（药理学专业论文）间尼索地平对脂多糖肺损伤保护作用的研究.pdf

j 己- j f ： ， 。 目录 lifrllr lrl ll i l ti ii i iii y 18 0 0 3 6 3 中文摘要l 英文摘要4 研究论文间尼索地平对脂多糖肺损伤保护作用的研究 前言7刖舌 材料与方法8 结果1l 附图13 附表1 6 讨论18 参考文献21 综述2 4 致谢3 4 个人简历3 5 0tl*警“蠹m口b。r“tf 中文摘要 间尼索地平对脂多糖肺损伤保护作用的研究 摘要 间尼索地平为尼索地平的同分异构体，是河北医科大学药学院首创 合成的一种二氢吡啶类钙通道阻滞剂。已有实验证实钙拮抗药维拉帕米可 减轻实验动物脂多糖内毒素致肺损伤，本实验拟探讨间尼索地平在肺损 伤方面的作用。 急性肺损伤( a l i ) 是急性呼吸窘迫综合征( a r d s ) 的早期阶段，是指 由心源性以外各种肺内外致病因素引起的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭， 是肺部炎症和通透性增加的综合症，严重威胁着人类的健康。多种病因( 包 括肺内肺外，感染- - ：i p - 感染) 都能直接或间接地引起a l i 及a r d s 。革兰 阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 是导 致肺部感染和a l i 的主要因素。故本实验用l p s 复制a u 动物模型。 目的：本实验通过观察钙通道阻滞剂间尼索地平干预后l p s 诱导小 鼠急性肺损伤的肺组织病理变化、部分炎症介质的渗出及肺组织毛细血管 通透性的变化，明确间尼索地平对l p s 诱导小鼠急性肺损伤是否具有保 护作用。 方法：健康昆明种雄性小鼠6 0 只，体重1 8 - 2 2 9 ，随机分成6 组： 对照组( 羧甲基纤维素钠+ 生理盐水，n - - lo ) 模型组( 羧甲基纤维素钠+ l p s ，n = l o ) 间尼索地平0 5m g k g o 治疗组( m - n i s + l p s n = l o ) 间尼索地平1 0m g k g 一治疗组( m n i s + l p s + l p s ，n = l o ) 间尼索地平2 0m g k g o 治疗组( m n i s + l p s + l p s ，n = l o ) 维拉帕米2 0m g k g 一治疗组( 维拉帕米+ l p s ，n = l o ) 对照组和模型组分别用羧甲基纤维素钠灌胃( o 1 m l l o g j ) ，间尼索 地平各组分别给与相应剂量的间尼索地平( o 5 、1 0 、2 0 r a g k 9 1 ) 灌胃， 维拉帕米组给与相应剂量的维拉帕米( 2 0 m g k g 一) 灌胃，3 0r a i n 后麻醉 小鼠气管内滴注脂多糖内毒素4m g k g 一。 于滴注脂多糖内毒素6 h 后摘眼球取血用于检测血中蛋白含量，开胸 行左肺肺泡灌洗检测支气管肺泡灌洗液( b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d ， 中文摘要 b a l f ) 中蛋白含量，留取右肺上叶称重烤干计算肺湿干比，留取右肺中叶 用于病理检测，其余肺组织用来测定m d a 含量。 统计学处理应用s p s s13 0f o rw i n d o w s 统计软件包对实验结果进行 单因素方差分析，每组数据以均数4 - 标准差( x 士s ) 表示。 结果：1 小鼠肺组织病理变化 气道内滴入l p s6h 后，模型组小鼠肺泡间隔增宽，肺组织间隙有大 量的中性粒细胞浸润和红细胞渗出，可见肺组织水肿，点、片状出血，间 尼索地平+ l p s 组与维拉帕米+ l p s 组肺损伤明显减轻，肺组织结构均趋 于正常，但仍有轻度肺组织水肿及炎性细胞浸润。 2 各组小鼠肺组织湿重干重( w d ) 值的变化情况 模型组w d 值明显高于对照组，差异有显著意义( p o 0 1 ) ，说明肺部 水肿明显。同模型组比较，间尼索地平o 5m g k g j 组肺w d 值低于模型 组( p o 0 5 ) ，间- 尼索地平1 0m g k g 、2 0m g k g 。1 及维拉帕米组肺w d 值 明显低于模型组，差异有非常显著意义( p o 0 1 ) 。 3 各组小鼠肺组织m d a 含量的变化情况 模型组小鼠m d a 含量明显高于对照组，差异有非常显著意义 ( p o 0 1 ) ，这说明应用l p s 后机体的氧化反应增强间尼索地平1 0m g k g 1 组肺m d a 含量明显低于模型组，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。间尼索地 平2 0m g k g 。1 组和维拉帕米组肺m d a 含量明显低于模型组( p o 0 1 ) 。 4 各组小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量的变化情况 模型组小鼠给l p s 后肺泡灌洗液中蛋白含量明显高于对照组， ( p o 0 1 ) 。