（微生物与生化药学专业论文）大肠杆菌dna复制相关蛋白pric的初步研究.pdf

北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：扛堑拯日期： 型! ：羔：墨2 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 导师签名： 垫黔坠日期：塑! f ：毒：兰f 日期：一皇u ：型 学位论文数据集 中图分类号 q 7 8 学科分类号 1 8 0 17 1o 论文编号 1 0 0 10 2 0 1 1 1 2 6 8密级 公开 1 0 0 1o 学位授予单位名称 北京化工大学 学位授予单位代码 作者姓名 孔敏敏 学号 2 0 0 8 0 0 l2 6 8 获学位专业名称 微生物与生化药学 获学位专业代码 10 0 7 0 5 课题来源 国家自然科学基金 研究方向 蛋白晶体学 论文题目 大肠杆菌d n a 复制相关蛋白p r i c 的初步研究 关键词 p r i c ，p r i c i 1 0 l ，州b ，相互作用 论文答辩日期 2 0 1 1 0 6 0 3，论文类型 基础研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称工作单位 学科专长 指导教师 王文雅副教授 北京化工大学 生物化工 评阅人1 郑国钧教授 北京化工大学 化学合成 评阅人2 李强副教授 清华大学 生物化工 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席 徐家立 研究员 中科院微生物所 生物化工 答辩委员1 徐家立 研究员 中科院微生物所 生物化工 答辩委员2 马光辉 研究员 中科院过程所 生物化工 答辩委员3 张铁锐 研究员 中科院理化所 生物化工 答辩委员4 刘春朝 研究员 中科院过程所 生物化工 答辩委员5 王建军 副研究员 中科院微生物所 生物化工 二中图分类号在( ( 中国图书资料分类法查询。 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t 13 7 4 5 9 ) ( ( 学科分类与代码中 查询。 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 一 一 一一一 摘要 大肠杆菌d n a 复制相关蛋白p ri c 的初步研究 摘要 大肠杆菌d n a 复制是以半不连续方式进行，滞后链的复制引发 是由引发体( p r i m o s o m e ) 参与完成的。大肠杆菌里，目前至少有两 种引发体己经得到确认，分别是d n a a d 印e n d e n t 埘m o s o m e 和 p r i a d 印e n d e n tp r i m o s o m e 。p r i a 、p r i b 、p r i c 、d n a b 、d n a c 、d n a t 和d n a g 共同参与了p r i a d 印e n d e n tp r i m o s o m e 的组装。目前，关于 p n c 的表达及其功能了解的很少，为了研究其在引发体的生物学功能 及其作用机制，本课题在大肠杆菌中诱导表达了p d c ，经n i 柱亲和层 析纯化获得的蛋白稳定性较差，易沉淀。根据二级结构和蛋白稳定性 预测及限制性蛋白酶水解结果，构建了p r i c 的截短突变蛋白p r i c l - l o l ， 经n i 亲和层析和s u p e r d e x 7 5 纯化，获得了稳定性较好的蛋白，经 w r e s t e mb l o t 鉴定为目的蛋白。p r i c l - 1 0 1 的圆二色谱分析发现其具有较 多的仅- h e l i x 和无规卷曲，这为更好的了解其结构奠定了重要的基础。 为了研究p d c 与p r i b 是否存在相互作用，将p e t 2 l a p r i c - n o t a g 与 p e t 2 8 a t p l u s p r i b 分别转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中，诱导表达及 共纯化发现p r i c 与p r i b 存在相互作用，并且p r i c 的稳定性有所提高。 通过全长p r i c 及p r i c l 1 0 1 分别与p r i b 的p u nd o w n 结果发现，p r i c 蛋 白的c 端氨基酸序列是p r i c 蛋白与p n b 蛋白相互作用的主要区域， 并对p r i c 蛋白的稳定性有较大影响。 一 北京化工大学硕士学位论文 = 二二- 二_ = = = = 二一一 关键词： 蛋白p d c ，蛋白p r i c l - l 蛋白p r i b ，相互作用 i i p r e l i m i n a r ys t u d yo fp r i c ，ap r o t e i ni n v o i v e di n 西c ，i p r f c 办f 口c d ，f d n a r e p l i c a t i o n a b s t r a c t t h ed n a r 印l i c a t i o ni ne c d ，fi ss e m i d i s c o n t i n u o u s ，a n dt h ep r o c e s s e s o fr e p l i c a t i n go ft h el e a d i n ga n dl a g g i n gs t r