（分析化学专业论文）改性壳聚糖磁性微球的制备、表征及应用研究.pdf

桂林工学院硕士学位论文 摘要 磁性高分子微球是一种由f e 。0 4 粒子和高分子材料复合形成的新型功能材料。磁性高分 子微球的性能主要体现为磁响应性和表面功能基团的反应性。本文将天然高分子壳聚糖和 f e 。0 粒子结合制备壳聚糖磁性微球，具有重要的学术意义和应用价值。壳聚糖磁性微球因 将其表面改性可以赋予多种与活性物质反应的特殊功能基团，同时又因其具有顺磁性，在 外加磁场作用下能快速分离，使原来昂贵、低效的分离技术变为低廉、高效。改性壳聚糖 磁性微球作为新型的功能高分子材料在精细化工、环境监测、固定化酶、靶向药物、细胞 分离等领域有着广泛的应用前景。 本文合成了两种磁性高分子微球，并分别应用于血液灌流和固定化酶方面，获得令人 满意的结果，其主要的研究内容和结论如下： ( 1 ) 以( n t h ) ：f e ( s m ) ：6 h ：o 、n 儿f e ( s 仉) z 1 2 h 。0 和壳聚糖为原料，经羟丙基化、胺基化， 采用一步包埋法制备了一种多胺基化壳聚糖磁性微球。通过正交实验法确定了磁性微球的 最佳制备条件，即搅拌速度1 2 0 0 r m i n ，壳聚糖用量3 0 9 ，环氧氯丙烷用量2 5 m l ，乙二 胺用量2 5 m l 。并用i r 、t g 、x r d 和s e m 对其结构及形貌进行了表征，结果表明：f e 。m 磁性粒子已包埋了一层多胺基化壳聚糖。磁性微球胺基含量为2 3 0 2 m m o l g ；基本呈球形， 平均粒径为2 0 9 r i m ，且具有顺磁性和良好的耐酸性。 ( 2 ) 以具有良好生物相容性的多胺基化壳聚糖磁性微球为载体吸附胆红素，研究了 其在不同p h 、温度、离子强度、初始浓度、牛血清白蛋白等条件下，对胆红素的吸附性能 的影响。结果表明，该磁性微球对胆红素具有良好的吸附性能。 ( 3 ) 以( n h ) ：f e ( s o , ) 。6 h 2 0 、n h f e ( s m ) ：1 2 h ：0 和壳聚糖为原料，经羟丙基化、c u ( ) 螫合，采用一步包埋法制备了c u ( i i ) 螯合壳聚糖磁性微球。通过正交实验法确定了磁性微 球的最佳制备条件：搅拌速度1 2 0 0 r m i n ，壳聚糖用量3 o g ，环氧氯丙烷用量1 o m l ， c u c l ：2 h ：00 o l o m o l ，并用i r 、t g 、x r d 和s 删对其结构及形貌进行表征，结果表明：f e ，嘎 磁性粒子已包埋了一层c u ( ) 螯合壳聚糖，基本呈球形，平均粒径为2 4 0 h m ，且具有顺磁 性。 ( 4 ) 针对当前固定化酶载体和固定化方法的不足，本文以c u ( i i ) 螯合壳聚糖磁性微 球用作固定化胃蛋白酶的载体，讨论了固定化时间、p h 值和给酶量对固定化的影响。最适 固定化条件为：固定化时间l h 、p h 4 5 、给酶量1 5 0 m g g 载体。与自由酶比较，固定化胃 蛋白酶催化特性和稳定性均令人满意。 ( 5 ) 将磁性固定化胃蛋白酶初步应用于牛奶的水解，结果表明其对牛奶水解有一定 的催化作用，水解的最佳条件为：磁性固定化胃蛋白酶的添加量1 5 0 9 、水解p h 4 0 、水 解温度6 0 、水解时间2 h 。 关键词壳聚糖磁性微球；改性制备：表征；性能；应用 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t m a g n e t i cp o l y m e rm i e r o s p h e r e s ( m p m s ) a r eak i n do fn o v e lf u n c t i o n a lm a t e r i a l s t h e m a g n e t i cr e s s p o n s i v i t ya n dt h er e a c t i v i t yo ft h es u r f a c ef u n c t i o ng r o u p sa r em a i np r o p e r t i e so f m a g n e t i cc o m p o s i t ep o l y m e rm i c r o s p h e r e s m a g n e t i cc l l i m s a nm i e r o s p h e r e sa l ev a l u a b l ei n t h e o r e t i c a la n da p p l i c a t i o na s p e c t s t h e yc a l lb ea p p l i e da sc a r r i e rb e c a u s eo f t h er e a c t i v i t yo f t h e s u r f a c ef u n c t i o ng r o u p s i nt h ep r e s e n c eo fm a g n e t i cf i e l dm a g n e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sc a n i n c r e a s ee f f i c i e n c yo