间尼索地平1 0m g k g o 组肺泡灌洗液中蛋白含量明显低于模型 组，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。间尼索地平2 0m g k g 。1 组肺泡灌洗液中 蛋白含量明显低于模型组，差异有显著意义( p 0 0 1 ) 。维拉帕米组肺泡灌 洗液中蛋白含量低于模型组，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。 5 各组小鼠肺毛细血管通透指数的变化情况 模型组小鼠给l p s 后肺毛细血管通透指数明显高于对照组，差异有 显著意义( p o 0 1 ) 。间一尼索地平o 5m g - k g 1 和1 0m g k g 一组对通透指数的 影响不明显，2 0m g k g 。组毛细血管通透指数明显低于模型组，差异有显 著意义( p o 0 1 ) 。维拉帕米组小鼠毛细血管通透指数低于模型组，差异有 统计学意义( p o 0 5 ) 可 且 里 肺 性 血 英文摘要 t h ep r o t e c t i v ee f f e c to f m - - n i s o l d i p i n e a g a i n s tl p s - - i n d u c e dl u n gi n ju r y a b s t r a c t m - n i s o l d i p i n e ( m n i s ) t h a ti st h ei s o m e ro fn i s o l d i p i n em i s ) w a sf i r s t s y n t h e s i z e db yh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t y i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a t v e r a p a m i lc a nr e d u c et h el p s i n d u c e dl u n gi n j u r yi nm i c e t h eo b j e c t i v eo f t h ep r e s e n ts t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm n i so nl u n gi n j u r y a c u t e l u n gi n j u r y ( a l i ) i st h ee a r l ys t a g eo f a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s s s y n d r o m e ( a r d s ) ，i sa c u t ep r o g r e s s i v eh y p o x i cr e s p i r a t o r yf a i l u r ec a u s e db y av a r i e t yo ff a c t o r se x c e p tc a r d i a cb o t hw i t h i na n do u t s i d et h el u n g ，a n di sa s y n d r o m eo fl u n gi n f l a m m a t i o na n dp e r m e a b i l i t yi n c r e a s e ，w h i c hi sas e r i o u s t h r e a tt oh u m a nh e a l t h t h e r ea r em a n yc a u s e st h a tc a r le v o k ea l i a r d s d i r e c t l yo ri n d i r e c t l y l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) ，t h em a i nc o m p o n e n to ft h e c e l lw a l lo fg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ，i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r s c a u s i n gp u l m o n a r yi n f e c t i o na n ds y s t e m i ci n f e c t i o na n di n d u c i n ga l i i nt h e e x p e r i m e n tw eu s el p st oe s t a b l i s ht h em o d e lo fa l i o b j e c t ：t h i se x p e r i m e n tw o u l do b s e r v es o m e c h a n g e s a f t e rt h e i n t e r v e n t i o no fm n i s o l d i