（植物病理学专业论文）芒果畸形病病原菌鉴定与病原菌的gfp基因标记.pdf

删嬲 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所节交的学位论文，是本人在导师的指导卜独立进行研究i ：作所取 得的成果。除文中已经注明引川的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已往文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 多建篷日期：；l o o 年莎月多日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南人学关丁收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部fj 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被奄阅和借阅。本人授权海南人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有天数据库进行检索可以采刚影印、缩印或扫 描等复制手段保存利汇编本学1 ：c 7 ：论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南人学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：善近迢 日期：知f 。年多月日 导师签名： 日期：劫扣年月多日 本人已经认真阅渎“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学何论 文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权j ； 。同意论文提交后滞后：西卜年：口一年；口二年发布。 论文作者签名： ? 多砭超 日期：；驴p 年多月g 日 导师签名： 日期：跏 摘要 芒果畸形病( m a n g om a l f o r m a t i o nd i s e a s e ) 是世界性芒果重要病害，根据受害部位 不同，芒果畸形病可分为营养器官畸形和花序畸形，畸形花序几乎不能结果，严重时可 导致果树发育不良，植株矮小，产量锐减。该病害在国外芒果产区发生日益普遍，危害 渐趋严重，但目前尚无有效的防治措施。国外报道，芒果畸形病由镰刀茵侵染引起，不 同地区病原镰刀菌种类有所不同。在国内，该病在四川攀枝花和云南华坪芒果园已有发 生为害，个别果园为害严重，有蔓延趋势，国内对此病害的病因尚未明确。为明确国内 芒果畸形病病原，以便为防治提供理论依据和为今后开展更深入的研究工作奠定基础， 本论文对发生在我国四川和云南的芒果畸形病开展了病原学研究，并对其中一个菌株做 了绿色荧光蛋白( g f p ) 基因标记。研究结果如下： 1 、首次明确层出镰刀菌为芒果畸形病病原菌。四川攀枝花和云南华坪两地芒果园 采集的芒果畸形病标本，通过组织分离、柯赫法则验证，病原菌形态学鉴定、i t s 序列 及p - m b u l i n 基因序列分析辅助鉴定，确认其病原菌均为层出镰刀菌 f u s a r i u m p r o l i f e r a t u m ( m a t s u s h i m a ) n i r e n b e r g 】。并在国际上首次证实该镰刀菌可以引起芒果畸形 病。 2 、较为系统地测定了芒果畸形病病原菌的生物学特性。发现该病原菌生长的最适 温度为2 4 ，最适p h 为1 0 ；分生孢子萌发最适温度为2 4 ，最适p h 值为5 。病原菌 能够利用供试的各种碳源和氮源生长，其中碳源以果糖最好，氮源以蛋白胨最好；连续 光照处理菌丝生长速率高于交替光照或持续黑暗处理；分生孢子的致死温度为5 5 ， 2 0 m i n 或者6 0 ，5 m i n 。 3 、在国内外首次用绿色荧光蛋白( g f p ) 基因标记层出镰刀菌( f u s a r i u m p r o l i f e r a t u m ) 。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备了病原菌原生质体，用抗潮霉素基因作 为选择标记，采用p e g 介导的原生质体转化法，用绿色荧光蛋白表达载体( p c t 7 4 s g f p ) 转化原生质体，获得表达g f p 的转化子；转化子在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后， 在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光，用g f p 特异性引物p c r 扩增转化子基因组d n a 获得预期大小片段，表明g f p 基因己成功导入芒果畸形病病原 菌基因组且稳定遗传；g f p 标记菌株生长正常，致病性和野生菌株无明显差别。 本论文明确了发生在四川攀枝花和云南华坪两地的芒果畸形病病原菌，并阐明了该 病原菌基本的生物学特性，有助于更好地指导该病害的防控；获得g f p 标记的病原菌 菌株，为进一步深入研究该病原菌侵染方式、扩展过程、传播途径等奠定了基础。 