（果树学专业论文）山定子遗传转化体系的建立.pdf

中文摘要 本实验以山定子叶片为实验材料，采用农杆菌介导法，研究了抗生素及转化过程中各因素对 转化的影响，成功获得转化m m r t l 基因的山定子转基因植株。建立了山定子转化体系，为山定子 性状的定向改良奠定基础具体实验结果如下； 研究了羧苄青霉素( c a x b ) 、头孢霉素( c e o 、卡那霉素f r , a n ) 、潮霉素( i i y g ) 对山定子叶片愈伤 组织和不定芽诱导的影响结果表明，羧苄青霉素对山定子叶片再生有明显的抑制作用，浓度低 于4 5 0 m 班的头孢霉素对山定子叶片愈伤和不定芽诱导影响不大极低浓度的潮霉素即可导致山 定子叶片大面积褐化死亡，不适合做筛选抗性芽的抗生素k a n 浓度为4 0 m g l 时，恰好可完全 抑制不定芽再生而不使叶片死亡，可作为山定子叶片转化过程中合适的筛选压力浓度 通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率，研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、 共培养时间、预培养时间、侵染时间、暗培养时间、培养基碳源及固化物对转化的影响结果表 明：预培养不利于山定子叶片的转化；菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响；侵染 1 0 或1 5 m i n ，共培养3 天，暗培养2 或3 周得到的抗性芽百分率最高；转化后叶片再生培养基的 最适碳源为葡萄糖或蔗糖，最适固化物为植物凝胶和g e l r i t e ，最佳激素配比为n a a l 0 m g l 4 - b a 2 m g l + t d z 4 m g l 抗性植株经p c r 检测，初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中 关键词：山定子；叶片l 遗传转化；影响因素 a b s t r a c t u s i n gt h el e a v e sa st h em a t e r i a l ，d i f f e r e n ta n t i b i o t i c sa n d v i ：n l 白_ c | 【o 碍w h i c ha 丘e d 一驴口6 4 d 甜血肼 i i u n e f a c e n sm e d i a t e dg e mt r a n s f o r m a t i o no fm a l u sb a c e a t ab o r k h 懈i n v c s t i g a t e a t t h et r a n s g c n i c s h o o to f m a l u sb a c c a t ab o r k hw i t ht h et a r g e tg e n to f m x r t li n d i c a t e dt h a tg e n e t i cn a n s l 6 0 日n a n o 咀 s y s t e mo fm a l u sb a c c a t ab o r t d ah a db e e ne s t a b l i s h e d a l lo f 血i sl a y e daf o t m d i t i o no fu p g r a t i n gt h e c h a r a c t e r so f m a l u sb a c c a t ab o r k t h er e s u l t si s1 1 8b e l o w ： e f f e c t so fc a r b e n i e i l l i n , e e f o t a m x i m , k a n a m y e i na n dh y g r o m y e i no nc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o t r e g e n e r a t i o nf i o mt h el e a v e so fm a l u sb a c c a t ab o r k hw i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 洲e i l l i nr e s t r a i n e dt h el e a v e sr e g e n e r a t i o no f m a l u sb a c c a t ab o r l r j as l g n i r l e a n t l y c e f o t a r a x i m eh a d 1 1 0 i g n i f i m te f f e c l s0 nt h ec a l l u si n d u e l i o na r i ds h o o tr e g e n e r a t i o nw h e nt h cc o n c e n t r a t i o nw a sl e s s t h a n4 5 0 m g r t , i - i y g r o