p i n e ( m n i s ) a n dv e r a p a m i l ，s u c ha sp a t h o l o g i c a l c h a n g e si nl u n gt i s s u e ，t h ei n f l a m m a t o r ym e d i a t o r sa n dc a p i l l a r yp e r m e a b i l i t y c h a n g e si nl u n gt i s s u e ，a n dw ec a l lk n o ww h e t h e rm n i sh a sp r o t e c t i v ee f f e c t a g a i n s tl p s i n d u c e da c u t el u n gi n j u r yi nm i c e m e t h o d s ：s i x t yh e a l t h ym a l ek u n m i n gm i c e ( 18 2 2 9w e i g h t ) w e r ed i v i d e d i n t os i xg r o u p sr a n d o m l y ( n = 10i ne a c hg r o u p ) ：qc o n t r o lg r o u p ( c m c + n s ) ； m o d e lg r o u p ( c m c + l p s ) ；m - n i s 0 5 m g k g 。1g r o u p ( m n i s + l p s ) ； m - n i s1 0m g k g g r o u p ( m n i s + l p s ) ；m n i s2 0m g k 9 1g r o u p ( m - n i s + l p s ) ；v e r a p a m i l2 0 m g 。k g 以g r o u p ( v e r a p a m i l + l p s ) t h ec m cw a sg i v e nt ot h em i c ei nc o n t r o lg r o u pa n dm o d e lg r o u pb y i n t r a - g a s t r i cg a v a g e ( o 1 m l 10 9 q ) m i c ei nt h el p s + m n i sg r o u p sr e c e i v e d t h em - n i s ( o 5 ，1 0a n d2 0 m g k g 叫) t h ev e r a p a m i lw a sg i v e nt ot h em i c ei n 4 l耐-暴r善hhq ， i ， 英文摘要 v e r a p a m i lg r o u p a st h ed o s eo f 2 0m g k g 一t h em i c ew e r ea n e s t h e t i z e d3 0m i n a f t e rd r u g sw e r eg i v e n ，a n dt h e nl p s4m g 。k g 。1w a sg i v e nb yi n t r a t r a c h e a l i n s t i l l a t i o n t h ec o n t e n to fp r o t e i ni ns e r u ma n di nt h eb a l fw a sd e t e c t e d6 ha f t e r l p sw a sg i v e n w eu s e dt h eu p p e rl o b eo fr i g h tl u n gf o rt h ew dr a t i o c a l c u l a t i o n ，t h em i d d l ef o rp a t h o l o g i c a lt e s t i n g ，a n dt h er e s tf o rd e t e r m i n i n g m d ac o n t e n ti nl u n gt i s s u e d a t aa r e e x p r e s s e d a s z 士s ，o n e - w a ya n o v aw a sa p p l i e d w i t h s p ss13 0a n a l y s i ss o f t w a r e ，a n dd if f e r e n c ew a sa c c e p t e da ss i g n i f i c a n ti ft h e pv a l u ew a sl e s st h a n0 0 5 r e s u l t s ：1 p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nl u n gt i s s u e t h ea l v e o l a rs e p t u mi sb r o a d ，t h e r ea r eal a r g en u m b e ro fn