a n d sa r eq u i t ed i 仟e r e n t p r i m i n go f t h el a g g i n gs t r a n dr e p l i c a t i o ni sa c c o m p l i s h e db yp r i m o s o m e i ne c d z f ， d n a a d 印e n d e n tp r i m o s o m ea n dp r i a d e p e n d e n tp r i m o s o m e w e r ei d e n t i f i e d a st w od i 骶r e n tp r i m o s o m e s p r i a 、p r i b 、p r i c 、d n a b 、d l i l a c 、d n a ta n d d n a g p a r t i c i p a t ei nt h ea s s e n l b l i n go f t h ep r i a - ( 1 印e n d e n tp r i m o s o m e a tp r e s e n t ， t h e r ei s1 i t t l ei n f b n ：i l a t i o n 2 l b o u tt h ee x p r e s s i o na n d 如n c t i o no fp r i c t b i n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a l 如n c t i o na n dm e c h a n i s mo fp r i c ，r e c o m b i n a t i o n e x p r e s s i o np l a s m i dp e t 2 1a p r i cw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o m e di n t oe ，f b l 21 ( d e 3 ) p r i cp 面f i e dt h r o u 曲n ic h e l a t i n gs 印h e r o s ew a si n s t a b l ea n d e a s i l yp r e c i p i t a t e d a c c o r d i n gt ot h ep r e d i c t i o no f t h es e c o n d a 巧s t r u c t u r ea n d t h er e s u l to fl i m i t e dp r o t e o l y s i se x p e n m e n t ，p e t 2 1a p r i c 1 10 1w a sc o n s t r u c t e d a n dt r a n s f o n n e di n t oec d 厅b l 21 ( d e 3 ) p r i c 1 1 0 l w a sp u r i f i e db yn i c h e l a t i n gs 印h e r o s ea n ds u p e r d e x 7 5 p r i c w a ss t a b l e a n di d e n t i f i e db y w e s t e mb l o ta s s a y p r i c1 1 0 l w a sb a s i c a u yc o n s i s t e do f 仅一h e l i xa n d r a n d o m c o i lb vc dd e t e c t i o n i no r d e r t oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r i ca n d p r i b ，p e t 2 la p r i c n o t a ga n dp e t 2 8 a t p l u s p r i bw e r et r a n s f o n n e di n t o e c d 疗b l 2 l ( d e 3 ) s e p a r a t e l y ，a n di n d u c e df o re x p r e s s i o n b yc o p u r i “c a t i o no f p r i ca n dp r i b ，t h ei n t e r a c t i o nw a sd e t e c t e db e t w e e np n ca n d p r i b t h e s t a b i l i t y o fp r i cw a s i m p r o v e d c t e n n i n a la m i n oa c i d so fp r i cw e r e i d e n t i f i e da st h em a i na r e ai n t e r a c t e dw i t hp r i b ，t h r o u g ht h e p u l l d o w na s s a y s b e t w e e np r i c 、p r i c l lo la n dp r i b ，s e p a r a t e l y t h i sa r e aw a sa l s oi m p o r t a n tt o t h es t a b i l 时o fp r i c k e yw o r d s ： p r i c ，p r i c l 1 0 l ，p r i b ，i n t e r a c t i o n i v l i j 止 。