m y e i ni su m u i t a b l ct o ts a r e e n i n gt h ek a n a m y e i nr e s i s t a n ts h o o tb e c a u s el o w c o n c e n t r a t i o no fl a y g r o m y e i nb r o u g h t _ m a 鲳o fl e a v e s 幻d e a t h t h ec o n c e n t r a t i o no lk a n a m y e i na t 4 0 m e , le m p l c t c l yr e s t r a i n e dt h es h o o tr e g e n e r a t i o na n dw a so p i t a lt oo 口mt h ek a n a m y e i nr e s i s t a n t s h o o ti nt h eg e n e t i ct t a t 僦o r m a t i o no i m a l u sb a e t ab o r k l l b yc o m p a r i n gr a t eo ft h ek a n a m y e i nr e s i s t a n ts h o o t , s e v e r a lf a c t o r sw h i e l aa f f e c ta g r o b a c t e r u m n u n e a d e n sm e d i a t e dg e n ei z a n s f o r m a t i o no fm a l u sb a e c a t ab o r l r hw mi n v e s t i g a t e d t h ef a c t o r s i n c l u d e dh o l l n o n l c o m b i n a t i o n , a e e t o s y r i n g o n c ( a s p r o l i n e o o - c t d t u r ct i l n c ，p r c - c u l t t t r e 血坞 i n 如c i 妯峨d a r kc u l t u r e 妇，c m j o o e is o u i c a n dc o n d e n s a t co fi n e d i l l m t h er e s u l 扛s h o w e dt h a t p r e - c u l t u r eo ft h el e a v e sw 私d j , s a d v a n l a g e o l l i s1 0 缸部啮f ( 岫田越j o n ：t h 眦w 鸹n oe v i d e n ti n t l u e n e e l a a n d o r m a t i o nb ya d d i n ga sa n dp i oi n t ot h eb a c t e r i a l 翮s p s i 傩o rn o t ；i i f f e e t i o nf o r 加o r1 5 m i n i t e s n dc o - c u l t u r ei o r3d a y st h e nt h ec u l t u r ei n t h ed a r kf o ra b o u t2o r3w e e k so b t a i n e dt h el a i g h t e s tr a t eo f 曲幛r e s i s t a n ts h o o t ；t h eo p t i m a lc a r b o n9 0 i l r 溉o fl e a fr e g e n e r a t i o nl i l l x u u ma f t e rt z a n s f o r m a t i o l aw a s s u g a ra n dg i u 蝎p h ”a g da n dg e l r i t e 1 1 1 1 ：b e t t e rt h a n a g 缸 i t so 翻a d e m a t co ft h e m e d i u m n a a l o m g i a - b a 2m g l + t d z 4m g 儿i st h eb e s th o l r l l o l l ce o m b i n a t i o o t h ep 氓a n a l y s i s s h o w e dt h a tt h et a r g e tg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot l a eg e n o m co f m a l u sb a c e a t ab o r k l l k e yw o r d ：m a l u sb a c c a t ab o r k h ；le a f ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i ；a f f e c t i n gf a