e u t r o p h i l a g g r e g a t i o n si nt h el u n gt i s s u ea n dp u l m o n a r ye d e m aa n dh e m o r r h a g ec a nb e s e e ni nm o d e lg r o u p6ha f t e rl p sw a sg i v e n h o w e v e r , t h el u n gd a m a g e s w e r en o ts os e r i o u sa n dt h es t r u c t u r ea p p r o a c h e dt ot h en o r m a ll u n gt i s s u e ， e x c e p tm i l dp u l m o n a r ye d e m aa n di n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o ni nt h em - n i s g r o u p sa n dv e r a p a m i lg r o u p 2 t h ec h a n g eo fw dr a t i o t h ew dr a t i oi nm o d e lg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti n c o n t r o lg r o u p ( p 0 。o1 ) ，w h i c hs h o w e dp u l m o n a r ye d e m a t h ew dr a t i oi n m - n i s0 5m g - k g 1g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a ti nm o d e lg r o u p ( p o 0 5 ) ，t h e w dr a t i oi nt h eg r o u p so fm - n i s1 0m g - k g ，2 0m g 。k g 1a n dv e r a p a m i l2 0 m g k g 以w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nm o d e lg r o u p ( p 0 01 ) 3 t h ec h a n g eo ft h em d ac o n c e n t r a t i o n t h em d ac o n c e n t r a t i o ni nm o d e lg r o u pw a ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h a t i nc o n t r o lg r o u p ( p 0 o1 ) ，w h i c hs h o w e do x i d a t i o nc a p a c i t y t h em d a c o n c e n t r a t i o ni nt h em n i s1 0m g k g 一1g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a ti nm o d e l g r o u p ( p o 0 5 ) t h em d a c o n c e n t r a t i o ni nt h em - n i s2 0m g 。k g 叫g r o u pa n d t h ev e r a p a m i lg r o u pw a sl o w e rt h a nt h a ti nm o d e lg r o u p ( p 0 o1 ) 4 t h ec h a n g eo ft h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nt h eb a l f t h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nm o d e lg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a ti nt h e 气 蠢 l 一 薹查塑墨 ：一一i _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - - _ 。