关键词：芒果畸形病病原菌层出镰刀菌生物学特性绿色荧光蛋白基因 a b s t r a c t m a i l g om a l f o m i a t i o nd i s e a s ei s a i li m p o r t a n td i s e a s eo fm a n g o ( m a n g i f e r ai n d i c al ) 、o r l d 埘d e m a n g om a l f o r m a t i o n i sc h a r a c t e r i z e db yt h ea b n o r m a ld e v e l o p m e n to fv e g e t a t i v e s h o o t sa n di 1 1 f l o r e s c e n c e s m a l f o r m e dv e g e t a t i v eb u d sa r ee n l a r g e da n dc r o w di nt h el e a fa x i l s 0 ra tt h et i p sl e a d i n gt op r o f u s e l yp r o l i f e r a t e da n db u n c h e ds h o o t s f l o w e r si nam a l f o r m e d i n f l o r e s c e n c ea r ep r o d u c i n gn of i x t i to ra b o r t i n ge a r l y i nt h es e r i o u sc a s e s ，t h ed i s e a s ea l s o r e s u n si i ls t l m t e dt r e e sw i t hp o o rp r o d u c t i v i t y a l t h o u g ht h ed i s e a s eh a sb e c a m em o r ea n d m o r ep r e v a l e n ti nm a n g op r o d u c i n ga r e a sa n dp o s e dag r e a tt h r e a t o nm a n g op r o d u c t i o n , e f f o n st od e v e l o p i n gc o n t r o lm e a s u r e sh a v en o tm a d et o om u c hp r o g r e s si nt h el a s td e c a d e s m a n ys p e c i e so ff u s a r i u mg e n u sw e r er e p o r t e dt ob ea s s o c i a t e dw i t hm a n g o m a l f o r m a t i o ni n d i 仃e r e mc o 谢e so rr e g i o n s o c c u r r i n go fm a n g om a l f o r m a t i o nh a sb e e nd e t e c t e di ns o m e m a n g oo r c h a r d si np a n z h i h u , s i c h u a np r o v i n c e ，a n dh u a p i n gc o u n t y , y u n n a np r o v i n c eo f c f o rs o m et i m e i t se t i o l o g yh a sn o tb e e nd e t e r m i n e dy e t t h e r e f o r e ，t h em a i np u r p o s e o ft i f f ss t u d yi st oe s t a b l i s ht h ec a u s a la g e n to fm a n g om a l f o r m a t i o nf o rt h e s et w ol o c a t i o n s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec a u s a la g e n tw a si d e n t i f i e da sf u s a r i u mp r o l i f e r a t u mf o rt h ef i r s tt i m ei nc h i n a t h ep a t h o g e no fm a n g om a l f o r m a t i o nd i s e a s ei np a n z h ih u aa n dh u a p i n gw a si d e n t i f i e da s 凡s 口，豇l ，纷p r o l i f e r a t u m ( m a t s u s h i m a ) n i r e n b e r go nt h eb a s i so fi t s c o l o n yc h a r a c t e r i s t i c s ， c o n i d i a lm o r p h o l o g ya n da n a l y s i so fd n a - s e q u e n c e so fi t sr e g i o no fr d n ag e n ea n d 1 3 - t u b u l i ng e n e t h i sw o r ka l s o e s t a b l i s h e dep r o