（无机化学专业论文）外源离子对过氧化物酶活性及结构的影响的研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文 摘要 本文运用光谱学的方法研究了辣根过氧化物酶和烟草过氧化物酶的激活剂 和抑制剡对它们的活性以及结构的影响。主要内容如下： l ，结合前人数据详细讨论了p h 对h r p 活性的影响，比较了各- i - p h 值的缓冲体系 中的h r p 的同步荧光光谱。讨论t p h 芹 j 其氢键网络以及荧光生色基团所处的微 环境的影响以及血红素辅基上的铁原子的配位情况，推测了同步荧光变化的可能 原因。 2 ，文章还探讨了h r p 的一种活性抑制剂叠氮化钠对h r p 的活性以及辅基血 红素和荧光生色基匝所处的微环境的影响。通过紫外可见光谱和对荧光猝灭的计 算推断出荧光猝灭机制，计算 n a n 3 和h r p 的结合位点数和络合物的形成常数， 分析t n a b l 3 对h r p 中心辅基幂l 荧光生色基团的徽环境的影响。最后提出一种区 别t - 1 i ；i 人的失活机制。 3 ，研究了l 矿+ 对h r p 的激活作用，并通过红外、荧光、紫外可见光谱以及c d 谱 详细讨论了镧离子对h r p 的二级结构、辅基以及荧光生色基团的影响。揭示了镧 离子的激活作用主要是【0 + 和h r p 的多肽链中台0 或n 的基团产生结合，影响到 该酶的二级结搀，并影响到酶中钓荧光生色基团以及辅基所处的环境。 4 ，讨论t t o p i i 的两种抑制剂对其活性以及二级结构的影响。通过与c n 以及 n ，作用前后的活力和f t i r 光谱的变化。得知随着抑制剂相对食量的增加。t o p i i 的活力降低的同时伴随着酶的二级绪构的变化。对f t i r 光谱拟合后的数据表 明在与抑制剂作用的过程中，t o p i i 的水化膜存在聚合体的孵聚以及新的8 折 叠、a - t 旋的形成：t o pi i 的活性的下降在与较低浓度的抑制剂相作用时，主 要伴随着烟草过氧化物酶的二级缩构中的_ 折叠含量的下降；而在与较高浓度 的抑制剂相作用时，酶活的下降主要伴随着a 螺旋含量的急剧下降和转角结构 含量的大量增加。我们推测这些二级结构的变化对它的活性中心的血红紊口袋周 嘲的氢键产生定程度的破坏，使t o p i i 的结构的稳定性下降，进而影响到t o p i i 的活力。 中国科学技术大学硕十学位论文 i n t h i sa r t i c l e ，t h ee f f e c t so ft h ea c t i v a t o ra n dt h eh n a e t i v a t o ro nt h ea e t i v i t i e sa n dt h e s t r u c t u r e so fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ef l i p 9 ) a n dt o b a c c op e r o x i d a s e ( t o p ) w e r e 曲l d 蝤d n 蝣f o l l o w i n gi st h em a i nc o n t e n t so f t h ed i s s e r t a t i o n ： l ，t h ee f f e c to fp h0 1 1t h ea c t i v i t yo fh r pw a sd i s e u s 暇li nd e t a i l t h es y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fh 腿w h i c hc a l lr e f l e c tt h em i c r o e n v i r o n m e n to ft h e f l u o m p h o r e ，a td i f f e r e n tp hw e i ec o m p a r e d a c c o r d i n gw i t ht h ed a t ar e p o r t e d ，t h e e f f e c to nt h eh b o n dn e t w o r kt h a tw a si n t e n s i v et ot h ep hv a l u ea n di m p o r t a n tt ot h e s t a b i l i t yo f t h ea c t i v i t yc e n t e r a n dt h ec o o r d i n a t i n gi n f o r m a t i o no f t h ei r o na t o mi nt h e h e i n ew e r ed i s c u s s e d ，t h er e a s o no fa t ec h a n g eo ft h es y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n t s p e c t r aw a gs a g g e s t e d 2 ，t h ee f f e c t so f n a n 3 ，o