一一 1 c o n t r o lg r o u p ( p o o1 ) ，w h i c hw a sl o w e r e db ym - n i s1 0m g k g 叫a n d2 0 1 m g k g 1a n dv e r a p a m i l2 0m g k g 一( p o 0 5o rp o o 1 ) 5 t h ec h a n g eo f c p i t h ec p ii nm o d e lg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r o lg r o u p ( p o 01 ) t h em n i s0 5m g k g a n dm n i s1 0m g k g h a dn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h e p e r m e a b i l i t yi n d e x t h ec p i i nm n i s2 0m g k g 1g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a t i nm o d e lg r o u p ( p o o1 ) t h ec p ii nv e r a p a m i lg r o u pw a s l o w e rt h a nt h a ti n m o d e lg r o u p ( p o 0 5 ) c o n c i u s i o n ：1 a n i m a lm o d e lo fa c u t el u n gi n j u r y i s s u c c e s s f u l l y d u p l i c a t e db yi n t r a t r a c h e a li n s t i l l a t i o n 2 m n i s o l d i p i n ec a ns i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h el p s i n d u c e dl u n gt i s s u e p a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，r e d u c et h e w dr a t i o ，d e c r e a s et h ec o n c e n t r a n o no f m d aa n dl e s s e nt h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nt h eb a l fa n dt h ec p i a l lt h e s e e f f e c t sa r ed o s e d e p e n d e n t t h er e s u l t ss h o wt h a tm - n i sh a sp r o t e c t i v ee f f e c t a g a i n s tl p s i n d u c e dl u n gi n j u r y , w h i c hi s r e l a t e dt oi n c r e a s i n ga n t i o x i d a n t a b i l i t ya n dd e a c r e a s i n gc a p i l l a r yp e r m e a b i l i t y k e yw o r d s ：m n i s o l d i p i n e ；a c u t el u n gi n j u r y ；l p s ；m d a ；a l v e o l a rl a v a g e ； c a p i l l a r yp e r m e a b i l i t y 研究论文 间尼索地平对脂多糖肺损伤保护作用的研究 屿- 闭瞢 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y , a l i ) 是中性粒细胞在肺内聚集以及血管 内皮细胞的功能受损，释放多种炎症介质及氧自由基、蛋白酶【l 】的疾病， 临床主要表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症，可以进展为急性呼吸窘迫综 合征( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 导致死亡。多种免疫与非免 疫细胞产生各种炎症介质和细胞因子刺激效应细胞如嗜中性粒细胞，使之 在肺内被活化、募集、扣押，肺内效应细胞能释放活性氧代谢产物和蛋白 酶，引起靶细胞损害。引起a l i a r d s 的因素很多，有直接因素也有间 接因素，前者主要有返流误吸、肺炎、溺水、吸入毒物、肺挫伤，后者主 要有败血症，严重的胸部外伤，心肺复苏时大量输液等原因。败血症时细 菌内毒素是导致a l i 的重要因素之一，脂多糖( 1 i p p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，向动物气管内注入l p s 能引起严重 肺内炎症和组织损伤，是a l i 体内研究的经典模型之一。 细胞内钙稳定状态的维持对细胞的生理、生化反应极为重要，c a 2 + 不仅可直接激活多种重要生理意义的细胞内机械活动，而且是c a 2 + 信号系 统转导细胞信号的重要成分。l p s 通过释放钙池的储存钙，进而激活钙池 操纵的c a 2 + 通道( s t o r e o p e r a t e dc a 2 + c h a n n e l s ，s o c ) ，触发细胞外钙内流， 引起细胞内钙超载。