l i f e r a t u mt ob et h ef o u r t ha m o n gm a n g o m a l f o n n a ，t i o na s s o c i a t e df u s a r i u ms p pv e r i f i e dt h r o u g hk o c h sp o s t u l a t e s 2 b i 0 1 0 9 i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ep a t h o g e nw e r ed e t e r m i n e dp r i m a r i l y t h e b e s tm y c e l i a l 汀o w mw a sr e c o r d e da t2 4 ca n dt h eo p t i m u mp h v a l u ew a sp h 6 a m o n gd i f f e r e n tca n dn s o u r c e st e s t e d ，f r u i ts u g a ra n dp r o t e i np e p t o n ew e r et h eb e s tf o rt h ef u n g a lm y c e l i a lg r o w t h l i mp r o m o t e dm y c e l i a lg r o w t h t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e f o rc o n i d i a lg e r m i n a t l o nw a 8 2 4 。ca n dt h eo p t i n m mp hw a s5 t h el e t h a lt e m p e r a t u r ef o rt h em y c e l i u mw a s5 5 。c f o r2 0 m i no r6 0 f o r5 m i n 3 q e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ng e n e ( g f pg e n e ) w a s t r a n s f o r m e ds u c c e s s f u l l yt oe p r o l i f e r q t 肼la n dg f pe x p r e s s e di s o l a t ew a so b t a i n e d f o rt h ef i r s tt i m e t h ep r o t o p l a s t so fae p m 惭爸r m 蚺ti s o l a t em m d lh a v eb e e np r e p a r e db yd i g e s t i n gt h em y c e l i aw i t hl y w a l l z y m e f m 吐l e 衄o r e ，t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p g t 7 4 - s g f pw a st r a n s f o r m e di n t ot h ep r o t o p l a s t sw i t h p e g l e d i a t e dm e t h o d t r a n s f o r m a n t s w e r e r e g e n e r a t e d h y g r o m y c i n c o n t a i n i n gm e d i u m s i n g l e s p o r ei s o l a t e s o b t a i n e da n d a n d s e l e c t e d o n s h o w e ds t r o n gg r e e n f l u o r e s c e n c ea f t e rs e v e r a ls u c c e s s i v eg e n e r a t i o n so nt h em e d i u mw i t h o u th y g r o m y c i n t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tp p g t 7 4 - s g f pw a ss u c c e s s f u l l yi n t e g r a t e di n t ot h ei s o l a t em m d l ，n l e p r e s e n c eo ft h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nd n ai nt h ef u n g a lc e l l sw a sc o n f i r m e db yp c r u s i n gag f p s p e c i f i cp r i m e rp a i r t h et r a n s f o r m e di s o l a t e sd i dn o td i f f e rm a r k e d l yf r o mt h e w i l dt y p ei s o l a t ei ng r o w t ha n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c