fs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yf o rp a r a m a g n e t i s m b yt h i s m e a n s ，p e o p l ec a n a c h i e v eac h e a pa n dc o n v e n i e n ts e p a r a t i o ni nm a n ya s p e c t s m a g n e t i cc h i t o s a nm i e r o s p h e r e sc a n b eu s e dw i d e l yi nf i n ec h e m i c a li n d u s t r y , m o n i t o r i n go f e n v i r o n m e n t ，i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e ， t a r g e tm e d i c i n e ，c e l li s o l a t i o n t w ok i n d so f d i f f e r e n tm p m sw e r es y n t h e s i z e da n du s e di nh e m o p e r f u s i o na n di m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e t h es a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e d t h em a i ne x p e r i m e n t sa n dc o n c l u s i o n so f t h i sp a p e rw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) ak i n do f m u l t i a m i n a t e dc h i t o s a nm a g n e t i cm i e r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e db y ( n h 4 ) 2 f e ( s 0 4 ) 2 。6 h 2 0 ，n h 4 f e ( s 0 4 ) 2 1 2 h 2 0a n dc h i t o s a nb a s ei n t e r m e d i a t e ，t h r o u g h h y d r o x y l p r o p y la n da m i n a t i o n t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r es t u d i e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h e s t r u c t u r ea n dm o r p h o l o g yo f m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ec h a r a c t e r i z e d b ym e a n so f i i lt g x r da n ds e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf e 3 0 4p a r t i c l e sw e r ee m b e d d e db ya m i n a t e dc h i t o s a n t h em a g n e t i cm i e r o s p h e r e s a m i n e - g r o u pc o n t e n t sw e r e2 3 0 2 m m o 垤a n dt h e yw e r e p a r a m a g n e t i ca n da c i d - r e s i s t a n ts p h e r e sw i t l l2 0 9 r i m ( 2 ) m u l t i a m i n a t e dc h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r c sc a l lb eu s e da st h eb l o o da d s o r b e n t b e c a u s eo f i t sg o o db i o l o g i cc o m p a t i b i l i t y t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r e ，p hv a l u e , b o v i n es e n l n l a l b u m i n0 3 s a ) ，i n i t i a lc o n c e n 仃a t i o na n di o n i ci n t e n s i t yo nm u l t i a m i n a t e dc h i t o s a nm a g n e t i c