n eo f t h ei n a c t i v a t o ro f h r p , o nt h e 犯瞎y 时o f m 啤a n dt h e m i c r o e n v i r o n m e n t so ft h ef l u o m p h o r ea n dt h eh c m ea n dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r e so f h r pw e r ed i s c u s s e d t h ef l u o r e s c e n tq u e n c h i n gm e c h a n i s m 、豁c l a s s i f i e d 醛s t a t i c q u e n c h i n gm 删锄t h r o u g ht h ec a l c u l a t i o no ft h ef l u o r e s c e n ts p e c t r aa n du v - s s p e c u tt h e 埘耐材o f b h 畦i i 塔s i t ea n dt h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n to ft h em t oh r f w e r ec a l c u l a t e d o n 幽魄b 酗o ft h ec o l a c l u s i o n s 。an e wi n a c t i v a t i o nm e c h a n i s m w a ss u g g e s t e d 3 ，1 1 1 ea c t i v a t i o no fl a 3 + t oh r p , w h i c hw a sr a r e l yr e p o r t e db e f o r e ，w a ss t u d i e db y u v - v i ss p e c t r a ，f t i rs p e c t r a ，f u o r e s c e n ts p e c t r aa n dc ds p e c t r a t h ee f f e c t so ft h e l a 3 + o nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ea n da g o n m eh e m e ，a n dt h em i c m e n v i r o n m a n to f t h ef l u o r o p h o r ew e r ed i s c u s s e di nd e t a i l i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ea c t i v a t i n ga c t i o no f t h el a 3 + o nh r pw a sd u et ot h eb i n d i n go ft h el a 3 + t oo x y g e no rn i t r o g e na t o m so n t h er e s i d u e so fh r p sp e p i t i d c ，w h i c ha f f e c t e dt h es e o o n d s ys t r u c t u r ea n dt h e m i c r o e n v i r o n m e n to f t h ef l u o r o p h o r e 。 4 ，t h ee f f e c t so ft w oi n a e t i v a t o ro nt h ea c t i v i t ya n dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h e t o p1 1w e r ei n v e s t i g a t e d r 如u 醢t h ed e s c e n d i n ga c t i v i t ya n dt h ec h a n g eo ff t i r s p e c t r ao ft h et o p1 i i t sc o n c l u d e dt h a tt h ei n a c t i v a t i o nw a sa c c o m p a n i e dw i t ht h e c h a n g eo f c o n d a r ys t m c t u r ew h i l et h ec o n t e n to ft h ei n a e t i v a t o rw a sa d d e d i t s i l 中国科学技术大学硕十学位论文 f o u n dt h a tt h e r ee x i s t e dd e p o l y m e r i z a t i o no f t h ef i l mo f t o p l i o nt h et i b r 3 t i l 3a n d c o n f o r m a t i o no f t h e 船wb s