si nv i t r o p a t h o g e n i c i t yt e s t s s h o w e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o np r o c e s sd i dn o ta l t e rp a t h o g e n i c i t yo ft h em m d l e s t a b l i s h m e n to ft h eep r o l i f e r a t u ma st h ec a u s a la g e n to fm a n g om a l f o r m a t i o ni nc h i n a a n du n d e r s t a n d i n go fp r i m a r yb i o l o g i c a lf e a t u r e so ft h ef u n g u sm a y h e l pt ot h ef u t u r ec o n t r o l o ft h ed i s e a s e 砀eep r o l i f e r a t u mi s o l a t e l a b e l e d 眦油g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ng e n e f a c i l i t a t e sf u r t h e rs t u d yo ni t sm o d e so fp e n e t r a t i o n ，c o l o n i z a t i o na n de x t e n s i o ni nt h em a n g o t i s s u e ，a sw e l la si t ss p r e a d k e yw o r d s ：m a n g om a l f o r m a t i o n ；c a u s a la g e n t ；f u s a r i u mp r o l i f e r a t u m ；b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ；g f p i i i 目录 摘要i a b s t r a c t ii 目蜀之：i v 1 前言1 1 1 芒果畸形病研究综述1 1 1 1 我国芒果产业的经济重要性1 1 1 2 芒果畸形病症状、分布、危害、病原及发病规律：1 1 1 2 1 症状l 1 1 2 2 分布与危害3 1 1 2 3 病原菌3 1 1 2 4 发病规律5 1 1 2 5 芒果畸形病的防治措施5 1 2 绿色荧光蛋白( g f p ) 在真菌研究中的应用6 1 3 本研究的目的意义和主要研究内容7 1 3 1 本研究的目的意义7 1 3 2 主要研究内容7 2 材料与方法8 2 1 芒果畸形病病原菌的分离鉴定。8 2 1 1 样品采集、病原菌分离、纯化与保存8 2 1 2 科赫法则验证：8 2 1 3 病原菌的形态学鉴定8 2 1 4 分子生物学方法鉴定8 2 1 4 1 病原菌d n a 的提取方法8 2 1 4 2 病原菌i t s 序列扩增与分析9 2 1 4 3 病原菌b 微管蛋白基因序列扩增与分析1 0 2 1 4 4 病原菌种的特异性p c r 扩增鉴定1 l 2 1 4 5 克隆转化1 2 2 1 4 6 转化子的菌液p c r 检测13 2 2 芒果畸形病病原菌的生物学特性1 5 i v 2 2 1 供试菌株：。1 5 2 2 2 环境条件对芒果畸形病病原菌生长的影响1 5 2 2 2 1 温度对菌落生长的影响1 5 2 2 2 2p h 值对菌落生长的影响1 5 2 2 2 3 光照对菌落生长的影响1 5 2 2 3 碳源、氮源对菌落生长的影响1 5 2 2 3 1 碳源对菌落生长的影响1 5 2 2 3 2 氮源对菌落生长的影响1 5 2 2 4 环境条件对芒果畸形病原菌分生孢子的影响1 6 2 2 4 1 温度对病原菌分生孢子萌发的影响1 6 2 2 4 2p h 值对病原菌分生孢子萌发的影响1 6 2 2 4 3 分生孢子的致死温度和时间1 6 2 3 绿色荧光蛋白基因转化芒果畸形病病原菌的研究1 7 2 3 1 材料1 7 2 3 2 主要试剂1 7 2 3 3 培养基。1 8 2 3 4 质粒提取18 2 3 供试菌株对潮霉素b ( h mb ) 的敏感性测定1 9 2 3 6 原生质体的制备和p e g 介导原生质体转化：1 9 2 3 6 1 原生质体的制备。1 9 2 3 6 2p e g 介导原生质体转化。1 9 2 3 7 转化子的菌落观察和荧光检测1 9 2 3 8g f p 标记菌株的p c r 鉴定和种特异性引物p c r 鉴定2 0 2 3 8 1g f p 标记菌株的p c r 鉴定2 0 2 3 8 2 种特异性引物p c r 鉴定2 1 2 3 9g f p 标记菌株的致病性测定2 1 3 结果与分析2 2 3 1 芒果畸形病病原菌的分离鉴定2 2 3 1 1 样品采集、病原物分离、纯化与保存2 2 3 1 2 柯赫法则验证结果2 2 3 1 3 病原菌形态特征2 3 3 1 4 病原菌i t s 和b 微管蛋白基因序列及种特异性p c r 结果2 5 v 3 1 4 1i t s 序列2 5 3 1 4 2b 微管蛋白基因序列2 5 3 1 4 3 种特异性p c r 鉴定2 5 3 2 芒果畸形病病原菌的生物特征试验结果2 6 3 2 1 环境条件对菌落生长的影响2 6 3 2 1 1 温度对病原菌菌丝体生长的影响2 6 3 2 1 2p h 值对病原菌菌丝体生长的影响：2 6 3 2 1 3 光照对病原菌菌丝体生长的影响“2 6 3 2 2 碳源、氮源对病原菌菌丝体生长的影响2 6 3 2 2 1 碳源对病原菌菌丝体生长的影响2 6 3 2 2 2 氮源对病原菌菌丝体生长的影响。