细胞浆内钙浓度的升高是一些炎性细胞，包括中性粒 细胞激活，以及相关酶激活和炎症介质释放的必要条件。金胜威 2 】等研究 结果表明l p s 可刺激小鼠r a w 2 6 4 7 巨噬细胞的钙内流，细胞中c d + 浓 度升高会引起自由基和n o 生成增加、线粒体破坏、乳酸酸中毒、基因的 诱导表达等等病理生理变化，从而造成细胞的损伤。氧自由基损伤主要是 使细胞膜的不饱和脂肪酸氧化，生成脂质过氧化物【3 】，进一步形成活泼的 自由基，产生了大量的丙二醛( m d a ) ，同时使膜受损【4 1 ，通透性增高， 钙通道开放，细胞外钙顺浓度梯度而大量内流，造成组织的进一步损伤。 钙拮抗剂是一类能阻断各种刺激引起的c a 2 + 内流的药物。这类药物能 减少细胞外c a 2 + 向细胞内流动，减轻细胞内c a 2 + 超载，从而避免由于细胞 内c a 2 + 稳态失调而诱发的一系列病理损害【5 】。同时钙离子通道阻滞剂具有 研究论文 清除氧自由基和抗氧化作用6 1 。已有实验证明钙拮抗药维拉帕米可减轻急 性胰腺, 炎( a c u t ep a n c r e a t i t i sa p ) 症状及其并发的肺损伤7 1 。因而我们设想 有钙通道阻滞作用的问尼索地平可能会减轻急性肺损伤时细胞的损伤， 从而对脂多糖肺损伤起到保护作用，并由此设计了本实验。 材料与方法 l 材料 1 1 仪器 a g l 3 5 电子天平m e t t l e rt o l e d 公司 微量进样器上海安亭微量进样器厂 细胞破碎仪德国i k a 公司 5 4 1 7 r 小型高速台式高速冷冻离心机 德国e p p e n d o r f 公司 d z f l 电热真空干燥箱上海福玛实验设备有限公司 f l o u s t a r 多功能微板分析仪德国b m g 公司生产 - - 8 0 超低温冰箱美国t h e r m of o r m a 公司 恒温水浴箱德国e d m u n db u h l e r 公司 丹吉尔数字医学图像分析系统山东丹吉尔电子有限公司 1 2 主要药品及试剂 间尼索地平河北医科大学 大肠杆菌脂多糖 美国s i g m a 公司 羧甲基纤维素钠上海化学试剂厂 盐酸维拉帕米片天津市中央药业有限公司 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒南京建成生物科技有限公司 m d a 含量测定试剂盒南京建成生物科技有限公司 1 3 实验动物 健康雄性昆明种小鼠共6 0 只( 体重1 8 2 2 9 ) ，由河北省实验动物中心 提供。动物被随机分为6 组，每组1 0 只。 1 4 药品配置 溶剂的配制：精密称取o 5 9 羧甲基纤维素钠( c m c ) ，使之溶于l o o m l 三蒸水中，得0 5 c m c ，用前搅拌混匀。 研究论文 间尼索地平溶液的配制：避光精密称取5 m g 间尼索地平，加入 1 0 0 m lo 5 c m c 中于研钵中充分研磨，制成均匀混悬液，得0 0 0 5 m n i s 悬液( 即o 5m g k g 。1 剂量组用药) ，同样方法分别避光精密称取1 0 m g 、2 0 m g m n i s ，得到不同浓度m n i s 悬液( 即1 0m g - k g 、2 0m g k g 。剂量组用 药) ，避光4 保存备用。 维拉帕米的配置：将4 0 m g 维拉帕米于研钵中充分研磨，加入生理盐 水1 0 m l 搅拌均匀，再加生理盐水至2 0 m l 得到2 9 l - l 溶液，4 保存备用。 脂多糖内毒素的配置：将1 0 m g 脂多糖溶于l m l 生理盐水，再加生理 盐水至2 5 m l 得到4 m g m l 一的溶液，4 。c 保存备用。 2 方法 2 1 动物分组及l p s 肺损伤模型的制备 取6 0 只雄性昆明种小鼠随机分为对照组，模型组，间尼索地 平o 5m g k g j 组，间尼索地平1 0m g k g 。1 组，间- 尼索地平2 0m g k g 。 组，维拉帕米组。 实验前小鼠常规禁食1 2h ，自由饮水。组灌胃给予羧甲基纤维素 钠0 1 m 1 1 0 9 ，组分别灌胃不同浓度的间尼索地平0 1m l 1 0 9 一， 组灌胃给维拉帕米0 1m l 1 0 9 。二十分钟后0 8 戊巴比妥钠0 15 m l 1 0 9 。1 麻醉小鼠，十分钟后仰卧位固定动物，颈部正中切开，钝性分离 并暴露气管，眼科镊轻轻挑起气管，用微量注射器滴注脂多糖1 1 g 。1 ( 第 一组给生理盐水) 。注意滴注时速度要慢，滴注完毕将小鼠直立并旋转以 利于药液在肺部均匀分布。 2 2 左肺肺泡灌洗 气管内给l p s6 h 后重新麻醉小鼠，仰卧位固定动物，背下垫一个塑 料泡沫，于气管切开处引一根缝合线并打活结，然后开胸结扎右肺门，气 管剪开一个t 字型切口用1 2 号注射器针头( 已磨平) 插入并结扎紧注射 器针头，后接l m l 注射器。用预冷的生理盐水0 4 m l 推入左肺，停留3 0 秒后慢慢吸出，再重复一次。如此反复灌洗3 次收集灌洗液8 0 ( o 9 6 m 1 ) 以上，收集到的液体4 3 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，吸取上清，- - 8 0 。