h e e ta n da - h d i x f u r t h e r m o r e ，i t sf o u n dt h a tt h ed e s c e n t o f t h ea c t i v i t yo f t h ee n z y m ew a sc o m p a n i e dw i t ht h es h a r pd e , r s eo f a - h e l i xa n d e m e r g e n 姆哆al o to fc o i la n dt u r n i t ss u g g e s t e dt h a tt h ec h a n g eo ft h e n d a l y s t r u c t u r e ：d e s t r o y e dt h eh - b o n dn e t w o r kt os o m ee x t e n ta n dm a d et h es t a b i l i t yo ft h e s t r u c t u r e o f t o p i i d e s c e n d a n d a f f e c t e d t h ea c t i v i t y o f t h e t o p h n i 中国科学技术大学硕士学位论文 引言 第一章过氧化物酶的研究进展 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 是广泛存在于生物体中的一种酶【l 】。自从 1 8 11 年t h e n a r d 发现过氧化物酶，并指出它可以针对活体内特定的底物进行降解 后，过氧化物酶的研究拉开序幕。人们对它的催化性能、结构( 尤其是它的活 性中心) 以及催化的机理进行了很多研究，使人们对它的认识有了质的提高。 最初，研究手段有限，人们主要做的是热力学的研究，进展也很有限。随着技 术手段的提高，在1 9 3 6 年s t e m i i l ! 实了其中原卟啉i x ( 参阅附录1 ) 是活性基团 1 擘黔謦t i 謦零卿蹇毽；孥燃痨砖趔备出誊- 为巷麴洚羞辨上认识过氯化物酶活 性中心提供7 研党黪系瑚。在邀之后人们开始从晶体学、光谱学、分子生物 学、遗传学等各种角度对过氧化物酶开展更加深入的研究。 大部分过氧化物酶都含有血红素辅基，是一种结合蛋白。它可以倦化h 2 0 2 或相关化合物如0 2 和有机、无机化合物的氧化反应【3 “一】。自从发现过氧化物酶 之后，人们对各种生物体内的过氧化物酶进行了较为广泛的提取，对其化学性 质，生理学功能，晶体结构等傲了详细的研究。目前已经发现了大量的不同来 源的过氧化物酶，其中已经确认结构的过氧化物酶有2 6 4 个，另外有“个待发 表的结果( 包括同一个酶不同分辨率的结构) 陋】。它们和氢供体或者电子供体的反 应可以通过下式表达： r o o r + e l e c t r o nd o n o r ( 2e - ) + 2 h + 一r o h + r o h ， 目前，过氧化物酶在酶的构建、免疫测定技术和药物诊断技术上应用较为 广泛。它还用于糖链成分的酶学测定，尤其适用于糖尿病的诊断。另外应用在 生物传感器，药物的改进，化学试剂的生产，芳香化合物的降解，在材料科学 领域也有应用比如生产无需甲醛做溶剂的树脂涂料；在有机合成中，过氧 化物酶也是一种很好的倦化剂。大批的植物过氧化物酶的同工酶，它们较为一 致的性质和拥有众多灵敏的比色分析方法使得过氧化物酶作为一种便利的酶标 记物，在组织学、基因学、生理学和病理学研究中发挥了重要作用。过氧化物 酶还被常常应用予有伸展蛋白参与的多糖链接、吲哚乙酸的氧化、抗病性及细 1 中国科学技术大学硕士学位论文 胞生长发育的调节【“引。由手它对植物的抗病性有害物质的降解能力使得它 已经很广泛的应用于农业，环保等领域唧；它在体内还扮演了一种抗氧化剂的 角色。由于在非水体系中仍具有催化活力，甚至会出现超活力现象，所以过氧 化物酶在非承体系中的研究也很受关注。非水介质中酶催化反应具有水溶液中 所不具备的优点如酶的热稳定性有显着提高等。有机相中酶催化酚类氧化聚 合是有工业应用前景的有机相酶催化反应，可制得性能优良的树脂材料：与甲 醛法合成的酚醛树脂相比，酶法合成的酚树脂具有结构均一、耐热性强、低电 阻等特点，有望用佧性能优良的涂料、纪录材料等，且不造成污染。 a k k a r a 1 0 】、d o r d i c k t l 1 等研究了非水介质中过氧化物酶催化酚类聚合，得到了 较高相对分子质量的酚树脂；但是，聚合时存在着酶失活较快的问题，酶的使 用周期较短，从而严重影响了酶法合成的酚树酯材料的成本和聚合度的提高。 国内上海生化所的蒋太松等人研究t p e g 修饰的辣根过氧化物酶及其在非水介 质中的性质i i2 】。通过氧化过氧化物酶( h r p ) 的糖链后引入氨基，再连接甲氧基 聚乙醇( p e g 5 0 0 0 ) 和在酶的肽链上连接p e g 5 0 0 0 ，发现h r p 多肽链上修饰后的 酶在水相中的活力几乎没有变化，但通过氧化糖链连接p e g 的酶在水相中的活 力下簿近2 倍。在甲苯及二氧六环含量较高的体系中，修饰酶活力均呈上升趋 势。特别在甲苯体系中两种修饰酶活力都比未经修饰的酶提高了近2 倍。