2 6 3 2 3 环境条件对芒果畸形病病原菌分生孢子的影响2 7 3 2 3 1 不同温度对孢子萌发的影响2 7 3 2 3 2 不同p h 值对孢子萌发的影响。2 7 3 2 3 3 分生孢子的致死温度和时间。2 7 3 3 绿色荧光蛋白基因转化芒果畸形病病原菌的结果3 1 3 3 1 供试菌株对潮霉素的敏感性3 1 3 3 2 原生质体的生产情况观察3 2 3 3 3 转化子菌落观察和荧光检测结果3 2 3 3 4g f p 标记菌株p c r 和种特异性引物p c r 鉴定结果3 2 3 3 5 转化子致病性测定结果3 4 4 结论与讨论3 5 4 1 结论。3 5 4 2 讨论3 6 参考文献。3 8 鸳筻谢4 3 v i 1 前言 1 1 芒果畸形病研究综述 1 1 1 我国芒果产业的经济重要性 芒果( m a n g i f e r ai n d i c al i n n ) ，为漆树科( a n a c a r d i a c e a e ) 芒果属常绿乔本果树， 原产于亚洲东南部即印度马来西亚一带( 张育英等，1 9 9 2 ) 。芒果素有“热带果王 的 美誉，芒果肉质细滑多汁、味香甜浓郁、营养价值高，富含氨基酸、糖、脂肪酸、矿质 元素、有机酸、蛋白质和维生素( 黄辉白，2 0 0 3 ) 。芒果与柑橘、香蕉、葡萄、苹果并 称世界五大水果，在热带水果中，产量和收获面积仅次于香蕉，为第二大热带水果( 高 爱平等，2 0 0 6 ) 。芒果性喜温暖，不耐寒霜。世界芒果生产区年均温在2 0 以上，最低 月均温大于1 5 。生长温度要求为1 8 - - 3 5 ，最适宜的生长温度为2 0 - - 3 0 ，南北纬 2 6 。之间、干湿季明显的热带、亚热带季风气候地区均适合芒果树的种植( 郭安，2 0 0 6 ) 。 我国能正常生长结果的芒果种植区年均温为1 9 8 2 4 1 ，但以年均温2 1 2 2 ，最冷月 大于1 5 ，几乎全年无霜的地区为多。目前世界上大约有8 7 个国家栽培芒果，中国是 芒果主产国之一，在热带果树中，2 0 0 5 年国内栽培面积仅次于荔枝、龙眼和香蕉，排第 四位；产量仅次于香蕉、荔枝、龙眼和菠萝，排第五位；产值仅次于香蕉、荔枝和龙眼， 排第四位( 高爱平等，2 0 0 6 ) 。芒果果实既宜鲜食，又适加工，可满足消费者对果品多 样化的需要。芒果生长快、结果早，丰产稳产，是果农致富的好树种。国内芒果主要用 于鲜食，近年来芒果加工增值受到各方关注，已有多种特色产品问世( 郭安，2 0 0 6 ) 。 因此我国芒果产业在热带农产品加工业中也占有重要地位。 我国芒果主要分布在海南、广西、广东、云南、台湾、福建和四川部分地区，经过 多年发展，芒果产业已经成为主产区重要的农业支柱产业之一( 陈菁等，2 0 0 1 ；贺军虎 等，2 0 0 6 ) 。其中位于金沙江干热河谷的四川攀枝花和邻近的云南华坪，由于独特的气 候资源已经发展成为我国生产优质晚熟芒果的主要基地。 1 1 2 芒果畸形病症状、分布、危害、病原及发病规律 1 1 2 1 症状 根据受害部位不同，芒果畸形病可分为营养器官畸形和花序畸形( n o r i e g ae ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。营养器官畸形多发生在幼苗，在结果树上也很常见。幼苗上的典型症状是植株 顶端优势丧失，导致腋芽或顶芽膨大并产生大量的嫩芽，嫩枝丛生呈束状生长( k u m a r a n db e n i w a l 1 9 9 2 ) ：畸形芒果苗的根系浅且3 级侧根少于正常苗( s c h l o s s e r , 1 9 7 1 ) 。幼 苗早期( 3 4 个月) 受感染后植株保持矮小直到最后干枯；后期被感染的幼苗虽仍可继 续生长但发育受抑制。成龄果树的枝条被感染后，其营养芽也会大量萌发，并成束生长 呈“扫帚 状( 图1 ：a ) ，最后干枯，但是在下个生长季节枝条腋芽仍会再度过度萌发 ( n o r i e g ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而且畸形芽常发生在被枝剪的部位( 图1 ：b ) 。花芽分化紊乱， 常出现不正常的开花坐果现象，如挂果期长出花序、抽梢期开花等。感染程度严重的成 龄果树发育不良，植株矮小( 图1 ：c ) 。 图1 芒果畸形病的症状 a ：“扫帚状”畸形枝条( 摄自云南华坪) ；b ：畸形芽( 摄自四川攀枝花) ； c ：严重畸形的成龄果树( 摄自攀枝花) ；d ：畸形花序( 摄自攀枝花) f i g 1s y m p t o m so fm a n g om a l f o r m a t i o nd i s e a s e a ：m a l f o r m e db r a n c h e s ；b ：m a l f o r m e db u d s c ：m a l f o r m e dm a t u r et r e e s ；d ：m a l f o r m e di n f l o r e s c e n c e 在通常情况下，表现营养器官畸形的枝条将会产生畸形的花序( s i n g he ta 1 ，1 9 6 1 ) 。 