显的区别。现在广义的纳米材料是指在三维空间中至少有一维 处于纳米尺度范围，或由它们作为基本单元构成的材料。 因其特殊结构导致其具有以下四方面效应 4 8 】： ( 1 ) 表面效应：表面效应 4 9 】是指纳米粒子随着粒径变小，表面原子与总原子 数之比急剧增大后所引起的性质上的变化。该效应表现为纳米粒子表面极为活 泼，而呈现出不稳定状态。 ( 2 ) 体积效应：当纳米粒子的尺寸与传导电子的德布罗意波长相当或更小时， 周期性的边界条件将被破坏，磁性、内压、光吸收、热阻、化学活性、催化活性 及熔点等可能会发生巨大变化。 ( 3 ) 量子效应：粒子尺寸下降到一定值时，费米能级附近的电子能级由准连 续能级变为分立能级的现象称为量子尺寸效应【5 0 。在纳