m i e r o s p h e r e sf o rb i l i r u b i nw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em a g n e t i c m i c r o s p h e r e sh a v et h eg o o da d s o r b a b i l i t yf o rt h eu n c o m b i n e db i l i m b i n ( 3 ) ak i n do f c u ( i i ) c h e l a t i n gc h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw a sp r e p a r e db y ( n h a ) 2 f e ( s 0 4 ) 2 6 h 2 0 ，砥l d ：e ( s 0 4 ) 2 1 2 h 2 0a n dc h i t o s a nb a s ei n t e r m e d i a t e ，t h r o u g h h y d r o x y l p r o p y la n dm e t a lc h e l a t i o n t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw c t es t u d i e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s t h es t r u c t u r ea n dm o r p h o l o g yo f m a g n e t i cm i c r o s p h c r e sw 盯ec h a r a c t e r i z e db y m e a n so f l r , t qx r da n ds e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf e 3 0 4p a r t i c l e sw e r ee m b e d d e db y c u ( i i ) c h e l a t i n gc h i t o s a n 1 1 l c yw e r ep a r a m a g n e t i cs p h e r e sw i t h2 4 0 h m ( 4 ) b a s eo nt h et e c h n o l o g yo f p r o t e i ns e p a r a t i o n 埘t l li m m o b i l i z e dm e t a li o na f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ( 龇c ) ，am e t h o df o ri m m o b i l i z a t i o no f p e p s i nh a sb e e ns e l e c t e d c l l ( 1 i ) c h e l a t i n gc h i t o s a nm a g n e t i cm i e r o s p h e r e sw e r e u s e da sc a r r i e ri m m o b i l i z i n gp e p s i n i tw a st h a t 桂林工学院硕士学位论文 a c t i v i t yo f p e p s i ni m m o b i l i z e dw a se f f e c t e db y s o m ef a c t o r si n c l u d i n gi m m o b i l i z e dt i m e ，p h ， a l z y r f l e d o s a g ea n dt e m p e r a t u r e 1 1 他o p t i m u mi m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so f e n z y m ew e r e a s f o l l o w s ：t i m e l h ，p h 4 - - 5 ，e n z y m el o a d1 5 0 m g gc a r r i e r s ，r e s p e c t i v e l y t h ep h a n dt e m p e r a t u r e w c l ep h 4 0 a n d6 5 f o ri m m o b i l i z e de n z y m e 1 1 1 ee n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n dc a t a l y s i s c h a r a c t e r i s t i c so f t h ei m m o b i l i z e dp e p s i nh a db e e ns t u d i e d c o m p a r e dw i t hf r e ep e p s i n ，t h e r e s u l t sw e r es a t i s f a c t o r y ( 5 ) t h eo p t i m u mh y d r o l i z a t i o nc o n d i t i o n si nm i l kb ym a g n e t i ci m m o b i l i z e de n z y m ew e q r e i n v e s t i g a t e d ：p h4 o ，t e m p e r a t u r e 6 0 c ，r e a c t i o nt i m e 2 ha n d t h ea m o u n to f m a g n e t i ci m m o b i l i z e d e n z y m e l 5 0 0 9 k e yw o r d ：c h i t o s a nm a g n c t i cm i c r o s p h e r e s ；m o d i f i e dp r e p a r a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；p r o p e r t i e s ； a p p l i c a t i o n m 桂林工学院硕士学位论文 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在”教授指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并致以了谢意。 学位论文作者( 签字) ： 立殉立；一一 签字日期：堑2 ：2 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求 提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目 录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以 赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者( 签字) ： 皇蜀亟 指导教师签字： 丝i = ! ! 至 签字日期：立翌丑! ：! ! 桂林工学院硕士学位论文 第一章引言 磁性高分子微球是指通过适当的方法使用有机高分子与无机磁性物质结合起来形成的 具有一定磁性及特殊结构的微球。磁性高分子微球的研究始于7 0 年代，它除具有高分子微 粒子的特性，可通过共聚及表面改性等方法赋予其表面多种反应性功能基团( 一o h 、- c o o h 、 一c h o 、一n h z 、一s h 等) ，还因具有磁性，可在外加磁场的作用下方便迅速地分离。与传统的 分离技术相比，该方法将分离与富集结合于一体，其较大的比表面积大大提高了分离过程 中反应物之间相互作用的动力学速度，具有高效、快速、非玷污的优点。磁性高分子微球 已广泛应用于磁性材料、生物医学、生物工程、有机与生化合成等方面。近年来适应不同 要求的磁性高分子微球已成为一个新的研究热点。本文将就磁性高分子微球的制备及在分 析化学中的最新研究进展作一介绍。 1 1 磁性高分子微球的结构类型及特点 1 ，1 1 磁性高分子微球的结构类型 磁性高分子微球由两部分组成：具有导向性的核层( 磁核) 和具有亲和性、生物相容 性的壳层，其结构一般有四种类型，即：核一壳型、壳一核型、壳一核一壳型和镶嵌型( 如 图1 - 1 ) 。 o 核一壳型 壳一核型壳一核一壳型 镶嵌型 图1 - 1 磁性高分子微球的结构类型 f i 9 1 1t h ec l a s s i f i c a t i o no fm a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s 核一壳型是金属或金属氧化物组成核，高分子材料组成壳层；壳一核型是高分子材料 为核，磁性材料为壳层；壳一核一壳型是结构的外层和内层均为高分子材料，中间层为磁 性材料；镶嵌型是磁性材料均匀地镶嵌于高分子微球的孔穴中。 制备磁性高分子微球通常应用的磁性物质有：纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、正铁酸盐、 铁钴合金等，优以f e 舢磁流体居多。与磁性材料结合的高分子材料中天然高分子材料有壳 聚糖、明胶、纤维素、淀粉等，合成高分子材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚 苯乙烯等。其中天然高分子材料因具有价廉易得、生物相容性好、可被生物降解等优点， 得到了广泛的研究和应用 1 1 2 磁性高分子微球的特点 1 1 2 1 小粒径效应 桂林工学院硕士学位论文 由于磁性高分子微球的粒径足够小，所以比表面激增，官能团密度及选择吸附能力变 大，可以在细胞水平上产生有效的治疗。 1 1 2 2 磁响应性 磁响应性即磁性高分子微球对外加磁场的反应。利用此特性，在外加磁场作用下，磁 性高分子微球可以方便进行分离和磁性导向。磁性高分子微球中磁核的含量是反映微球磁 响应性的个重要参数，磁核含量为微球总重量2 0 一5 0 为最佳。当作为磁核的金属氧化 物粒子的直径小于3 0 n m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强磁性，没有磁场时磁性很 快消失，便于操作控制。 