稳定 性研究表明，不论在水相中还是在有机相( - - 氧六环或甲苯) 中，直接在h r p 多 肽链上连接p e g 5 0 0 0 都使酶的稳定性明显增加。氧化糖链连接p e g 的酶在水相 中的稳定性比没有修饰的酶高而在有机相( 甲苯或二氧六环) 中的稳定性比没有 修馋的酶低1 2 1 。 在化学发光技术上过氧化物酶也有它的应用，如h r p 就是一种具有生物放 大作用的过氧化物酶，它通常与显色底物配合使用，用于酶联免疫吸附测定 ( e l i s a ) 及其它医学检验。伍莉萍报道其实验室所配的底物溶液基本达到应用要 求，测定辣根过氧化物酶( h r p ) 的灵敏度可达到1 04 8 m o l 数量级，用于测定 d n a ，检测限低于l p g 。并发现发现不同的发光增强剂同时使用时对发光有协 同增强作用，可进一步提高测定的灵敏度i 3 1 ；并报道在c p d ( 化学发光自显影检 测法) 技术中，化学发光使x 光胶片感光显影并可以根据胶片上产生的黑斑大小 和颜色浓淡进行半定量分析。该技术测定f i r p 的检测限为0 0 8 0 4 p g ( 即2 中国科学技术大学硕士学位论文 l o m 2xl o 1 7 m 0 1 ) 。比斑点显色法灵敏度高5 0 5 0 0 倍，比半板e l i s a 灵敏 度高7 0 0 1 6 0 0 倍。在h r p 修饰电极的应用上，a n a i hl i n d g r e a 等人还报道了 一种在电极上将酶一步固定的方法【1 4 】。厦门大学的现代化学研究所在1 9 9 4 年报 道了由磁蹬酶联放大镧系螯台物发光的研究工作，使h r p 的检测限在酶联后降 低了一个数量级。并对具体反应机理作了探讨0 1 5 1 。 1 1 过氧化物酶的结构和分类 过氧化物酶属于氧化还原酶，是一种结合蛋白，其分子量范围3 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 。 如果按照辅基的结构分类，由于过氧化物酶中还有一些不含有弧铁血红 囊而悬出钒或毳硒取代铁离子。所以弧铁血红素过氧化物酶家族可以由此分 为两类定义孵确韵秘家羧，：鬃曼爨是结梅述水太清楚韵氯过氧化物酶1 6 】。但目 前已经有实验结果显示氯过氧化物酶中是含有血红素的。其中含硒过氧化物酶 一个著名的例子就是谷胱甘肽过氧化物酶，是一种含有硒代半胱氨酸 ( s e l e n o c y s t e i n e ) 的过氧化物酶。 按照其来源可以分为【1 4 p o d 广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。基于 序列相似性比较分析，可将含血红素p o d 划分成两个p o d 超家族 ( s u p e r f a m i l y ) ，一个由真菌、细菌和植物来源的p o d 组成；另一个则由动物来源 的p o d 组成 4 7 。射。日前，对于真菌、植物和细菌来源的p o d 的研究已经拓宽 到几 种，依来源水同，可将植物p o d 超家族内的成员进一步归为三类：l 类 p o d 是胞内型p o d ，包括酵母细胞色素c 过氧化物酶( c c p ，位于线粒体电子 传递链中的一种可溶性酶蛋白。主要保护细胞免受有毒的过氧化物损害) 。抗坏 血酸过氧化物酶( a p ，主要存在于高等植物的升绿体和胞液中，负责h 2 0 2 的清 除) ，和细菌来源的触酶过氧化物酶( 同时兼具过氧化氢酶和p o d 两种活力，为 细胞应激高氧化环境压力提供保护) ；l i 类p o d 是来源予真菌的胞外型p o d ，包 括各种真菌产生的木素过氧化物酶( l i p s ) 和锰过氧化物酶( m n p s ) ，在木质素的 生物降解中起重要作用；i l l 类p o d 是来源于高等植物的分泌型p o d ，参与多种 不同的生理功能，如机体内毒性过氧化物的清除，细胞壁的合成，组织愈伤， 中国科学技术大学硕士学位论文 生长素合成与代谢等，包括辣根过氧化物酶( h r p 8 ) 和烟草过氧化物酶 c r o p s ) a 多数p o d 含f e ( 1 1 1 ) 原卟l i i f 辅基，属氧化血红素蛋白质。血红素( 铁卟 啉) 的基本结构成分是由毗咯组成的卟吩，带上侧链后形成卧啉，再和一分子铁 构成铁卟啉化合物即为搬红素。有关血红素衍生物的变化均在卟啉环的侧链上 进行。血红紊作为p o d 的辅基，在这类酶蛋白中是电子传递反应的载体。血红 素在p o d 中有五种相关的氧化态：f e ( 1 1 1 - p o d 、f e ( i i i ) p o d 、c o m p o u n di 、 c o m p o u n di i 和c o m p o u n di i i ；c o m p o u n di 和c o m p o u n d1 1 分别是原酶失去2 个 和1 个电子形成的，它们的形式氧化态郝是f e ( i v ) ，c o m p o u n di 中的铁呈 f e ( i v 产o 结构。在铁氧离子中，铁呈低自旋d 4 构型，而且很可能有s = i ( 两个未 成对电子) ；丽轴向零场分裂d 为3 0 6 0 c m1 。