c t o r 缩略词 6 - b c n z y l a m i n o p u r i m a - n a p h t h a l e n ea c e t i c a c i d 1 扯d i a z u m n c e f o t a m x i m e r t f a m p m c a r b e n i c i u i n k a n a m y c i n h y g r o m y c i n m i c r o g r a m m i c r o l i t r e b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y l - p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h y l e n ed i n i u i l o t e t r a c e f i ca c i d l i u e m m i g i a m m 珊i l i t 盱 o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r o u n d sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i s o y u 蛔x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 队耋|馓：鎏蛐；蓦脚哼肚陋一一一k蟛础瞅慨氍耄|鲎 独创i 生声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：马志，拇 时间： 聊7 年6 月d 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 马毛搏 翮参 时间：a a 驴2 年b n ，。日 时间：矽矿年6 月b 日 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 第一章前言 1 1 果树转基因研究进展 植物遗传转化( g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ) 是指利用重组d n a 技术和植物细胞组织培养技术， 将外源基因导入植物受体细胞进行无性繁殖，使外源基因在受体细胞表达，从而产生人类所需的 转基因植株果树转基因研究始于2 0 世纪年代末期，m c g r a n a h a n 等于1 9 8 8 年获得转基因核 桃植株，是世界上首例转基因果树，随后苹果、柑橘、梨、葡萄、草莓、猕猴桃、桃、李、杏、 番木瓜、芒果和香蕉等果树也相继成功实现了遗传转化( l e ej ，1 9 9 8 ；y a m a m o t ot ，2 0 0 0 ；b e l l r l ，1 9 9 9 ：s c o r z ar ，1 9 9 1 ；l a i m e r ，1 9 9 2 ；f i t c h ，1 9 9 3 ) 苹果转基因研究成就尤为显著，自 1 9 8 6 年获得“绿袖”的转基因植株以来，已有m 2 6 、金冠、绿袖、新乔纳金、皇家嘎拉、元帅、富 士，王林，e h t a r 、粉红佳人等品种和砧木获得转基因植株( 程家胜，1 9 9 4 ；张志宏，1 9 9 7 ；j a m e s d j ，1 9 8 9 ；d a n d e k a r a m ，1 9 9 0 ：c l a u d el ，1 9 9 2 ；s u t t e re g ，1 9 9 3 ：n o r e l l ij l , 1 9 9 3 ；a n n ah o l e f o r s ， 1 9 9 7 ) ，部分已进入大田试验阶段 1 1 1 果树遗传转化的方法 1 农杆菌介导法 农杆菌介导的遗传转化具有操作简单、成本低、导入d n a 片段较大等优点，因此是目前应 用最广泛的一种方法( 王关林等，1 9 9 6 ；m i n g 等，1 9 9 7 ) 果树转化成功的例子中，8 0 以上是 采用农杆菌介导法( 曾黎辉，2 0 0 2 ) 农杆菌介导法的转化原理，主要得益于农杆菌侵染植物受伤部位，产生冠瘿瘤的过程在致 瘤菌株感染植物过程中，1 i 质粒的一段d n a 序列整合到植物基因组中并与植物基因组d n a 一 起复制表达，这段序列称为转移d n a ( t - - d n a ) t - d n a 上有两类基因：致瘤基因( o n c o g e n e ， o n c ) 和冠瘿瘤合成酶基因除刊d n a 外，面质粒上还有致毒区( v i r u l e n c e ，、 i r ) ，以及冠瘿瘤 代谢、接合转移、d n a 复制、不相容性等功能区段已有的实验证明，t - d n a 的左右边界区， v i r 区以及农杆菌染色体上的染色体致毒区( c h r o m o s o m ev l n f l e n c e ，c h v ) 在t - d n a 转移和整合过 程中起关键作用农杆菌染色体致病区( 曲v ) 分为c h v a 和c h v b 两个基因位点主要起决定农杆 菌能否附着到寄主植物细胞表面的作用农杆菌表面的脂多糖和植物细胞壁上的果胶是农杆菌附 着的感受器。