1 1 2 3 生物相容性和生物降解性 在生物医学领域中生物相容性和生物降解性是磁性高分子微球应用的重要方面。 1 1 2 4 功能基团特性 磁性微粒包覆的高分子材料带有多种具有反应活性的功能基团，如c h o ，o h ，c o o h ， n h 2 等，可与具有活性的物质进行连接。 1 2 磁性高分子微球的制备 1 2 1 磁流体的制备 磁性流体是借助于表面活性剂的作用，将磁性超微粒子分散到载液中形成的稳定的胶 态体系。目前磁流体的制备方法较多，如中和沉淀法、氧化沉淀法、还原沉淀法、水热反 应法、化学共沉淀法等。其中最常用的为化学共沉淀法和氧化沉淀法。 1 2 1 1 化学共沉淀法 该法是目前最普遍使用的方法。它是将二价铁盐和三价铁盐溶液以2 ：1 ( 或更大) 比 例混合。在一定温度和p h 值下加入过量( 如3 倍) 的n h 。h 2 0 或n a o f f ，高速搅拌进行沉淀，然 后将其沉淀洗涤、过滤、干燥、烘干，制得纳米f e n 颗粒，其反应式如下： f e ”+ 2 f e + 8 0 r ，f e 3 0 , + 4 1 t z 0 s h c h u k i nd g 等”1 用高分子电解质与无机物先形成核壳结构。经碱液处理，形成一个微球 型反应器，再浸泡于c o “、m n ”、z n ”、f e 盐与f e “盐的混合液中，制得了c o f e ：o 、 t n f e ：o 、 z n f e z o | 、f e ，0 等磁性微粒。z a i t s e vvs 等在微反应器中将f e ”与f e ”离子溶液用氨水共 沉淀，制得了平均半径为5 7 r i m 的f e 3 0 , 。共沉淀法最大的难题是如何生成分散的纳米f e ，o | 粒子并使其不团聚。为此许多学者通过在f e ，q 。粒子生成后，加入表面活性剂包覆微粒表面 等手段对共沉淀法进行了改进，以达到减少团聚的目的。y o n g k a n gs u n 等人。1 采用部分限 2 桂林工学院硕士学位论文 制共沉淀法，在没有使用任何表面活性剂也没有采用氮气保护，只是向酸化了的磁性纳米 悬浮液中通入空气进行氧化的情况下，制备了平均粒径为7 1 3 n m 的纳米f e 。0 。j u nw a n g 等人“1 提出在磁场中制备的磁性纳米f e 3 0 其饱和磁化强度更大。他们采用化学共沉淀法并 将反应器放置在一个磁场中央来制备，所制得的纳米f e 。0 。饱和磁化强度高达1 5 3 a m 2 k g ， 而未加磁场情况下制得的纳米f e 。0 。只有6 5 9 m s k g 。 1 2 1 2 氧化沉淀法 所谓氧化沉淀法，即是在碱性条件下向起始悬浮液f e ( o h ) ：中通入空气或加入其它氧化 剂，将部分f e ”氧化为f e ”。其反应式如下： 3 f e ”+ 4 0 厂+ 0 2 + f e 3 0 , + 2 h 2 0 ( p h 7 ，t 5 0 c ) l a iq i o n gy u 等人”通过向f e ( o h ) ：悬浮液体系中加入质量分数为1 0 的h ：o ：而制得了粒径 范围为8 - 1 0 h m 的f e a o 磁性纳米微粒。李发伸等在近中性条件下，利用h 2 0 2 氧化f e ( 0 h ) ： 胶体，成功制备了f e s o 磁性微粒，t e m 图象表明样品为球形颗粒，直径大小约为1 8 r i m ，且 分布均匀、磁响应性强。 1 2 2 磁性高分子微球的制备 就其制备方法而言，主要有包埋法、单体聚合法、化学转化法等。 1 2 2 1 包埋法 包埋法是制各磁性高分子微球最早的一类方法。它是运用机械搅拌、超声分散等方法 使磁性微粒均匀分散于天然或合成高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得 到磁性高分子微球。由于磁性f e , o 为亲水性微粒，所以包埋的高分子一般也要为亲水性分 子，否则很难将磁性微粒完全包裹。包埋法得到的磁性高分子微球主要是通过范德华力、 氢键、配位键或共价键等作用，使得高分子链缠绕在f e 。o 。颗粒表面，形成聚合物包被，得 到磁性高分子微球。t a n y o l a c 等”1 采用包埋法和改进的溶剂蒸发技术制备了成球性较好的 粒径1 2 5 - 2 5 0 1 m 的磁性聚乙烯醇缩丁醛微球，用于吸附牛血清白蛋白，其容量达到1 3 8 m g g 颗粒。v o i g t 等。1 利用胶囊技术制备了粒径可控制的磁性微米纳米载体。安小宁等啪将磁 粉和n a o h 溶液混合均匀后，加入壳聚糖溶液，包埋磁粉，然后调节p h ，以戊二醛交联， 制得包埋磁性壳聚糖微球。 包埋法制备磁性高分子微球简单方便，且颗粒表面本身所含的活性功能基团得以保留。 但此法所得的磁性高分子微球颗粒大小难以控制、粒度分布宽、形状不规则、颗粒的磁性 不均匀，且壳层中常含有乳化剂等杂质。 i ，2 2 。2 单体聚合法 由于包埋法存在诸多缺陷，能制得粒径分布较窄，规整球形的单体聚合法应运而生。 桂林工学院硕士学位论文 单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，根据不同的聚合方式加入引发剂、表 面活性剂、稳定剂等物质聚合制备磁性高分子微球的方法。