一 目录 第一章绪论l 1 1p r i m o s o n l e s 的简介l 1 1 1d n a a d e p e n d e n tp r i m o s o m e l 1 1 2p r i a d e p e n d e n tp r i m o s o m e 二 1 2 蛋白纯化方法1 6 1 4 1 2 1 凝胶过滤j q 1 2 2 离子交换层析4 1 2 3 基因工程构建的纯化标记4 1 2 4 亲和层析一3 1 3 研究目的和研究方法b 第二章p r ic 蛋白的克隆、表达和纯化9 2 1 前言一了 2 2 实验材料了 2 2 1 主要仪器一了 2 2 2 实验试剂一了 2 2 3 菌株、质粒一儿 2 3 方法l j 2 3 1 引物的设计与合成一 2 3 2 目的片段的p c r 扩增1 3 2 3 3 重组质粒p e t 2 1 a p r i c 的构建1 4 2 3 4 目的基因的转化1 4 2 3 5 阳性克隆的筛选与鉴定l b 2 3 6 质粒的测序分析 2 3 7 重组质粒的诱导表达“ 2 3 8p r i c 蛋白的表达纯化1 8 2 4 结果2 0 2 4 1p c r 产物u 2 4 2 2 4 3 2 4 4p r i c 蛋白的表达纯化2 2 2 5 讨论2 3 第三章p ric h 。，蛋白的克隆、表达与纯化2 5 3 1 前言2 5 3 2 实验材料2 5 3 2 1 主要仪器 3 2 2 实验试剂 3 2 3 菌株、质 3 3 方法 3 3 1 引物的设计与合成 3 3 2 目的片段的p c r 扩增 3 3 3 重组质粒p e t 2l a p r i c h 。 3 3 4 目的基因的转化 3 3 5 阳性克隆的筛选与鉴定 3 3 6 质粒的测序分析 3 3 7p r i c h 。蛋白的表达纯化 3 3 8p r i c 卜i o l 蛋白w e s t e r nb l o 2 7 2 7 的 2 9 3 0 3 0 t 分析3 2 3 3 9p r i c 。蛋白圆二色谱分析3 3 3 4 结果3 3 3 4 1p c r 产物3 3 3 4 2 重组质粒的双酶切鉴定3 4 3 4 3 测序结果3 4 3 4 4p r 3 4 5p r 3 4 6p r 3 5 讨论 i c h 。，蛋白的诱导表达 i c i - l0 i 蛋白的w e s t e r n i c 。蛋白的圆二色谱 及纯化3 5 b l o t 分析3 6 分析3 7 3 7 第四章p ri c 及其突变体p ri c h 。，与p ri b 之间相互作用的初步分析3 9 4 1 前言3 9 l l 加 虬 定 一 鉴 一 切 一 酶 一 双 一 的 粒果 质结组序重测 鹪四 建 一 构 一 i ? 素 4 2 实验材料3 9 4 2 1 主要仪器3 9 4 2 2 实验试剂3 9 4 2 3 菌株与质粒4 0 4 3 方法4 1 4 3 1p e t 2 l a p r i c n o t a g 的构建4 1 4 3 2p e t 2 8 a t p l u s p r i b 的构五墼4 1 4 3 3p e t 2 l a p r i b n o t a g 的构建4 l 4 3 4p r i b 与p r i c n o t a g 相互作用分析4 4 4 3 5p r i c h 。与p r i b 的相互作用分析4 6 4 4 结果4 6 4 4 1p c r 产物4 7 4 4 2 重组质粒的双酶切鉴定4 8 4 4 3 重组质粒的测序分析5 0 4 4 4p r i b 与p r i c n o t a g 的相互作用5 3 4 4 5p r i c 。与p r i b n o t a g 的相互作用5 4 4 5 讨论5 5 第五章分析讨论5 7 参考文献5 9 附录缩略语表6 3 致谢6 5 研究成果及发表的学术论文6 7 作者及导师简介6 9 i i l 一 北京化1 人+ 、m f ! 卜一f j ，i 仑文 二一 i v j 求 。一一 c o n t e n t s c h a p t e r l in t r o d u c tio n 1 1 1i n t r o d u c t i o no f p r i m o s o m e s l 1 1 1d n a a d 印锄d e n tp r i m o s o m e ”l 1 1 2p r i a d 印伽l d e n tp r i m o s o m e z 1 2m e t h o d so f p r o t e i np u r i f i c a t i o n 【1 6 】4 1 2 1s i z eo f m o l e c u l a r ”q 1 2 2h y d r o p h o b i c 时q 1 2 3p u r i f i c a t i o nt a gb yg e n e t i ce n 舀n e e r i n g 4 1 2 4a 瓶n i 婶) 1 3s i 朗i f i c a i l c eo f t h es t u d y 。