一旦附着，相互作用的结果是农杆菌合成纤维素小丝，把农杆菌固定在植物细胞壁 上，并把其他农杆菌聚在一起，以便于t - d n a 的转移毒性区v t r d 2 蛋白基因具有两个明显的 核定位信号，起激活t - d n a 在植物细胞核中定位的作用( 夏英武等，1 9 9 4 ) 野生型农杆菌不适合作为基因工程载体因为其质粒庞大，很难找到单一t - d n a 区限制性酶 切位点，诱瘤基因导致植物再生困难于是人们对农杆菌株系进行选育并对砸质粒进行改进：( 1 ) 去处某些非必须序列在t - d n a 区去掉诱瘤，基因只保留其左右边界和n o s 基因，并成功地感 染植物表达胭脂碱，并诱导出植株，是农杆菌作为转基因工具的一大突破z e m b r y s k i 用p b r 3 2 2 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 代替p t i c 5 8 的一个t - d n a ( 只保留左右边界和n o s 基因) ，构建成新的质粒p o v 3 8 5 0 ，用含有 该质粒的农杆菌侵染植物得到胭脂碱表达；( 2 ) 构建筛选外源基因的嵌合基因。s h i m a m o t o 在 t - d n a 中构建了n o s 和。岱启动子+ a p t i i + t n o s ( p o l y a ) 的嵌合基因并使其带有了选择标记基因， 是农杆菌作为转基因工具的第二个里程碑；( 3 ) 构建中间载体。即将t - d n a 亚克隆到一个方便 操作的小的p b r 3 2 2 系列的大肠杆菌质粒中，外源d n a 可方便插入包含有t - d n a 区的质粒，然 后导入农杆菌中，用于植物转化( 4 ) 构建双元质粒载体和超双元质粒载体。即在农杆菌中引入 一个含有外源基因的小质粒与农杆菌的原始质粒构成双元或超双元质粒，使含有重组外源d n a 的髓质粒更方便快捷地导入农杆菌，同时使得转化效率也大大提高( 徐明良，1 9 9 6 ) 。 果树主要采用叶圆盘法，直接利用叶片、茎段、愈伤组织和悬浮细胞等具有再生能力的外植 体作为转化受体。如苹果的转化主要以叶片为受体，柑橘类主要采用茎段、胚轴和子叶而葡萄则 利用胚性培养物来转化( s c h e l l ，1 9 9 6 ；陈善春，1 9 9 7 n o r e l l i 等，1 9 9 4 ；赵政阳等，1 9 9 6 ) 木本果树还可以采用活体接种法进行转化。活体接种法一般采用田问树体为外植体，在整体植株 上造成创伤后把农杆菌接种在刨伤面上，或用针头直接将农杆菌注射到植株体内使其侵染转化 李卫等( 1 9 9 7 ) 用此方法感染沙田柚叶腋，并将转化腋芽离体扩繁，成功得到转基因植株洪勇 等( 2 0 0 0 ) 将农杆菌菌液直接浸入柑橘实生苗幼芽切口处，包缠伤口后诱导再生芽，锦橙、新会 橙和沙田柚的转化效率分别达到4 6 3 。9 5 和4 3 7 2 基因枪法 基因枪法又称弹轰击法，基本原理是将外源d n a 包被在微小的金粒或钨粒表面，高压作用下 微粒被高速射入受体细胞或组织，使微粒上的外源d n a 整合到植物基因组d n a 中并得到表达，从 而实现基因转化( 董云洲，1 9 9 3 ) 1 9 8 7 年，k l e i n 等首次用基因枪法将烟草花叶病毒c r m v ) 成功 转入洋葱表皮细胞( j a m e s 等，1 9 9 5 ) ，基因枪法无宿主限制，受体广泛，( h e b e n ，1 9 9 3 ) 用包裹 质粒的钨弹轰击葡萄细胞悬浮系，获得了转化的愈伤组织s c o r z a 等( 1 9 9 6 ) 结合农杆菌介导法和 基因枪法转化葡萄胚，提高了转化率目前利用基因枪转化获得转基因植株的果树有番木瓜、桃、 葡萄，蔓越橘等( m i n g r 等，2 0 0 1 ；赵彬等，1 9 9 8 ；安韩冰等，1 9 9 7 ) 3 其它转化方法 果树遗传转化主要以上述两种方法为主，但其它方法也有成功报道v a r d i 等( 1 9 9 0 ) 用p e g 法 转化柠檬原生质体获得转基因植株，o l i v e r a ( 1 9 9 6 ) 用电击法及p e g 法转化猕猴桃原生质体获得 成功，赵慧等( 1 9 9 8 ) 用微激光束穿刺法将菜豆几丁酶基因导入苹果叶片，获得了转基因植株 1 1 2 果树遗传转化受体系统 转基因植株的获得依赖于合适的转化受体及转化细胞的有效再生，因此应选择易于再生的外 植体进行转化，其次，具有再生能力的细胞要对农杆菌敏感刘庆忠等( 2 0 0 0 ) 最初转化皇家嘎 拉白化茎段获得转基因植株，分析发现作为新梢再生起源的表皮和下表皮细胞中没有g u s 基因 的表达，o u s 基因表达集中于形成层和维管束周围的皮层细胞。 转化效率还与外植体的发育阶段有关。程家胜( 1 9 9 2 ) 认为以生根培养1 个月的苹果上部 2 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 幼嫩叶片作为基因转移的受体材料最好农杆菌介导的转化对植物细胞具有选择性，只转化处于 代谢活跃或分裂期的细胞，因此，在果树转化中经常采用预培养、频繁继代、创伤外植体等办法 调整外植体的状态，以获得合适的转化受体，提高转化效率。 