单体聚合法合成磁性高分子微 球的方法主要有悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合( 无皂乳液聚合和种子聚合) 、辐射聚合等。 单体聚合法成功的关键在于确保单体的聚合反应在磁粒表面顺利进行。因为很多有机单体 疏水性很强，难以与磁核的亲水表面紧密结合，所以往往要对磁粒表面进行预处理，使其 表面具有一定的疏水性，或适当改变聚合体系的有机组成，以利于聚合的进行。s p a n o v a 等“用分散聚合法合成了磁性聚2 一羟乙基甲基丙烯酸甲酯一乙烯基二甲基丙烯酸甲酯微 球，并将此微球用于沙门氏菌的免疫磁性分离与测定。m a r i a 等“”采用悬浮聚合法合成了 磁性聚苯乙烯一二乙烯基苯微球，并具有较好的磁响应性和悬浮稳定性。r b e t a n c o u r t - g a l i n d o 等“4 用浮液聚合法制备了磁性聚苯乙烯微球，并对聚合条件进行了详 细地研究。s h u n c h a og u 等“”采用无皂乳液聚合法也制成了磁性聚苯乙烯微球，此微球具 有很好的单分散性。 1 2 2 3 化学转化法 化学转化法是指先合成均一的多孔有机聚合物微球，微球中含有- c 1 ，- c h o ，一n o 。， - c o o h ，一s o 棚等官能团，均匀地镶嵌于微球的表面和孔洞中，然后将此合成出来的带有多 孔的高分子微球浸渍在定浓度的f e “和f e ”离子混合液中，使聚合物微球在铁盐溶液中溶 胀，渗透，再升高p h 值，可得到铁的氢氧化物，最后升温到适当的温度，即可得到含有f e 。o 。 微粒的磁性高分子微球。m a n c h i u m 等“”以苯乙烯、二乙烯基苯为原料，过氧化苯甲酰为引 发剂，十二烷基磺酸钠为乳化剂合成出带有多孔的聚苯乙烯微球，将此微球用化学转化法 处理后，得到粒径均匀、悬浮性好的磁性高分子微球。吴雪辉等“”采用大孔树脂，将f e c i ： 和f e c i 。渗透到树脂内部，然后加入n a o h 溶液，制备得到磁性强，粒度分布均匀的磁性大孔 树脂。w a n g 等“”利用化学沉积法制得了苯乙烯共聚丙烯酸磁性微球，用t e m 及x r d 观察了这 种微球的结构，并且测量了这类磁性微球的介电性能。得出n i 磁性微球比c o 磁性微球磁化 性能好，两种微球的居里点t c 比相应的本体金属颗粒的居里点要低，且n i 磁性微球在热力 学过程中不易聚集。根据它们的磁化率和滞后回线可知该铁磁性微球为软磁体，其介电性 能的减少随着电阻的减少而变化。 该方法与上述方法比较，具有以下几个优势：( 1 ) 因在磁化过程中，单分散聚合物微 球的粒径和粒径分布不变，因此最终所得的磁性高分子微球具有良好的单分散性；( 2 ) 具 有超顺磁性的无机微粒均匀地分散在整个聚合物微球中，且每个微球含有相同浓度的磁性 微粒，从而保证所有磁性高分子微球在磁场下具有致的磁响应性；( 3 ) 可以制备各种粒 径的致密或多孔磁性高分子微球，且可制备磁含量大于3 0 的高磁含量微球。 除了以上介绍的制备方法，有些学者还尝试了新的方法制各磁性高分子微球，如界面 沉积法、生物来源法、声化学法等。a v i v i o ”用两种新型声化学方法合成了磁性蛋白微球， 一种以水为溶剂，另一种以萘烷为溶剂，并对其性质进行了讨论。 4 桂林工学院硕士学位论文 1 3 磁性高分子徽球的表征 磁性高分子微球的各项特征，如平均粒径、粒径分布、磁含量、磁响应性及耐酸碱性 等，需要用不同的仪器和实验方法进行表征。为了进一步探讨反应机理，对磁性高分子微 球进行必要的表征显得尤为重要。 i 3 i 磁性高分子微球形貌、结构及组成分析 ( 1 ) 用红外光谱法测定微球表面功能团性质。此方法通过测得各种吸收峰，从而确定 高分子微球的化学组成以及内核外壳的成分。 ( 2 ) 用原子吸收仪可以测定微球中金属的含量。 ( 3 ) 用热重分析仪进行磁性物质含量的测定。 ( 4 ) 用原子发射光谱测定磁性微球中金属的含量。 ( 5 ) 用元素分析仪测定磁性微球的c 、h 、n 的含量。 1 3 2 平均粒径及粒径分布 粒径及粒径分布是衡量磁性高分子微球的一个重要指标。目前，对聚合物乳液的制备 而言，最常用的粒径测定方法有以下六种：光散射法、消光法、肥皂滴定法、离心法、电 子显微镜法、水动力色谱法。利用前三种方法，能测得磁性高分子微球的平均粒径；而利 用后三种方法，除了可以得到其平均粒径外，还可以得到粒径分布。最常用的方法是电子 显微镜法和光学法。电子显微镜法主要包括透射电镜( t e m ) 和扫描电镜( s e m ) 两种。t e m 是结合电子衍射技术研究物质的形态和结构，并采用计算机控制和处理图像，得到清晰的微 观结构图，其分辨率可达0 i n m 。t e m 可以观察到纳米粒子的大小及分布，但是测量结果缺 乏统计性。进行t e m 观察的样品要很薄，以使电子能穿透过，一般厚度要低于5 0 0 h m ，面积 大于i c m xl o c m ，如果是细粒，就要配成悬浮胶液，然后在试样铜栅上做成薄胶膜。s e m 主 要用于表面形态的观察，可以直接观察实体样品，结果更接近实际情况，进行s e m 分析的样 品制作简单，通常用乳状液或分散相。但是研究更微观的结构方面不及t e m 好，两者可以相 互取长补短。光学方法主要有激光脉冲全息法、衍射法和光散射法等几种，光学法具有适 用范围广、重复性好、精密度高、不接触样品、测量时间短等优点，还易于同计算机配合， 实现测量过程和数据处理的自动化。 