整卟 c o m p o u n di 则以大a 阳离 子自由基形式存在i 无论是l i p 、m n p i 悖孤2 ”，还是其他来源的非特异性p o d ，其分子活性中心 均含有一个f e ( i i i ) 一原卟啉i x ( 血红素) 辅基，而且这类酶的底物特异性均较低。 f e 为第1 过渡态金属元素，具有未充满的d 电子壳层，能以多种氧化态参与生 物体内豹一系列氧化还原反应。f e 与原卟啉结合形成的血红素具有以大n 电 予共轭体系及铁原予馋套改变为基础鲍氧化还原性质，以及钱对轴向配体的配 位能力。研究表明多种血红索化合物在特定条件下都能成功地模拟p o d 的酶活 性。如s h i m a d a 等人发现氯化高铁四苯基卟啉环在叔丁基过氧化氢存在时，常 温条件下即能模拟l i p 氧化木素模型物；h a b e 等人报道血红素在室温条件下。在 h 2 0 2 或叔丁基过氧化氯存在时即可催化b 1 型化合物中c 。c b 键断裂。但血红 素不稳定，雨且不溶于中性或酸性水相系统。如何制备出结构更稳定的可溶性 血红素结构，以剩予催化反应的高效进行，这一点值得深入研究。 1 2 植物p o d 超家族 8 0 年代初，研究得到了第一个植物p o d c c p 的x 射线晶体结构，很长 时问内有关p o d f l 自结构及功能研究一直v _ , t c c v 的晶体结构为基础，近年来，相 继又获得了多个不同种类及来源p o d 晶体结构，包括来a r t h r o r a w e s 中蕾科学技术大学硕士学位论文 瑚州珊瑚和a 卿咖螂c i n e r e u s 的p o d ，来自p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 的l i p 和m n p ，以及来自豌豆等植物的p o d 旧2 0 。 妇卅训 舟卢 1 1 9 3 图1 1l i p 的活性位点局部结构及其保守残基 尽管这些p o | d 乏闻钧摩建鼹灞牲较小( 2 0 绚，但其二缀结构的折叠方式却是 高度保守的阎。p o d 分子由两个不同的结祷域组成，中间包埋着皿红素辅基， 结构域部分由1 0 1 1 个n 螺旋组成。蝶旋之间由环区和转角连接，很少有8 折叠结构。结构域中存在几个保守的g l y 和p r o 残基，决定着蛋白质主链骨架的 正确走向和蛋白分子的柔性，而r h a s p l 0 7 和a r 9 1 3 2 ( l i p ) 残基构成的深埋型盐 桥是所有p o d 中都存巍髂绦守结构，这种盐桥结构的主要作用是稳定两结构域 之闻的长环结构。i 类p o d 分子中举存在= 磷键，也不食糖基侧链积c a ；而 i i ，i 类p o d 均含有二硫键，其位置虽有差异，但数量基本相同( 4 5 个) ，赋 予了p o d 分子高度的削性结构。另外，类和m 类p o d 分子中还含有两个c a 2 + ，已由x 射线晶体结构确定了其结合位点。i i 类和i 类p o d 在其分子表面还都 具有程度不同的糖基化侧链，其具体的生物学功能有待深入研究。真菌来源的 p o d 中除l i p 的一个同功酶组分外，其余的都不含有t y r 残基，这不同于其他 p o d ( i ，i i 类) 。尽管存在上述差异，但不同p o d 家族的酶分子却都有相似的 分子折叠模式。将另一类血红素酶c y t p 4 5 0 ( 主要结构也是由a 螺旋组成) 与 p o d 进行比较分析，发现p o d 分子间具有很强的拓扑结构类似性。“等人f 2 3 j 对l i p 和c c p ( 1 5 序列同源性) 及两个c y t p 4 5 0 分子( 1 7 序列同源性) 的a 螺旋区进行比较研究，揭示l i p 和c c p 分子中n 螺旋区的c 。存在0 1 6 r i m 的原 子偏差。而两个c y t - p 4 5 0 分子中n 螺旋区的c 。却有0 。2 8 r i m 的原子偏差，后者 中国科学技术大学硕士学位论文 这种较大的结构偏差归冈于c y t - p 4 5 0 底物结合的复杂性。就p 4 5 0 而言，其底物 结合必须在血红素活性中心的疏水空穴内完成且需有准确的定向以便能与 f e ( i v ) = 旬的氧原子反应，完成底物的羟基化。而对于p o d 底物并非直接与血红 素疏水中心结合，而是由底物通过蛋白质分子向血红素辅基进行远程电子传 递，从而使p o d 自身h ；必有较大的结构变化就可适于不同类型的底物。 1 3p o d 的辅基( 血红素) 微环境 尽管p o d 分子间的序列同源性较低，但f e 的配位环境和活性位点的多数氨 基酸残基却是严格保守的。图i - i 是l i p 的活性位点局部结构及其保守残基，可 见f c 总是以近端h i s 作轴向第五个配体，近端h i s 残基眯唑环上的氮原子( n 。1 ) 与邻近保守的a s p ( l i p 的a s p 2 3 8 ) 之间存在很强的氢键作用，致使近端h i s 残基 以荷负电形式出现，与f c 配位后赋予f e 一个较低的负还原电势，从而稳定了f e 的高氧化态，这对于酶活性中间体复合物c o m p o u n di 和c o m p o u n di i 的稳定也 是必需的。