受感染的花序整个或部分畸形膨大甚至呈现盘状，花数明显增加，花轴变短、变粗，小 花簇拥在一起，最后焦枯死亡( 图l ：d ) 。畸形花序虽然会产生更多的小花，但大部分小 花并不开放( k u m a ra n db e n i w a l ，1 9 9 2 ) ，而且不育花的数量也会增力i ( s i n g he ta 1 ，1 9 6 1 ) 。 畸形花序上两性花的雌蕊通常功能丧失，雄蕊花粉发育能力差( l i m a ，2 0 0 6 ) 。畸形花序 几乎不能座果，即使结果，果实也不能正常发育而败育。 2 1 1 2 2 分布和危害 芒果畸形病在世界各芒果产区分布广泛。1 8 9 1 年，印度首次发现芒果畸形病以来 ( w a t t ，1 8 9 1 ) ，目前该病害在马来西亚( m a r a s a se ta 1 ，2 0 0 6 ) 、巴基斯坦( s c h l o s s e r , 1 9 7 1 ) 、 埃及( p l o e t ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 、南非、巴西( l i m a , 2 0 0 9 ) 、以色列、中美洲、墨西哥、美 ( c s m p b e l l a n dm a r l a t t ，1 9 8 6 ) 、苏丹、阿曼苏丹国( k v a se ta 1 ，2 0 0 8 ) 、古巴、乌干达、委内瑞拉、斯 威士兰、尼加拉瓜、萨尔瓦多、澳大利亚、孟加拉国和阿拉伯联合酋长国( b u r h a n , 1 9 9 1 ) 均有发生( k u m a re ta 1 ，1 9 9 3 ；p l o e t z ，2 0 0 1 ) 。芒果畸形病在我国四川攀枝花和云南华坪部 分芒果园已发生多年，具体的发生时间没有记载，2 0 0 9 年周俊岸等人( 2 0 0 9 ) 报道在广西 也发现了芒果畸形病，其它地区尚未发现。 芒果畸形病危害严重，造成巨大的经济损失。印度一块芒果园，连续3 年对该病害 的危害所做的一项调查发现，因花序畸形导致的产量损失高达8 6 ；在印度北部，超过 5 0 的芒果树受到该病为害，产量损失巨大( k u m a re ta l ，1 9 9 3 ) 。报道该病也威胁埃及的 芒果产业( p l o e t ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在南非7 3 的芒果园存在该病，株发病率在l 7 0 不等 ( c h a d h aa n dp a l ，1 9 9 3 ) 。巴基斯坦的各果园1 0 0 存在该病害，无任何一种芒果树品种能 够幸免( i q b a l e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在巴西的圣弗朗西斯科河流域，些果园芒果畸形病发病率 甚至高达1 0 0 ，导致无法结果，造成巨大经济损失( l i m a , 2 0 0 9 ) 。目前国内对该病害造 成的损失还没有一个准确的评估。 1 1 2 3 病因 自芒果畸形病首次报道以来，在近百年的时间里，该病的病因一直不能确定，该病 是生理性病害还是侵染性病害( 如：病毒、真菌) 或者还是由螨类危害引起等方面曾一 直存在争议。 生理理论： 芒果畸形病被认为是生理紊乱造成的( b u r n s ，1 9 2 0 ) ，如枝条c n 的改变和缺乏微 量元素等。但是印度的研究证明营养不是引起畸形病的首要因素( s i n g he ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 健康的和畸形组织的矿物质含量无显著差异，感病果树在注射或喷洒微量元素溶液后仍 无法恢复( t r i p a t h i ，1 9 5 5 ) 。也有人报道生长素和抗生长素的不平衡关系到花芽分化的紊 乱( k h a n , 1 9 6 3 ) 。最近的研究报道表明畸形组织激素失衡，是因为寄主和寄生物相互作 用从而引起了代谢的变化( k u m a ra n db e n i w a l ，1 9 9 2 ) 。目前，从生理上解释芒果畸形病 的意义不是很大。 瘿螨理论： 1 9 4 4 年后，在埃及h a s s a n ( 1 9 4 4 ) 发现某种瘿螨与营养器官畸形和花序畸形有关， 并推测芒果畸形病由瘿螨引起以来。这种看法得到一定的支持，在畸形芒果花序分生组 织中确实发现了有瘿螨( e r i o p h y e ss p ) 的存在( k t t m a re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。有人发现瘿螨种 群密度与病害发生率呈正相关；几个成功的接种实验声称应用杀螨剂后该病害严重程度 降低( k u m a re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。但是，p r a s a d 等人( 1 9 6 5 ) 和其后他人( s t n g ha n dd h i l l o n , 1 8 9 8 ) 反驳了瘿螨种群密度与病害发生率有关系，因为他们证明了杀螨剂并没有抑制该病害的 发生发展。1 9 9 2 年，以色列的研究报道指出，瘿螨为芒果畸形病病原菌f u s a r i u m s u b g l u t i n a n s 的传播提供了传播媒介( p i n k a sa n dg a z i t ，1 9 9 2 ) 。