， c h a p t e r 2c l e 、e x p r e s s j o na n dp u ri f i c a ti o no fp ri cp r o t e i n 9 2 1p r e f a c e y 2 2e x p 甜m e i l t a lm a t 甜a l s y 2 2 1i n s t m m e n t s 9 2 2 2r e a g e l l t y 2 2 3s t r a i n sa n dp l a s m i d s j l 2 3m e t h o d s l j 2 3 1d e s i g n 柚ds ”h e s i z a t i o no f p n m e r s l j 2 3 2p c r 仔a 舯e n t sa m p l i f i c a t i o n “l j 2 3 3c o n s t r u c t i o no f p e t 2 1 a - p r i c ”j 4 2 3 4t r a n s 衔o f p c r 仔a g m e n t s 。1 4 2 3 5i d e n t i f i c a t i o no fp o s i t i v ec l o n e s l ， 2 3 6s e q u e n c i n ga n a l y s i so f r e c o m b i n a t i o n l 7 2 3 7h d u c e m e n ta n de x p r e s s i o no f r c c o m b i n a n tp l a s m i d 1 7 2 3 8e x p r e s s i o n 锄dp u f i f i c a t i o no fp r i cp r o t e i n l8 2 4r e s u l t s 2 0 v l j j i f 匕f ij 、f 癜l j f t 论文 2 4 1r e s u l to f p c r 2 0 2 4 2e n z y m ed i g e s t i o ni d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i d 2 0 2 4 3s e q u e n c i n gr e s u l t 2l 2 4 4e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f p r i cp r o t e i n 2 2 2 5d i s c u s s t i o n 2 3 c h a p t e r 3c io n e 、e x p r e s sio na n dp u rific a tio no fp ric 卜1 们p r o t ein ：5 3 1p r e t r a c e 。2 5 3 2e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ”2 5 3 2 11 1 1 s t n l l l 】e n t s 2 5 3 2 2r e a g e n t 2 6 3 2 3s 仃a i n s 、p l a s m i d sa n di m m u n o a s s a yr e a g e n t 2 6 3 3m e m o d s ”2 7 3 3 1d e s 咖卸ds y t h e s i z a t i o no f 蹦m e r s 2 7 3 3 2p c r 丘a g r n e n t sa m p l i 6 c a t i o n ”2 7 3 3 3c o n s t m c t i o no f p e t 2 1 a - p r i c l - l o l ”2 8 3 3 4t r a n s 蠡。ro f p c r 仔a g m e n t s + 2 9 3 3 5i d e n t i f i c a t i o no f p o s i t i v ec l o n e s 2 9 3 3 6s e q u e n c i n ga n a l y s i so f r e c o m b i n a t i o n 3 0 3 3 7e x p r e s s i o na n dp u n f i c a t i o no f p r i c l 1 0 lp r o t e i n 3 0 3 3 8w e s t 锄b l o ta n a l y s i so f p r i c l 1 0 lp r o t e i n 3 2 3 3 9c dd e t e c t i o no f p r i c l 1 0 ip r o t e i n 3 3 3 4r e s u l t s 3 3 3 4 1r e s u l to f p c r 3 3 3 4 2e n z y m ed i g e s t i o ni d e n t i f i c a t i o no f i e c o m b i n a n tp l a s m i d 3 4 3 4 3s e q u e n c i n gr e s u l t 3 4 3 4 4e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f p r i c l 1 0 lp r o t e i n 3 5 3 4 5w e s t e n lb l o ta n a l y s i so f p r i c i 1 0 lp r o t e i n 3 7 3 4 6c d s p e c t n j ma n a l y s i so f p n c i 1 0 lp r o t e i n 3 7 3 5d i s c u s s i o n ：3 7 c h a p t e r 4p r e iimin a r ya n aiy siso ft h ein t e r a c tio nb e t w e e np ric a n dp rib ，p ric 1 1 0 1a n dp rib 3 9 v i i 二史 4 1p r e f a c e 3 9 4 2e x d e r i m e n t a lm a t e r i a l s 3 9 4 2 1i n s t l l l m e n t s 3 9 4 2 2r e a g e n t 3 9 4 2 3s t r a i n sa n dp l a s m i d s 。