c 保存 待用。 2 3 肺组织病理检查 左肺肺泡灌洗后，取出右肺用滤纸沾干水分及血液，选用中叶浸泡于 研究论文 1 0 甲醛溶液中，固定一夜后，按常规病理学方法脱水、包埋、h e 染色， 光镜下观察肺组织病理变化。 2 4 肺组织湿重干重的计算 取右肺上叶用滤纸沾干水分及血液，称重，然后置真空干燥箱中8 0 烘烤2 4 h ，称干重，计算肺湿干比。 2 5 肺组织匀浆液的制备 取右肺下叶用滤纸吸干血液和水分后称重，剪碎组织以l ：9 加入生 理盐水，用细胞破碎仪在冰浴条件下破碎组织1 0 s ，共进行3 次。将制成 的混悬液以4 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，吸取上清分装，- - 8 0 保存待用。 2 6 血清的制备 气管内给l p s6 h 后重新麻醉小鼠，右手持眼科镊左手拉紧眼周皮肤， 摘取眼球接取血液l m l ，静置3 0 m i n 以上，4 3 0 0 0 r p m 离心15 m i n ，吸 取上清即血清，- - 8 0 保存待用。 2 7 肺毛细血管通透指数的测定 各组小鼠给l p s 后6 h ，摘眼球取血，每只取血0 5 m l 静置3 0 m i n 以 上，然后4 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，吸取上清一8 0 保存待用。全自动生 化分析仪测得血清中总蛋白含量，考马斯亮兰法测得肺泡灌洗液中蛋白含 且 里。 通透指数= 肺泡灌洗液中蛋白含量血清中总蛋白含量1 0 3 2 8 肺泡灌洗液中及肺组织中蛋白含量测定 用考马斯亮兰法测定支气管肺泡灌洗液中蛋白含量。按所需用量用蒸 馏水将考马斯亮兰贮备液稀释成应用液，肺泡灌洗液不用稀释。1 0 肺组 织匀浆按l ：5 稀释后，按说明书要求设置空白管、标准管和测定管，依 次加入试剂，混匀，静置1 0 m i n ，于微板分析仪波长6 0 0 n m 处，测定各管 吸光度值。按照以下计算公式得出b a l f 和肺组织蛋白含量： 蛋白含量( g l 。户测定管吸光度标准管吸光度标准管浓度( g l 。1 ) 。 2 9 肺组织中m d a 含量测定 用硫代巴比妥酸法测定肺组织中m d a 含量。按说明书将试齐u - - ) j h 3 4 0 m l 双蒸水混匀，试剂三按要求配置并避光保存。采用微量操作方法 设置标准管、标准空白管、测定管，依次加入试剂，漩涡混匀器混匀9 5 。c 水浴8 0 m i n ，流水冷却，然后4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 取上清0 2 m l 于微板 研究论文 分析仪5 4 4 n m 处测得各个标本吸光度值。按照下面公式计算肺组织中 m d a 含量： 组织中m d a 含量( n m o l m g p r o t ) 测定管吸光度标准空白管浓度 标准品浓度蛋白含量 标准管吸光度标准空白管浓度 2 1 0 统计学分析 采用s p s s1 3 0f o rw i n d o w s 软件包进行统计学处理。显著性水准 a = o 0 5 。所有数据均以石士s 表示，采用单因素方差分析( o n ew a y a n o v a ) 对各组之间的均数进行比较。 结果 1 肺外观及病理学观察 肉眼观察，对照组小鼠肺外观无明显异常改变。l p s 致伤组肺体积 增大，颜色暗红，可见包膜下点、片状出血。间尼索地平和维拉帕米干 预组较模型组病变轻微，点片状出血较少。 光镜下，对照组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡隔无水肿、炎 症等特殊改变。l p s 组肺泡间隔增宽，肺组织间隙有大量的中性粒细胞 浸润和红细胞的渗出，肺泡腔有红细胞中性粒细胞的渗出。肺组织水肿， 点、片状出血，提示主要病变为水肿、炎症、出血等病变。治疗组这些 病变有不同程度的改善。( 见图1 图6 ) 2 各组小鼠w d 的变化 如表1 所示，l p s 组w d 值较对照组有明显升高( ，p o 0 1 ) 。间尼索 地平o 5m g k g 1 组肺w d 低于l p s 组w d ( p 0 0 5 ) ，间尼索地平1 0 m g k g 。和2 0m g k g 1 组及维拉帕米组肺w d 值明显低于l p s 组w d ， 差异有非常显著意义( p o 0 1 ) 。间尼索地平各组呈剂量依赖性减轻肺含水 且 里。 3 各组小鼠肺组织m d a 含量的变化情况 如表2 所示，l p s 组m d a 含量较对照组有明显升高( p o 0 1 ) ，模型 组脂质过氧化物生成明显增多。间尼索地平1 0m g k g 。可减轻m d a 这 研究论文 种变化( p o 0 5 ) ，间尼索地平2 0m g k g 一和维拉帕米组肺m d a 含量明显 低于l p s 组，差异有显著意义( p o 0 1 ) 。同样，间一尼索地平各组呈剂量 依赖性减少脂质过氧化物生成量，且与维拉帕米组无明显差异。 