g a m l i e l - a t i n s k y 等人 ( 2 0 0 8 ) 也发现，瘿螨能携带芒果畸形病病原菌f u s a r i u mm a n g i f e r a e 并为病原菌的侵入 提供侵染伤口。 病毒理论： 因芒果畸形病在嫁接果树和实生果树上均有发生，且发病率增加缓慢，s a t t a r 在1 9 4 6 年认为它可能是由病毒引起的( s a t t a r , 1 9 4 6 ) 。随后几年，也有几份报道称病树上有病 毒的存在。到上世纪8 0 年代，在印度有人通过电子显微镜、传毒实验、培养和血清学 等研究结果有力地反驳了病毒或植原体参与芒果畸形病( k u m a ra n db e n i w a l ，1 9 9 2 ) 。 2 0 0 2 年c a i r o 等人在埃及通过对芒果畸形组织进行p a g e ( 聚丙烯酰胺凝胶电泳) 检测 发现了比较特殊的低分子量r n a 分子，这些r n a 并没有在健康组织中发现( c a i r oe ta l ， 2 0 0 2 ) ，随后对芒果叶片进行超薄切片观察到畸形组织细胞与健康组织细胞的显著变化， 这些变化可能与检测到的特殊r n a 有关，并认为这些r n a 为类病毒，因此c a i r o 等人 认为类病毒是芒果畸形病的病原。病毒或类病毒是否与芒果畸形病有关还缺乏非常有力 的证据支持。 真菌理论： 最近的研究报道多认为芒果畸形病由真菌引起，而且大量的研究结果显示该病与镰 刀菌属的几种真菌有关( n o r i e g a , 1 9 9 9 ；f r e e m a ne ta 1 ，1 9 9 9 ；l i m ae ta 1 ，2 0 0 9 ；i q b a l ， 2 0 1 0 ) 。 目前，通过柯赫法则验证的仅有3 种，分别为：es u b g l u t i n a n s 、em a n g i f e r a e 和es t e r i l i h y p h o s u m ( l i m ae ta 1 ，2 0 0 9 ；s u m m a n w a r , 2 0 0 6 ；m a r a s a s ，2 0 0 6 ) 。其中e m a n g i f e r a e 在埃及、美国、以色列、马来西亚和南非均被确认( b r i m e ta 1 2 0 0 2 ；m a r a s a se t a 1 2 0 0 6 ) 。i q b a l 等人( 2 0 0 8 ) 对em a n g i f e r a e 的形态特征进行了详细的描述。此外，f s e m i t e c t u m 与f u s a r i u mn i v a l e 在巴基斯坦( k h a s k h e l i ，2 0 0 8 ) 、ep r o l i f e r a t u m 在马来西亚 ( m a r a s a s ，2 0 0 6 ) 和f u s a r i u mo x y s p o r u m 在墨西哥也( r o d r i g u e z - a l v a r a d oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 被报 道与芒果畸形有关，但其致病性有待进一步证实。f r e e m a n 等人( 1 9 9 9 ) 把g u s 报告基因 转入em a n g i f e r a e 菌株中，通过人工接种，证实芽和花组织是寄主的初次侵染点，伤口 也可以为病原菌提供侵染的途径。em a n g i f e r a e 的大型和小型孢子由于是该菌产生的唯 一繁殖体，同时在不同的畸形组织上大量产生，所以最有可能是侵染繁殖体。 4 1 1 2 4 发病规律 研究表明，该病害的侵染模式为系统性侵染且传播速度较慢。在一苗圃跟踪调查营 养畸形发生率，结果表明在第一年发病率最高的地块在随后的几年里仍表现最大发病率 ( k u m a ra n db e n i w a l ，1 9 9 2 ) 。 季节的变化特别是开花期的环境温度对病害的发生和严重程度有明显的影响。在埃 及，春稍抽出的花穗上病害发生最为严重，其次是夏稍和秋稍。在佛罗里达州，潮湿的 环境有利于该病害的发生( c s m p b e l la n dm a r l a t t ，1 9 8 6 ) 。在印度，气候显著影响病害的 发生，在气温较高的南部地区，病害发病率低，而开花前环境温度较低的地区，病害最 为严重( n o r i e g ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。串珠镰刀菌( fm o n i l i f o r m e ) 被认为是印度芒果畸形病的 一个病原菌，对em o n i l i f o 朋p 随季节变化的研究表明，在二月份其密度达到最高值， 二月的最低和最高温度范围在8 2 7 ( k u m a re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。g a m l i e l a t i n s k y 等人( 2 0 0 9 ) 对病原菌em a n g i f e r a e 的生物学进行了研究，该病原菌孢子萌发和菌落生长需要温度在 5 以上，最适为2 5 和2 8 。 致病菌的侵染来源和传播途径还在研究当中，土传和气传等在文献中都有所提及