相比较而言，作为氧载体的珠蛋白，其m 红素f e 具有与p o d 相同的 五配位态，但其还原电势为正，故而稳定的是f c 的还原态，在这类蛋白中近端 h i s 仪与主键羧基氧原子以微弱氧键力结台。 日前普遍认为p l ( m 酶分子韵还原电势高低( 从h r p 的- 2 7 8 m v 到m i l p 的 9 0 m v ) 由轴向配基与m 红素f c 的配位态调节口41 2 引，具体地说，是受f en 。2 键 合力决定的，而f e - n 。2 键台力的大小又是由近端h i s 与f e 之间的相对位置及距 离决定的。对于l i p 和m i l p ，其近端h i s 残基归位于3 l oo 螺旋，与c c p 的近端 h i s 相比，l i p 和m n p 分子由于其侧链s e r f 7 7 与a s p 2 0 1 之间存在很强的氢键力 而使近端h i s 残基偏离了血红素平面0 i n m ，换言之，氨键的形成迫使q 螺旋 结构远离了血红素：而c c p 分子中对应于l i p 的s e r l 7 7 位置上是一个最没有“个 性”的a l a 残基，极大地削弱了f en 。2 键合力，使血红素得电子趋势增强，从 而造成f e 的氧化态稳定性减弱。事实也是如此，实验测定r 2 6 m n p 的还原电势比 c c p 高出近l o o m v 。另外，在p o d 近端位点附近还存在一个芳香族氨基酸， i 类p o d 中该残基为t r p ，i i 、i l l 类p o d 中则为p h e 。研究其作用，发现i 类 p o d d p t r p 残基参与构成c o m p o u n di 阳离子自由基的活性位点，但对于、 类p o d ，由于相应位置上的p h e 具有过高的还原电势，h ；易被h 2 0 2 氧化，故而 中国科学技术大学硬士学位论文 不能直接参与c o m p o u n di 的形成，其阳离子自由基直接定位于j n l 红素辘基 上。 p o d 分子中j 衄红素平面上方的远端“空穴”是h 2 0 2 的作用位点，该位点包 含两个保守氨基酸残基一远端h i s 和远端a r g ，它们共同构成一个亲水性“口 袋”结构，这是p o d 不同于其他血红素蛋白的又一个结构特征：p o d 中血红素 f e 的疏水性五配位态是由远端“空穴”的特殊性质和近端h i s 残基的强配位性 共同决定的，尤其是后者使f e 偏离j 衄红素平面，从而防止了水分子从另一侧轴 向位置与m 红素f e 结合配位。另外，远端“空穴”的亲水性“口袋”结构可籍 氢键网和f en 。2 键的共同作用，稳定周周环境中的水分子，使其不能与f e 原子 结合配位。相反，对于肌红蛋白分子。虽然其远端“空穴”中也含有一个h i s 残基，但其整个“口袋”结构是高度疏水的，正是这个疏水性的“口袋”结构 诱导了周围环境中的水分子与f e 的第六个空位配位结合。值得一提的是，p o d 分子中远端“空穴”静这随夺僳寄残萋国翻和榭在簿中圆体复合物c 衄p o 岫d i 的形成和稳定方面起重要作用：c o m l m m ll 的形成要求p o d 分子远端h i s 残 基必须是去质子化形式，以便能够接受来自外源h 2 0 2 的质子，而远端h i s 去质 子化形式的稳定则依赖于该h i s 残基的n 。1 与a s n 8 4 及g l u 7 8 的羰基氧三者之间 的氯键作用在所有p o d 中，这两个位点的残基( a s n 8 4 ，g l u t 8 ) 是高度保守 的；远端a r g 保守残基的作用目前认为主要有两个，一是加快质子向远端h i s 的 传递以促进h 0 2 与血红素铁的结合；二是在o 旬键断裂时，a r g 的胍基可移迸远 端“空穴”与c o m p o u n di 和c o m p o u n di i 的f e = o 形成氢键。籍此稳定中间体 结构，这已由c c p 的c o m p o u n di 晶体结构和定点突变实验结果所证实【2 7 l 。 对现有的p o d 晶体结构研究发现，在血红素活性位点附近至少存在4 个排 列有序的水分子，其中3 个定位于远端“空穴”中，并与邻近的亲水性氨基酸 残基形成广泛的氢键蚓( 图i - 2 ) ，籍此将远端h i s ，远端a r g ，血红素的丙酸根侧 链及就近的亲水性氮基酸残基联结起来：另一个水分子位于近端并与近端a s p 形 成氢键，这些水分予都其有一定的削性结构，分子力学( m o ) 模拟的结果与x 射 线晶体学研究的结果基本一致【“。另外，利用核磁共振( n m r ) 技术研究溶液酶 分子构象，包括c c p ，l i p ，m n p 和c i p ，发现即使是溶液状态中的酶分子也保 持了晶体结构中检测刭的近端和远端h i s 及远端a r g 残基的定位状态1 中国科学技术大学硕士学位论文 图1 - 2 木素过氧化物酶( l i p ) 血红素活性位点附近的氢键网( 虚线部分表示氢键) 1 4 底物结合位点和c a 2 + 的作用 p o d 的底物特异性受多种厮素影响，其中酶复合物中f 萨o r + 中心的还原电 势最为重要。该电势由酶蛋白分子与血红素辅基间的共价作用和静电作用共同 决定，其中共价作用主要是由轴向配体与血红素毗咯氮原子间形成共价键能力 大小决定，这在所有p o d 中是基本相同的。