4 0 4 3m e t h o d s ：4 1 4 3 1c o n s t r u c t i o no f p e t 2 l a p r i c n o t a g 。4 l 4 3 2c o n s t m c t i o no f p e t 2 8 a t - p l u s p r i b 4 l 4 3 3c o n s t r u c t i o no f p e t 2 1 a - p r i b n o t a g 4 l 4 3 4i n t e r a c t i o na n a l v s i so f p r i ba n dp r i c n o t a g 4 4 4 3 5i n t e r a c t i o na n a l y s i so f p r i c l 1 0 la n dp r i b 4 6 4 4r e s u l t s 。4 6 4 4 1r e s u l to fp c r 4 7 4 4 2e n z y m ed i g e s t i o ni d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a j l tp l a u s m i d 一4 8 4 4 3s e q u e n c i n gr e s u l t 5 0 4 4 4i n t e r a c t i o no f p r i ba n dp r i c n o t a g 5 i 4 4 5i n t e r a c t i o no fp r i c l 1 0 l 与p r i b n o t a g “5 4 4 5i ) j s c u s s i o n 5 5 c h a p t e r 5d is c u s sio n 5 7 r e f e r e n c e 5 9 a p p e n d ixb r e via r y 6 3 a c k n o wle d g e m e n t 6 5 r e s u l to ft h es t u d ya n da n n o u n c e dp a p e r 6 7 in t r o d u c t ；o no fa u t h o ra n dt u t o r s 6 9 v l i 1 1p ri m o s o m e s 的简介 第一章绪论 d n a 复制是一个复杂的过程，不是瞬间能完成的，在空间和时问上是井然 有序的生物化学反应过程。它以亲代d n a 分子的两条链为模板，合成各自的互 补链，形成两个子代d n a 分子。d n a 是以半不连续方式进行复制的。以3 5 方向的亲代链为模板的前导链的合成方向总是与复制叉行进方向一致，因此前导 链的合成通常是连续的。以5 3 方向亲代链为模板的后滞链的合成以不连续 的方式进行，需要在复制叉上反复地起始d n a 的合成。反复起始合成的d n a ， 先以短片段形式，然后再连接成长的d n a 链【l 。2 】。 在原核细胞内，大肠杆菌( 西幽p 一幽记，f ) 中的d n a 复制需要引发体 ( p r i m o s o m e ) 、r n a 引物( i 斟a p r i m e r ) 、单链d n a 结合蛋白( s i n 酉e s 仃a n d e d d n a - b 砌i n gp r o t e i n ，后称s s b ) 以及d n a 聚合酶( d n a p 0 1 y m e r a s e ) i ，i i i 参 与。引发体作用在d n a 复制的后滞链( l a g g i n gs t r 觚d ) ，负责确认d n a 复制的 起始点并解开双链螺旋，以及合成r n a 引物( p r i m e r ) ，s s b 负责抓住单链d n a ( s i n 西争s t r a n d e dd n a ) ，并避免单链d n a 再形成双链d n a 。d n a 聚合酶i ，i i i 负责完成d n a 延长作用。大肠杆菌里，至少有两种引发体已经被确认了，分别 是d n a a d 印e n d e n tp r o m o s o m e 和p r i a d 印e n d e n tp r i m o s o m e i 引。在j 下常成长的条 件下，大肠杆菌会利用d n a a 引发体执行d n a 的复制。 1 1 1d n a a d e p e n d e n tp r ；m o s o m e d n a a d e p e n d e n tp 石m o s o m e 又称伽c 型态。e c d 厅复制的引发最初出现在 d 厂f c ( 大肠杆菌的染色体起点，c h r o m o s o m a lo r i 西n ) 位点，d c 上有一小片段 序列可提供d n a a 确认和结合，称为d n a a b o x 【4 1 ，或称a 区。