i 3 3 磁含量 磁含量是磁性高分子微球的另一个重要的指标，即复合微球中磁性物质的含量。磁性 高分子微球磁含量的测定方法大致可分为灼烧法、比色法和原子吸收光谱法三种，其中灼 烧法和原子吸收光谱法是目前广泛采用的。 i 3 4 磁响应性 s 桂林工学院硕士学位论文 目前对于磁性高分子微球磁响应性的测定还没有一个较成熟的方法。采用较多的是定 性描述磁响应性“强”或“弱”。在一定磁场下，用沉降一定距离所需的时间表示磁性微球 的磁响应性一般将微球的水悬浮液置于0 0 5 t 磁场中，测定微球沉降距离磁场的性质、 梯度的大小及作用时间、样品的浓度等都是影响磁导向的直接因素。无外加磁场时，用沉降 一定距离所需时间表示磁性微球的分散性。 1 3 5 表面功能基团含量 当磁性高分子微球用于细胞分离、工业分离、分析测定等领域时，总希望其单位表面 积含有更多的功能基团，因此对磁性高分子微球表面功能基团的测定显得尤为重要。目前 磁性高分子微球的表面功能基团含量几乎都采用电导滴定的方法。 1 3 6 耐酸碱性 磁性高分子微球耐酸碱性的测定，多用一定浓度的盐酸或氢氧化钠溶液，对所制备的 磁性高分子微球进行一定时间的浸泡，然后用分光光度法或原子吸收光谱法测定浸泡液中 的铁含量，从而来评价磁性高分子微球的耐酸碱性。 1 4 磁性高分子微球在分析化学中的应用进展 当今分析化学发展的一个特点就是研究越来越与环境科学和生命科学挂钩，工作环境、 大气、室内环境和环境水质中对生命有害的痕量物质的分析检测以及生物样品的分离分析 变得尤为重要，磁性高分子微球在分析化学中的应用，极大地提高了分析检测的灵敏度和 准确度。目前它已成为分析科学研究的一个重要领域。本文就磁性高分子微球在电化学分 析，免疫分析、分离分析等分析化学中的应用研究进展作详细介绍。 1 4 1 在电化学分析中的应用 磁性高分子微球作为新型的功能高分子材料，与环境、药物、微生物等中的痕量待测 物作用，利用其在磁场作用下快速的分离富集和高灵敏的电化学分析方法相结合，使其分 析方法的选择性好、灵敏度高，引起了国内外研究的极大地重视。b l i n gy a n g 等“”合成了 一种新型的在其表面含有酮基的磁性高分子微球，与肼反应生成电活性的加合物，并聚集 在磁性电极上，在- 1 0 6 v 处有一个明显的还原峰，在0 3 - 5 0 0 p g l - 1 区间可以被定量测定， 检测下限为0 1 仙g l - 1 ，对于测定1 0 0 斗g l - 1 肼相对标准偏差为2 4 3 。此方法被应用到测定环 境样品中的肼得到满意的效果。杨明、力虎林o ”应用自制的带酰肼基团的磁性高分子微球 与甲醛反应生成具有电活性衍生腙，并在磁性电极上聚集、还原，利用产生的峰电流值测 定甲醛含量。洪小平、彭图治啪1 采用分散聚合法制得粒径均匀、磁响应性强，其表面含有 丰富羧基的磁性高分子微球，并将其用于富集水溶液中的痕量的阿霉素，并在自制磁性电 解池中，用金膜电极进行电化学检测，其检测下限比常规方法降低了两个数量级。 6 桂林工学院硕士学位论文 1 4 2 在免疫分析中的应用 免疫分析是利用抗体与抗原之间的特异性，用抗体检测抗原或用抗原检测抗体的分析 方法。磁性分离大大加速和简化了免疫物质的分离过程。由于抗原抗体的特异性好，故损 失小分离纯度高。以磁性高分子微球为基础的免疫磁性分离( i m s ) 技术不但广泛应用于 医学、生物学的各个领域，而且在分析检测方面的应用也崭露头角。y u 等”“利用免疫磁性 分离一荧光免疫分析技术，不进行过滤等预处理，直接对环境水样本进行检测。用该方法 能快速有效地探测环境水样中的e c o l i0 1 5 7 ：h 7 ( 2 1 0 3 个细胞1 ) 和s e b ( 1 0 n g m 1 ) 。 st u 等发明了一种快速灵敏的方法用于测定埃希氏大肠杆菌( e c o i l0 1 5 7 ：h 1 7 ) ，它是 利用磁性免疫分离和酶标记相结合，在温度3 7 、4 6 小时可测得小于l c f u g 的埃希氏大 肠杆菌。f c a p u a n o 等1 采用免疫磁性分离和聚合酶链反应相结合快速测定了牛奶中 c o x i e l l ab u r n e t i i 的含量。sk u m r 等将磁性免疫分离一聚合酶链反应( i m s p c r ) 相结合用于测定食物和环境水样中的沙门氏菌，灵敏度达到1 0 5 个细胞l 。 1 4 3 在分离富集中的应用 混合物中各组分的分离是分析化学要解决的课题，随着分析方法朝着快速、微量、仪 器化的方向发展，某些经典的化学分离方法如蒸馏、重结晶、萃取等己远不能适应现代分 析的需要。尤其是在生物科学领域，许多需要保存生理活性的微量成分( 如蛋白质、肽、 酶、核酸等) 存在于组成复杂的生物样品中需要进行分离分析。磁性微球因具有磁性，在 磁场作用下迅速从周围介质中分离出来或定向运动到特定部位，比起常用的分离方法来。 磁性微球在这一领域显示出了引人注目的应用前景。 1 4 3 1 固定化酶 酶是一种具有催化活性的蛋白质，对生物体内的物质代谢具有重要作用。但由于在分 离过程中酶的结构和活性容易遭到破坏，使它的催化作用受到很大影响。固定化酶是指利 用物理吸附或化学界合法将自由酶固定到载体上，以提高酶的操作稳定性和反复回收利用 酶的技术。