另外，蛋白分子中荷电残基所产生 的局部静电场亦对还原电势产生影响。与底物特异性密切相关的另- 重要因素 是酶蛋白分子的结构特性。它们催化底物与过氧化氢或其他过氧化物反应的时 候，电子供体的种类取决于酶自身的性质。比如辣根过氧化物酶就有很丰富的 底物因为它有着一个开放的易接近的活性位点，很多化合物都可以到达这个 反应位点。而细胞色素c 过氧化物酶而言可以作为电子供体的化合物则很少，具 有特异性，因为它有个闭合的活性中心。酶蛋白分子的结构决定了底物、中介 体和某些不溶性底物大分子的特异性结合位点，研究表明酶蛋白是通过分子表 面拓扑结构的微小变化和少数氨基酸残基的改变控制着反应底物的特异性，这 些微小的变化对蛋白质的分子折叠和二级结构不会产生很大影响p 0 】。 在i i 类和i h 类p o d 分子中都含有两个具有维系结构作用的c a 2 + ，且两个 c a 2 + 结合位点在全部真菌和植物来源的p o d 中高度保守口2 】。其中一个结合位点 定位于近端结构域内，由五个氨基酸残g - ( s e r l 7 7 ，a s p l 9 4 ，a s p l 9 6 ，u e l 9 9 和 a s p 2 0 1 ) 主链及侧链上的八个氧原子构成，这五个氨基酸残基在i i 类、类 p o d 中也是高度保守的。由于该结合位点是溶剂不可及( 疏水) 的，所以可以预 中国科学技术大学硕士学位论文 辩豫娃黪妒结合应是非常紧密的。另一个c 孑+ 结合位点定位于远端结构域 内，r h g l y 6 6 - s e r 7 0 ( g l y 6 6 。a s p 6 8 ，s e r 7 0 ) 主链及侧链上的七个氧原子，缸p 4 8 主链及侧链上的两个氧原子和两个水分子共同构成，其位置靠近分子表面且是 溶剂可及( 亲水) 的，故而此处的c a 2 + 结合较为疏松。真菌和植物来源的p o d 中 远端c a 2 + 结合位点的同源性也是较高的，四个相关氨基酸残基中有三个完全相 同。 目前认为，p o d 分子中的这两个c a 2 + 的主要作用是维系并稳定酶活性中心 结构。与c a 2 + 配位的氨基酸残基都分属于形成远端和近端位点的螺旋，且每个 c a 2 十均有一个配位残蒸紧邻予远端或近端组氨酸。对于植物来源的p o d ，去除 其中的c a 2 + 会明显降低酶催化活力，尤其是c o m p o u n di i 的还原效率，同时也 还会改变铁的氧化还原性质。从而也影响c o m p o u n di 的还原效率。n m r 研究 结果 3 1 1 也表明c a 2 + 对酶活性中心结构起着稳定作用。 1 5 辣根过氧化物酶和烟草过氧化物酶的研究进展 p o d 中阻魏搬过氧化物薅a 髑哥，h m , s e r , d i s hp c m x i d a s e ，e c1 1 1 1 7 ) 的结 构和作用枫毽虢巍褥较必透彻口2 i 。在含铁p o d 中也有代表性，它代表一大类非 特异性的p o d 。h r p 为结合了氧化血红素的糖蛋白。除f e 外每分子中还含有两 个c a 2 + 。肤链由3 0 8 个氨基酸组成。另有8 个糖链( 占分子质量的1 8 哟分别与 1 3 、5 7 、1 5 8 、1 8 6 、1 9 8 、2 1 4 、2 5 5 和2 6 8 位的a s h 残基连接，它们分布在分 子表面。肽链n 末端为一个毗咯烷酮羧基所封闭。c 末端为s e r 。不同来源的 厨类型p o d 的氨基酸组成相似，这类p o d 的活性中心除f e ( i i i ) 原卟啉基 本结构外，辕向琵体一个是 驻s 4 2 觞睬睫氮，另一个位置是空的( 也可能有水分 子疏松配位) ，由此两催褥轴量s 曲2 的高自旋态。该空位与和它相对的h i s 的 咪唑基共同起调控铁的反应性的作用，有实验证明h i s - n 。h 或失去质子、或通 过氧键与底物结合。这一解质子作用可能在使p o d 稳定在高氧化态中起作用。 关于烟草过氧化物酶的结构目前只有一些简单的报道，i r m ago a z a r y a 等人 详细研究了它的反应机理，夏炳乐提纯了它的两种同工酶，并对其激活剂、抑 制荆以及它们的光谱学性质以及分子生物学性质傲过报道。 9 中国科学技术大学硕士学位论文 由于予它们在术质化吲、细庭分化【3 4 】、细胞壁信道链接的引导【3 ”、i 从新 陈代谢、抗病性及抗虫性p 力中可能扮演极其重要的作用。过氧化物酶的催化 机理一直是人们研究的一个热点。a n d e r s o n 等人【站瑚用动力磁场效应研究了 h r p 的中间化合物，认为h r p 循环反应的立体结构可用图1 3 表示。刘均洪等 用辣根过氧化物酶催化木素与酚在反相微乳液系统中进行了共聚反应，实验显 示辣根过氧化物酶内部的氢键结构发生改变砷l 。 对于反应中间体的存在勿庸置疑，种种实验手段都证明了它的存在，但中 间体到底是何种结构，却众说纷纭。d u n f o r d h “，h a u n 1 6 4 2 等人都认为在中 性和酸性溶液中化合物i 的形成过程如下所示 h 2 p h p p + h 2 0 2 一h r p i ， 不i 霹构是，二人在速控步骤上有争议，后者认为在形成h r p - i 之前还有一 个有七种可能鳞梅鹤讫奢豁瓣j 辩猩翟，著器班7 疆氧他耪酶的转化步骤【3 1 1 详细 内容可参阅文献。 