果树常用的转化受体为茎段，叶片，在柑橘中。来源于珠心胚的胚轴和子叶也是常用的转化 受体。方宏筠等( 1 9 9 9 ) 认为茎尖转化系统再生能力强，对侵染损伤及卡那霉素的耐受力强，转 化频率较高，茎尖不经脱分化过程直接分化出芽变异少，且超小剥离的茎尖再生后具有脱毒效果， 他们以茎尖为转化受体成功转化了樱桃矮化砧木这些组织化程度较高的外植体对农杆菌的敏感 性不如悬浮细胞及原生质体，但耐受性好，操作简单，是果树上理想的转化受体 另一类常用的受体是胚性培养物，包含合子胚、体胚、胚性愈伤组织、悬浮细胞等许多果 树使用这种外植体获得转化成功，如核桃、桃，李、杏、番木瓜、葡萄等( 曾黎辉，2 0 0 2 ) 胚 性细胞具有很强的接受外源d n a 的能力，繁殖量大，嵌合体少，转化率较高。葡萄体胚来源于 叶片，且通过次生胚再生起源于单细胞，是优于叶片的转化受体，转化率可达1 3 农杆菌侵染 荔枝、龙眼胚性愈伤组织，发现愈伤组织对农杆菌敏感，但耐受性差，一些品种与农杆菌共培养 后会发生白化愈伤组织和悬浮细胞是基因枪转化中常用的受体c a b m r a - p o n c e 等( 2 0 0 2 ) 以番 木瓜合子胚和胚性愈伤组织作为粒子轰击的靶细胞，胚性愈伤组织的转化率远远高于合子胚目 前已经在多种果树上利用原生质体再生出植株( 邓秀新等，2 0 0 3 ) ，为采用原生质体为受体的基 因转化奠定了基础 1 1 3 导入的外源基因 1 抗病虫基因果树病害主要由病毒及类病毒，真菌和细菌引起来自苏云金杆菌的b t 蛋白 基因及来自植物的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因等成为果树抗虫转基因的目的基因。 ( s o a r z a ，1 9 9 1 。1 9 9 4 ；o u e m a d a h 等，1 9 9 0 ) 。且前几乎所有已实现遗传转化的果树均培育出抗病 虫转基因植株( 陈善春等，1 9 9 6 ；d a n c e k a r 等，1 9 9 8 ；汤浩茹等，2 0 0 1 ；h i 嘣d ac a m a r am a c h a d o 等，1 9 9 9 ；l i u 等，1 9 9 9 ) 2 抗逆基因通过转基因手段提高植株抗逆性已取得阶段性成果，转s o d 基因的葡萄和转 彻基因的草莓在田问试验中均表现出比未转化植株具有更强的抗冷能力，通过促进甜菜碱或 山梨醇的积累也获得了抗盐的转基因柿和草莓植株，c | 撇a 等( 2 0 0 0 ) 将酵母h a l 2 基因导入柑 橘获得了抗盐植株；抗除草剂的转基因草莓和欧洲栗也己获得( 杨莉等，2 0 0 3 ) w a n g 等从冷诱导的柑橘中分离出a o c 厶成酶基因并将其反义导入甜橙和枳，大大减少了冷诱导 乙烯量，使果实更易储藏( y a o 。1 9 9 9 ) 3 缩短童期r e n a 等( 2 0 0 1 ) 将拟南芥u 执f y 和a p l 基因导入甜橙和枳橙，转化植株开花比 未转化植株提早3 - 5 年开花，该性状在后代得到稳定遗传和表达，从转基因果实中取出的种子经播 种后，童期也明显缩短 4 促进树体矮化、分枝与生根通过野生型根癌农杆菌感染将细胞分裂素合成酶基因导入桃 已经获得树体矮化、分枝多的转基因植株通过发根农杆菌感染将r o l a ，m 或r o l e 基因导入 苹果、枳、梨和猕猴桃，既可促进树体矮化和分枝，还可促进生根( s m i g o c k e 等，1 9 9 1 ) 5 增强果实耐贮性在跃变型果实中，一般通过减少乙烯合成的基因工程达到延缓果实成熟 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 m 的目的，非跃变型果实则采取抑制乙烯生成和降低细胞壁降解酶类达到目的。目前己获得乙烯生 成受抑制的转基因香蕉和果胶裂解酶活性下降的草莓果实，转基因苹果，桃和番木瓜的特性尚在 观察中( 杨莉，2 0 0 3 ) 6 促进单性结实或少籽通过转基因诱导单性结实已经在葡萄( m e z z e t t i ，2 0 0 2 1 和草莓 ( m e z z e t t i ，1 9 9 2 1 上获得成功，已经获得了旨在减少种子的柑转基因植株( i j ，2 0 0 2 ) 7 改善果实鲜食或加工品质m u r a t a 等反义导入该基因，获得了抗褐变的苹果愈伤组织，后 续研究仍在进行；现已获得提高糖含量的转基因葡萄及草莓；通过转基因提高类胡萝h 素含量的 尝试已经柑橘上展开；转入酸性转化酶基因的葡萄果实风味得到改善，利于鲜食，转入黄烷酮醇 还原酶基因的葡萄褐色素积累减少，提高了葡萄酒品质( 杨莉，2 0 0 3 1 1 1 4 选择标记基因与转化细胞的筛选 转化细胞的有效再生除要求受体材料具有高效稳定的再生能力外，选择合适的选择标记基 因、恰当的抗生素种类及浓度对转化细胞筛选也十分重要。果树上最常用的选择标记是新霉素磷 酸转移酶基因( n p t i i ) ，n p t l i 基因的表达可使转化细胞对含有氨基塘苷键的抗生素( 卡那霉素， 新霉素等1 产生抗性，潮霉素磷酸转移酶( 研) 基因、抗除草剂基因b a r 基因等选择标记基因在 果树遗传转化中也有使用。 