磁性高分子微球作为酶固定化的载体具有以下优点：有利于固定化酶从反 应体系中分离和回收，操作简便；固定化酶可重复使用，降低成本；可以提高酶的稳 定性；可以改善酶的生物相容性和免疫活性。k o s e k os 等将谷氨酰胺酶固定在甲壳素、 壳聚糖和f e ，0 组成的磁性壳聚糖微粒上面，用于在柱式反应器中催化水解反应，该酶可连 续使用4 次，使用时问达到7 2 h 。m i n - h u n gl i a o 等将酵母醇脱氢酶磁性高分子微球上， 与未固定的酶相比，保留了6 2 的活性，增加了1 0 倍的稳定性。r i t t i c h 等聊比较了自由 和固定化酶的活化条件固定化酶的最大活化p h 值低于自由酶，而且可以多次重复使用 h a nl e i 等嘲合成了含羧基的磁性微球，并用于固定化木瓜蛋白酶，固定化酶和自由酶相 比，酶的活性、p h 稳定性、热稳定性、储存稳定性都有较大提高。l m b r u n o 等例将脂肪 7 桂林工学院硕士学位论文 酶固定在磁性聚乙烯醇徽球上，使固定的生物催化剂可循环利用7 次并保持具有活性，而 且当实验缺少合适的温度或p h 时固定化酶比溶解酶有较好的p h 和热稳定性。 1 4 3 2 细胞分离 细胞的标记与分离是磁性高分子微球最早的应用研究之一磁性高分子微球通过免疫 逻辑反应或非免疫逻辑反应，可以分离不需要的细胞( 消极选择) ，或富集所需要的细胞( 积 极选择) 。如把单克隆抗体与磁性微球结合可将磁性微球直接地连接到肿瘤细胞上，利用外 加磁场就可将结合的肿瘤细胞与未结合的正常骨髓细胞分离开。美国、英国已将这一技术 应用于临床。k o n d oa 等在超细的含羧基热敏性磁性高分子微球上，用碳二亚胺法将牛血 清白蛋白共价结合，形成热敏性磁性免疫微球，高效率地从抗血清中免疫亲和纯化抗牛血 清白蛋白抗体。j h u n u 等。”用外源凝结素分别修饰聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球，通 过实验发现两者都有分离红细胞的能力，白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的效率 高得多。w e d e m e y e rn 等人嘲将高分子磁性微球结合不同的d n a 从而可以达到经济快速分离 各种不同的细胞的目的 1 4 3 3 离子交换分离 离子交换分离是利用离子交换树脂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分 离。磁性离子交换树脂具有许多一般的离子交换树脂所不具备的优点。只要在流体出口处 设置适当的磁场，树脂即可被收集，以便再生和循环使用。张梅等呻1 利用化学转化法制 ! 寻 了磁性毫米级和微米级粒径的强酸性、弱酸性阳离子交换树脂，所制得的磁性树脂的磁性 强，磁性物质分布均匀且稳定，并保持树脂的原有特性。y o u n gk y u nk i m 等m 1 合成了一种 新型的磁性离子交换树脂，在p h 4 o - 1 0 3 较宽范围内，可高效地除去废水中镉离子，并且 具有较好的选择性和回收性。吴雪辉等采用磁性大孔树脂，利用磁性颗粒的易分散和易 收集特性，在连续式离子交换床中对糖液进行脱色，脱色效果好，运行可靠。m a r t i nc 等1 制备了一种新型的磁性聚苯乙烯- _ - 7 , 烯基苯离子交换树脂，并研究了其对氨基酸的平 衡吸附。 1 4 3 4 核酸( d n a ) 分离，提纯 核酸技术的使用大大优化了生命科学上的制备和诊疗过程。样品制备的质量，尤其是 d _ n a 分离的效果，是衡量d n a 技术的基本标准。经典的d n a r n 矗分离方法有柱分离法和一 些包括沉积、离心步骤的方法，这些方法的缺点是耗时多，难以自动化，不能用于分析小 体积样品，分离不完全使用磁性高分子微球进行核酸分离可避免这些局限。o s t e r t m 使用 含f e 3 0 。6 0 、非特定蛋白质结合率低的卜p v a 磁珠，从l u l 、l o u l 、l o o u l 、l o m l 血液中 分离d n a ，产率很高。其中l o m l 新鲜血液中d n a 产量大约有2 0 0 3 0 0 。此外，他还将m p v a 磁珠羧基化后进行以下处理： 8 桂林工学院硕士学位论文 。洲+ r c r 一。0 8 。苎n 、n h r r o ” 0 芒n g 。 o + r n h g 、n h rr n h 小n h r 5 - - n h o l i g o 用于核酸杂化测定或含特定序列核酸的提纯，可自动操作和重复使用，产物纯度高。 1 5 本课题的主要研究内容和意义 壳聚糖是自然界唯一大量存在的碱性多糖，来源广泛，具有很好的生物相容性，且容 易改性，是开发生物医学高分子吸附材料的理想原材料。本文针对血液净化中吸附剂和固 定化酶载体所具有的缺陷，对壳聚糖分子上的一n h 2 和一0 h 进行化学改性，引入增加吸附能力 或具有选择性吸附的功能基团，进一步拓展了壳聚糖应用领域。 本课题分别合成了多胺基化壳聚糖磁性微球、c u ( ) 螯合壳聚糖磁性微球，并将它们 分别应用于血液灌流( 胆红素的吸附) 、固定化酶( 固定化胃蛋白酶) 和牛奶的水解研究中。 本课题的研究意义在于： ( 1 ) 血液灌流是通过采用合适的医用亲和吸附剂