它以a ，t 居多， 有九个碱基对，序列为t t a t c c a c a 。 首先d n a a 在a t p 作用下与d 厂f c 的4 个d n a ab o x 结合，d n a a 复合物的形 成促使d n a 成环围绕着复合物，之后h u ( h i s t o n e l i k e ) 蛋白质和r n a 聚合酶 加入d n a 复制过程，活化d n a a 起始作用。接着d n a c 和d n a b 就加入d n a 复 制过程，其中d n a c 负责引导d n a b 进入d n a a d 印e n d e n t 研m o s o m e ，d n a b 负责 打开双链d n a ( 5 3 端) 形成复制叉( r 印l i c a t i o nf o r k ) 。d n a g 又称为引发酶 ( p r i m 笛e ) ，主要作用是在后滞链进行冈崎片段( o k a z a k i 如舯e 1 1 t ) 的合成， d n a 聚合酶i i l ( d n ap o l y m e r a s ei i ih o l o e n z y m e ) 在j j i 导连和后滞链上，合成 d n a 进行d n a 的延长作用( e 1 0 n g a t i o n ) 。d 以c 的d n a 复制作用最后还需要 d n a 聚合酶i ( d n ap o l y m e r a s eih o l o e n z y m e ) 与连接酶( “g a s e ) 的参与，完 成d n a 的复制【5 】o t 。，2 3 鞠 t t a t 2 稳5a r a r2 3 霸 矗 亨 tc 珏押g c g c2 1 垂 e 召 6 c a t z 罩，s 6 蝣 2 3 4 5 c g 3 矗 彳、b l o 、譬矿 势射龇争。 2 籀。瑚- 1 一g 惜口_ r 如t 一 卜 - t o 一 一云：j c 一， 图l - 1p r i m o s o m e a s s e m b l ys i t e ( p a s ) 的二级结构 f i g 1 - ln es e c o n d 哪s t n l c n l r eo f 蹦m o s o m e 心s 锄b l ys i t e 1 1 2p ri _ d e p e n d e n tp ri m o s o m e 当大肠杆菌的复制叉受损时，需要进行修复才能再重新启动d n a 的复制， 这时p 以引发体的复制系统扮演非常重要的角色。这个引发体的复制系统，第 一次被发现于大肠杆菌罩的噬菌体巾x 1 7 4 的单链d n a 复制过程中。单链d n a 结合蛋白质结合环状噬菌体巾x 1 7 4 的单链d n a 后，p r i a 负责先确认并且结合 发卡结构的引发体组装区，形成p r i a 和p a s 复合体之后，引发p r i b 、p r i c 和 d n a t 的结合，进而启动3 5 端的d n a 解旋功能，双链的p a s 会变成单股，并 且带领引发体沿着单链d n a 进行3 5 端移位作用( 1 r a n s l o c a t i o n ) 。p r i a 移位置 换了结合在d n a 单链上的s s b 蛋白，克服s s b 对d n a b 和d n a g 的抑制作用。 p r i b 会结合上p r i a p a s 复合体，可以稳定p r i a p a s 并帮助d n a t 与复合物的结 合睁8 1 。d n a t ，像一个锚抓住两个解旋酶，一起稳定引发体与单链d n a 复合体， d n a t 则会引导d n a b 的加入。然后p r i c 可以加入这个复合体，p r i c 的功能跟p r i b 很类似，实验中显示p r i c 的存在并不是必须的，但p r i c 的存在却会增加r n a p r i m i n g 的合成速度达三到四倍。在p r i a b c d n a t - p a s 的形成后，会引导 d n a c d n a b 的加入。d n a c 为m o n o m e r 形式，在a t p d 印e n d e m 的反应下，借由 2 一一一 奶一0 绪i 仑 a t p 与d n a c 的结合稳定d n a c d n a b 复合体。当d n a c 把d n a b 传送到 p r i a b c d n a d n a 复合体之后，d n a c 会通过a t p 水解，离开引发体。d n a c 是 引发体蛋白质中唯一没有参与d n a 复制到最后的蛋白质副。d n 扭以h e x a m e r 形式作用在引发体组装过程中，借由d n a c 的引导进入引发体，个d n a b 会与 六个d n a c 作用形成b 6 c 6 复合物f 1 钮3 1 。d n a b 已经被证实是细胞复制叉的d n a 解螺旋酶，通过a t p 分解，促使双链d n a 解链，与p m 不同的是，d n a b 拥有 5 3 端的d n a 解螺旋活性。d n a g ，冈崎片段引发酶( o k a z a l 【i 触舯e n tp r i m a s e ) ， 在p r i a b c d n a b t 复合体结合，并且合成r n a 引物去与d n a 聚合酶i i i 作用， 在后随链上进行d n a 的合成，最后还需要d n a 聚合酶i 与连接酶的参与，完 成d n a 的复制【1 2 1 4 2 4 1 。 西圄 瓣黔l d l