m u l i i n s ( 1 9 8 8 1 用高浓度的k a n 为选择压获得葡萄转基因植株a l d w i n c i d e 等( 1 9 9 3 ) 报道 红树莓遗传转化用韧f 比用n p t l i 更为有效。不同的转化受体筛选方法也有所不同，苹果转化体的 获得采用选择和非选择交替培养或仅对再生芽进行筛选，对杏有效的筛选是在共培养2 1 天后才 进入筛选培养。 1 1 5 转基因植株的验证 植物遗传转化中，经常会有假转化体出现，因此，必须对转基因植株进行鉴定目前转基因 植物的鉴定方法主要有三类；选择标记基因，分子检测、免疫技术 一、选择标记基因 选择标记基因也称报告基因( r e p o r tg e n e ) ，是一种片段较小，表达产物易于被检测，能迅速 报告细胞、组织、器官或植株是否被转化的基因选择标记基因多数是一些酶的基因，主要包括 三类：一、双子叶植物农杆菌转化中常用农杆碱合成酶类，这类报告基因都是合成农杆碱的特异 酶类基因，检测时加入相应前体，利用其酶活性，将其催化为对应的农杆碱，然后以标准农杆碱 作对照，进行纸层析，经呈色反应，即可判断该植株是否转化；二，抗生素转化酶类，这类报告 酶将底物抗生素乙酰化或磷酸化，底物进行放射性标记，便可判断是否转化；三、产物具有光学 性质的酶类，利用带有光学活性基因的前体作底物( 李强，1 9 9 5 ) ，在报告酶的作用下，产生光 学活性物质，经过比色，荧光检测即可判断是否成功转化应用最广泛的报告基因主要有b - 葡萄 糖苷酸酶基因( g u s ，8 - 半乳糖苷酶基因，荧光素酶基因( 王永飞，2 0 0 4 ) 侯学文等( 1 9 9 7 ) 发现一种集选择与筛选于一体的绿色荧光蛋白( g f p ) ，它没有种属依赖性，不需要加入底物和辅 助因子，只需暴露在3 9 5 n m 或4 9 0 r i m 的光下便会激发出绿光。 4 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 为了抑制非转化细胞的生长，必须在培养基中添加一定浓度的选择压对外植体进行选择， 目前最常用的是抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性标记基因印f ，潮霉素抗性标记基因枷和 氯霉素抗性标记基因f ；除草剂抗性基因，如具p p t 抗性的b a r 基因；药物抗性基因，如氨甲 喋呤抗性基因m t x l 其原理是抗性基因编码的的蛋白( 酶) 对抗生素药物进行乙酰化、腺苷化， 磷酸化等化学修饰或水解，从而破坏了抗菌素的作用，从而使转基因植株产生相应的抗性可根 据不同植物的敏感程度选择恰当的标记基因 二、分子检测 转基因植株的分子检测主要包括分子标记和分子杂交 分子标记常用的方法有p c r 、r f l p 、r a p d 以及d n a 指纹技术，这些都是d n a 水平的 鉴定，而真核生物基因表达调控的程序复杂，通过分子标记确定已经整合到受体基因组上的外源 目的基因，极有可能在转录水平受抑从而使外源目的基因无法在转录水平检测到即使转录水 平正常，但由于大量r n a 存在，r n a 所依赖的r n a 聚合酶被激活，形成r n a 双链，被r n a s 降解，造成转录后水平的抑制，翻译及蛋白质水平上的调控，也会影响外源目的基因的表达，所 以仅在d n a 水平的检测是远远不够的，随后出现了分子杂交技术。 分子杂交是鉴定转基因植株在各调控水平上是否整合或表达的重要方法，主要包括s o u t h e r a 杂交，n o r m e m 杂交及w e s t e r a 杂交s o u t h e m 杂交，是外源目的基因序列作探针与转化植株的 总的d n a 进行杂交，是d n a 水平上的分子鉴定方法：n o n h e m 杂交是外源目的基因序列作探针 与r n a 杂交，是转录水平上的分子鉴定方法w e s t e m 杂交则是在翻译或蛋白质水平上进行的分 子鉴定方法( m i n gx t j 0 0 0 ；朱常香，2 0 0 0 ；t a n gk x 2 0 0 0 ) ，。 三、免疫技术 免疫技术是一种蛋白质水平上的检测技术。常用的主要有酶联免疫法( e n z y m e - l i n k e d h n m u n o s o d k m a s s a y , e h s a ) 和免疫荧光技术( h n m u n o f l u o r e s c e n c e ) 目前利用e l l s a 法从不同作物中检测到了b t 、p a t 、e p s p s 等蛋白( u i b a n e k 等，2 0 0 3 ； r o g a n 等，1 9 9 9 ：i j 即等j 0 0 0 ) e l l s a 还可应用于检测报告基因删表达的蛋白欧盟1 3 个 国家3 8 个实验室用e u s a 对转基因大豆样品中的e p s p s 进行检测难确率高达9 9 ( u 坤等， 2 0 ) 目前常用的转基因检测方法是p c r 与豇船a 结合起来的i c r - e l i s a 法，亚匕方法结合了 i c r 的高效性与e u s a 的高特异- 灵敏度可达0 1 此外，也有利用生物鉴定方法、统计方法和细胞形态学等进行转基因鉴定的方法 1 1 6 影响果树基因转化的因素 果树遗传转化个主要的问题就是转化效率很低，探索影响苹果遗传转化效率的因素，以达 到良好的转化效果，就成为果树基因工程研究领域的重要内容目前研究认为，影响果树转化效 率的因素主要有： 1 受体基因型及生理状态果树基因转化频率与再生效率之间联系密切。