过氧化物酶修饰电极在h 2 0 2 芳香胺、酚类、葡萄耱等物质的测定中有着很 重要的作用，所以近年来得到了较为广泛的研究和发展1 4 3 “4 5 1 。人们还研究 了i l l 冲在生物电极上的生物电催化还原机理。h r p 在电极表面上被氧化形成中 哺h i 3 ) h 2 c - , 、 o 眦尸h + 啪弋 ，篡c - c 譬 。毫：) = ：= c 嶙i c - - c c 口_ n p c u n di 图1 - 3 ，辣根过氧化物酶的催化循环 间化合物i 和i i ，h 2 0 2 直接从电极上得到电子而被还原( 直接电子转移) ，或者 从氧化还原媒介物上得到电子而被还原( 间接电子转移) ，这两种电子转移方式 也可能同时发生【4 5 。4 6 1 ，两种方式得到的还原电流都和过氧化物的浓度有关。而 1 0 器 气 零 中嗣科学技术大学硕士学位论文 且，刍过氧化物浓度很高时，h r p 可能形成一种不活泼的形式化合物( 氧化态 为+ 6 ) 检禊9 最简单的h r p 修饰电极，是在基体电极表面吸附上一层h r f 分子构 成。h r p 电极在催化循环过程中发生的反应如下： h r f ( f e ”) + h 2 0 2 一c o m p o u n d = i( 1 ) c o m p o u n d - i + a h 2 - - c o m p o u n d - i i + a h ( 2 ) c o m p o u n d - i i + a h 2 一h r p ( f e 3 4 ) + a h + h 2 0 ( 3 ) 当把此电极放入待测样品中，并保持电极电位低于6 0 0 m v ( s c e ) 时，h r p 氧化 反应的中间化合物从电极上得到电子而被还原，还原电流与h 2 0 2 的浓度成比 例，同时要保证溶液中必须有h 2 0 2 存在 4 r l 。在这种条件下，h r p 与电极之间的 电予是直接转移的( 图1 4 ) 堋一9 1 。 h r p 反应中间体他合物i 和化合物l i 更常见的还原方式，是从底物上得到 电子，过程如图1 5 所示。 珏t p 催化反应形成的氧化产物取决于底物( 电子供 体) 的性质。芳香胺类及酚类等电子供体，在氧化后形成自由基a h ；有的底 物如六氰合铁酸盐i i ( h e x a c y a n o f e r r a t ei i ) 失去一个电子或碘离子失去两个电子 后，并不形成自由基。电子供体被氧化后形成的产物( 自由基a h ) ，可再发 生如下反应f ： a x a h - a h ，+ a a h + a h 一a h a h ah + i - 一p o f y me b 其中f e ”为h r p 的辆因子，a h 2 为电子供体，常为芳香胺或酚类化合物。 a h 为氧化后产生的自由基。反应中h r p 被h 2 0 2 或低分子量的有机过氧化物 氧化，失去两个电子生成中间化合物i ( 氧化态为+ 5 价) ，该中间体含有一个氧 铁键( f e 饥电) 和一个卟啉阳离子；在随后的反应中，化合物i 从第一个电子供体 a h 2 上得到一个电子，被还原为中间化合物( 氧化态为“价) ：在最后一步反 应中，中间化合物i i 从第二个电子供体a h 2 上又得到一个电子，至此h r f 被还 原为初始状态。a n n i k al i n d g r e n 等人报道了过氧化氢在h r p 修饰的电极上的直 接还原过程，并发现在这个生物电还原过程q ，h r p 的催化性能更佳【4 7 1 。 中国科学技术大学硕士学位论文 凰l 毒渚 鳓趣蔽上间接生物电催化还原机理 在光度分析中，h r p 的氢供体底物主要有三类：苯酚类衍生物，苯胺类衍 生物和各种染料的隐色体，它们在h r p 催化下被h 2 0 2 氧化为配式结构而发色。 而在荧光分析中，人们不仅利用h r p 催化反应测定环境样品中微量h 2 0 2 ，还可 用作酶促偶联反应体系中的指示反应，或间接检测多种氧化还原酶、辅酶和一 些底物的含量等等。这种快速、专一、较高灵敏度的检测方法在荧光分析中具 有重要意义。牡建云、m o h a n t yj g 在前人的工作基础上，从h r p 催化不同底物 引起的荧光淬灭或增强入手，对酶催化反应的实质进行探讨并提供了一个新的 思考角度1 5 ”“。 过氧化物酶也可以被用作生物探针。近年来由于在探针上固定后的酶可重 复使用，稳定性好，对抑制荆和激活剂的敏感性降低，比较经济滔加上酶本 身的特效反庶性和灵敏度，辣根过氧化物酶修饰电极得到了较为广泛的研究和 发展。它在h ：0 2 、芳香胺、酚类、葡萄糖等物质的测定中有着很重要的作_ 用， 中国科学技术大学硕士学位论文 这为酶啦敬提供7 广阔的应用前景。w o i m a l 眈r g e r 、t a t s u m a 等人制冬了h r p 聚 毗略膜电极，提出了聚吡瞎的作用。王雅琴将介体对甲酰苯基二茂铁( f p f ) 与辣 报过氧化物酶( h r p ) 共价结合，然后同单体毗咯一起电浆合到铂电极上，再通 过戊二醛将葡萄糖氧化酶(