4 各组小鼠肺泡灌沈液中蛋白含量的变化情况 模型组给l p s6 h 小时后肺泡灌洗液中的蛋白含量明显高于对照组 ( p o 0 1 ) ，间尼索地平1 0m g k g 。1 可减少蛋白渗出，且有统计学意义 ( p o 0 5 ) ，间尼索地平2 0m g k g 。1 组灌洗液中蛋白含量较l p s 组有明显降 低( p o 0 1 ) ，维拉帕米组灌洗液中蛋白含量低于l p s 组差异有统计学意义 ( p 0 0 5 表3 ) 。 5 各组小鼠肺毛细血管通透指数的变化情况 l p s 组通透指数明显高于对照组( p o 0 1 ) ，间尼索地平2 0m g k g 。1 组 通透指数较l p s 组有明显降4 k e ( p 0 0 1 ) ， 维拉帕米组通透指数低于l p s 组差异有统计学意义( p o 0 5 表4 ) ，间尼索地平o 5m g k g 、1 0m g k g 。1 组与模型组比较无统计学差异。 f i g 1p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nc o n t r o lg r o u ph e x 2 0 0 f i g 2p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nl p sg r o u ph e x 2 0 0 1 3 研究论文 f i g 3p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nm - n i s0 5 m g k g 1g r o u ph e x 2 0 0 f i g 。4p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nm n i s1 om g k g 。1g r o u ph e x 2 0 0 1 4 f i g 5p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nm n i s2 0m g k g 1g r o u ph e x 2 0 0 f i g 6p a t h o l o g i c a lc h a n g e si nv e r a p a m i l2 0 m g k g 。1g r o u ph e x 2 0 0 1 5 研究论文 附表 t a b l e1e f f e c to fm n iso nw dr a t i o p o o1v s c o n t r o lg r o u p p o 0 5 p 0 o1v s l p sg r o u p 1 1 a b l e2e f f e c to fm n i so nm d ac o n c e n t r a t i o n p o o1v s c o n t r o lg r o u p p 0 0 5 p o o1v s l p sg r o u p 1 6 研究论文 t a b l e3e f f e c to fm n i so np r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nt h eb a l f p o o1v s c o n t r o lg r o u p p 0 0 5 p 0 01v s l p sg r o u p t a b l e4e 仃e c to f m n i so nc p i p 0 0 1v s c o n t r o lg r o u p p 0 0 5 p 0 0 1v s l p sg r o u p 1 7 研究论文 讨论 钙是维持人体生命活动的重要元素之一，除了在保证肌肉的收缩性、 促进糖原和蛋白的转换以及维持血管平滑肌的张力方面的作用外，细胞内 游离钙离子( c a 2 + i ) 在细胞信号转导中起重要的第二信使作用，同时也 参加和协调其他第二信使的代谢和信号转导。钙离子在炎症反应中也起到 了非常重要的作用，它可以控制许多细胞因子如t n f 0 、i l 1 口的产生【8 】， 通过调节中性粒细胞 c a 2 + 】j 浓度来调节炎症反应是一个有效的途径。钙拮 抗剂可能通过以下机制减轻炎症反应( 1 ) 抑制前炎性细胞介质如t n f 、i l 1 等的释放o 】，并能避免质膜和细胞内相关酶的激活【1 1 】；( 2 ) 减少由c a 2 + 导 致的磷脂酶a 2 和磷脂酶c 活性的抑制，这些酶均为调节类二十烷酸、白 三烯合成的关键酶；( 3 ) 通过抑制c a 2 + 内流保持细胞膜的完整性，保护组织 避免损伤、发炎【1 2 1 。 许多研究表明，细胞内游离钙离子浓度的升高是产生活性氧的必要条 件【l3 1 ，升高的细胞内钙离子可激活活性氧合成酶和线粒体呼吸链的氧自由 基形成【l4 1 。既往的研究发现，钙通道阻滞剂如维拉帕米对炎症反应中中性 粒细胞的聚集以及由中性粒细胞呼吸爆发所产生的组织损伤有明显的抑 制作用。 有越来越多的证据表明c a 2 + 参与了细胞凋亡， c a 2 + 】升高可以通过以 下方式参与细胞凋亡：激活c a 2 + 依赖的蛋白激酶和或磷酸化酶，导致凋 亡相关基因的活化【l5 】；激活c a