通常适合转化的受 体系统首先是一个高效的再生体系，目前许多果树用叶片、茎段等外植体再生困难，制约了果树 基因转化的进程受体的生理状态也很重要，b n n d t 等( 1 9 9 6 ) 用继代培养2 0 - 4 0 d 的试管苗幼嫩 叶进行转化，才能获得最高的转化效率，d a n d e k a r 等( 1 9 9 0 ) 取靠近顶端部位的2 3 片嫩叶为试 5 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 材，转化效率最高。 2 农杆菌菌株及载体的影响农杆菌分三大类菌系，即胭脂碱型o p a l i t y p e , n o p ) 、章鱼 碱型( o c o p j 丑ct y p e ，o c t ) 及农杆菌碱型( a g r o p i u et y p e ) ，亦称琥珀碱型( s u c c i n e n u ，p i n et y p e , s u c ) 。n o p 型菌株生长速度快，不结球、易操作，常用的工程菌株有c 5 8 、p g v 3 8 5 0 、a 2 0 8 s e 等； o c t 型菌株生长慢，菌株培养过程中结球，操作困难，共培养后不易洗掉，常用的工程菌株有l b a 4 4 0 4 、l b a l 0 4 ；s u e 型菌株具有n o p 型菌株的特点，常用的工程菌为e h a1 0 1 和e h a1 0 5 。这 两种菌株的侵染能力都很强( j a c q 等，1 9 9 3 ；s a r m e n t o 等，1 9 9 2 ；v e l u th a m b i 等，1 9 8 9 ) 。通过 在多种果树上菌株种类的侵染能力比较，认为e h a1 0 5 是果树基因工程中理想的转化载体，利用 该菌株己成功获得了苹果、樱桃、草莓等多种果树转基因植株。 3 农杆菌v i r 基因的活化西质粒上的v i r 区有v i r a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h 7 个操纵子共 2 4 个基因，共同起调控作用，控制t - d n a 的加工和转移v i r 区基因活化增强可提高农杆菌侵染 能力，常用的v i r 区基因诱导物是乙酰丁香酮( g o d w i n ，1 9 9 1 ) 也有实验认为a s 对转化效率影 响不大苹果叶片转化中发现，与a s 同时加入诱导稳定剂甜菜碱或脯氨酸。对v i r 基因活化有协 同作用( j a m e s ，1 9 9 3 ) p h 值对v 证区的活化影响明显，章鱼碱型和农杆菌碱型菌系比胭脂碱型 需要更低的p h 值植物组织培养基中的p h 值一般为5 8 ( g o d w m 等，1 9 9 1 ；h o l f o r d 等。1 9 9 2 ) ， 利于v i r 基因的活化。v i r 基因活化还受温度的影响。v i r d 及v i t g 的活化必须低于2 8 ；培养基 中的糖或高浓度的肌醇可促进v 缸基因表达( m a y e r h o f e r 等，1 9 9 1 ) 4 侵染时间和共培养时问合适的侵染时间和共培养时问，有利于t - d n a 充分切割、转移和 整合，提高转化效率，同时还能兼顾到后续培养过程中的除菌工作苹果对农杆菌较为敏感，侵 染时间多在5 1 0r a i n ，共培养时间一般为2 - 4 d 5 激素配比共培养时，培养基用高浓度细胞分裂素要比用高浓度生长素转化效果好( 张士宏 等，1 9 9 8 ) ，人工合成的细胞分裂素t d z 诱导不定芽分化比z t 、b a 、z i p 等有效，但并不能提高 苹果的转化频率( w e l a n d e r 。1 9 9 8 ) 6 碳源和固化剂果树转化时常用3 0 9 - l - 1 蔗糖作为碳源b o n d t 等( 1 9 9 6 ) 转化苹果，用 2 0 9 l - 1 的果糖、半乳糖、蔗糖，葡萄糖、山梨醇作为筛选培养基碳源，发现果糖和半乳糖对转 化效率有明显的抑制作用蔗糖和葡萄糖能获得较高的转化频率，丙山梨醇的效果则不及后两者 好遗传转化中，用琼脂固化培养基，叶片有时容易褐化用z 5r l 1 g e l r i t e 代替7g - u 1 a g a r 获得 了较好的效果( y a o ，1 9 9 9 ) b o l a r 等( 1 9 9 9 ) 用5 2 9 - l l a g a r + 0 1 9 l 1 g e l r i t e 或3 5g l a a g a r + 1 2 g l - 1 g e l f i t e 做固化剂，在苹果上获得1 2 的转化频率 1 1 7 转基因果树产业化现状 全球农作物基因工程正在进入一个飞速发展的时期，越来越多的转基因产品正在进入市场， 并逐步产生巨大的经济效益由于果树转化存在一些技术上的困难，与现在种植面积广泛的转基 因农作物相比，目前获得商品化生产的转基因果树很少美国研究者分离出番木瓜环斑病病毒外 壳蛋白基因，并用基因枪将这一基因导入番木瓜中，于1 9 9 2 年培育出抗病的番木瓜品种( f i c h m m ，1 9 9 2 ) ，并于1 9 9 7 年获得美国国家环保局和国家食品与药品管理局登记，这是全球首例进 入商品化应用的多年生转基因果树品种，成为继大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯和南瓜之后的 6 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 第七大转基因作物，但其总面积仍没有超过1 0 万h m 2 。 许多转基因果树正处于田问试验阶段，包括抗病虫的苹果、葡萄、菠萝，李，树莓、草莓、 蔓越橘和核桃；抗除草剂的草莓和欧洲栗；导入m 基因改进农艺性状的猕猴桃、草莓和李，改善 贮藏性能的苹果、番木瓜、草莓、树莓和菠萝，改变成花特性及提早开花的菠萝和苹果；导入生 长素基因以改善加工性状的葡萄、草莓和树莓；反义导入多酚氧化酶基因旨在减轻果实褐变的葡 萄；导入甜蛋白基因的菠萝等( 杨莉，2 0 0 3 ) 总体来说，转基因果树的商品化生产仍处起步阶段，今后的应加强果树遗传转化体系的研究， 提高转化率；加强果实风味等果树特有性状的遗传基础研究，分离相应基因；提倡科学研究与产 业化推广相结合，积极把科研成果推向生产，解决生产中可能出现的问题 1 2 m x l r t l 基因 铁是植物生长发育所必需的微量元素之一，在植物体的光合作用、呼吸作用、蛋白质和核酸 的合成等诸多生理代谢过程中发挥着极为重要的作用( t h o i r 等，1 9 9 7 ) 缺铁可导致植物叶片 黄化，光合作用降低，最终造成产量和品质的下降。在我国许多区域都存在果树缺铁问题。特别 是在干旱和半干旱的石灰性土壤区，土壤的钙化导致可被果树吸收利用的可溶性铁的含量极低， 很多果树表现出缺铁失绿症，给农业生产造成极大的经济损失，因此寻求矫治缺铁失绿症的各种 途径和方法也越来越重要 m x r t l 基因是本实验室从铁高效型苹果砧木小金海棠中克隆得到的( ) 转运蛋白基因 ( g e a b a a k 登录号 a y l 9 3 8 8 6 ) ，e d n a 全长为1 3 9 s ，编码区为1 0 9 s b p 该基因与玉米z 删r n t 基因片段、拟南芥a t n i l 基因、番茄和豌豆中的该家族基因分别具有7 4 ，6 3 、7 1 和6 9 的同源性，该基因与苹果中铁的吸收转运有关( 戚金亮，2 0 0 3 ) ，期望通过基因重组的方法将此 基因转入山定子，改善山定子容易缺铁失绿的性状 1 3 研究目的和意义 苹果是重要的落叶果树，其童期长，杂合程度高，以营养繁殖为主，因此其常规育种存在工 作量大，周期长，效率低等缺点，采用基因转移技术获得转基因植株已经逐渐成为苹果育种的重 要手段由于苹果叶片取材容易，细胞间隙大，容易由单细胞直接诱导分化不定芽。因此成为苹 果遗传转化中主要的受体材料 本实验受体材料山定子( m a l mb c a t ab o r k h ) 是一种重要的苹果砧木，在我国华北和东北 地区广为分布，具有抗寒性强、根系发达等优良性状，但在缺铁胁迫下极易黄化，以山定子为砧 木的苹果患黄叶病现象也较为普遍( 张凌云，2 0 0 2 ) ，因此通过基因工程改良山定子性状显得十 分重要本实验室已建立的山定子叶片再生体系，再生率可达以上，在此基础上，本实验通 过研究农杆菌介导的叶盘法转化山定子过程中的相关因素，建立了山定子遗传转化体系，为山定 子生物学性状的定向改良莫定了基础 7 中国农业大学硕士学位论文 第二章材科与方法 2 1 实验材料和试剂 2 1 1 植物材料 第二章材料和方法 山定子( 朋硝b a c mb o f l 【h ) ，来源于本实验室保存的无菌试管苗 2 1 2 菌株和质粒 质粒由本实验室保存质粒为p b h i ( 图2 1 ) ，含抗卡那霉素( k a n a m y c m ，l 【| m ) 的新霉素 磷酸转移酶( n p t h ) 基因r f g h f 转运蛋白基因( m x 疗1 ) ( 王忆，2 0 0 5 ) ，供试质粒采用化转 法( 金东燕，1 9 9 5 ) 转入根癌农杆菌臼g m k 础慨n o n 咖c 妇囝魄1 0 5 中 2 1 3 试剂 图2 - 1 檀物表达载体p b h i 结构葡图 f i n a l s t m c t m eo f p l a m v e c t o r p b m b a 、i a a 、n a a 及t d z 等激素购自鼎国生物试剂公司；k a n ，h y g 、o f 、c a r b 、r f f 等抗生素购自s i g m a 公司；d n t p 溶液、t a q d n a 聚合酶等生化试剂均购自s i g m a 公司 2 2 常用培养基和溶液配制 2 2 1 培养基的配制 m s 培养基( 1 l ) ：m s 大量元素、微量元素、有机物，3 0 9 蔗糖，7