（植物学专业论文）关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究.pdf

谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 3 k e yw o r d s ：r i c e ；w h e a t ；b a r l e y ；i n i t i a la n t i c l i n a lc e l lw a l l ；i n i t i a lp e r c i l i n a lc e l lw a l l ； f r e en u c l e u s ；c e l l u l a r i z a t i o n ；c e l lw a l lf o r m a t i o nv e s i c l e 简写符号 a p ： a c - ： c ： c v ： c g ： c p ： g ： e ： e c ： e r ： e s 霄： f n - m ： m t ： n ： n u ： o v ： p c 霄： p e ： p h ： p m v ： 中文全称 反足细胞 垂周壁 成壁泡 中央大液泡 细胞壁 细胞扳 高尔基体 胚 胚乳细胞 内质网 胚囊壁 游离核 线粒体 微管 细胞核 珠心 子房 平周壁 果皮 成膜体 质膜 小泡 符号说明 英文全称 a n a p o d a lc e l l a n t i c l i n a lc e l lw a l l c c l lw a l lf o r m a t i o nv e s i c l e c e n t r a lv a c l e c e u w a l l c e l lp l a t o ( 3 0 l g o $ o m e e m b r y o e n d o s p e r mc e l l e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m e m b r y os a cw a l l f r e en u c l e u s m i t o c h o n d r i o n m i c r o t u b u l e n u c l e u s n u c e u u s o v a r y p e r c i l i n a lc e l lw a l l p e r i c a r p p h r a g m o p l a s t p l a s m am e m b r m 圮 v a c u o l e 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 学生：谢兆伟 导师：王忠教授 摘要 胚乳游离核的细胞化是胚乳发育过程中一个极为重要的时期本实验以水稻， 小麦，大麦为实验材料。采用树脂包埋切片法研究了胚乳游离核的细胞化过程中 初始垂周壁、初始平周壁的来源以及细胞壁的充实过程以期探明核型胚乳的细 胞化过程主要研究结果如下： ( 1 ) 胚乳游离核的分裂方式有两种；有丝分裂和无丝分裂，以有丝分裂为主 ( 2 ) 胚乳游离核的细胞化最先在胚囊外围的游离核之间发生，然后逐步向胚囊 内部推进 ( 3 ) 胚附近的胚乳游离核的细胞化早于合点端发生，随后细胞化逐步向合点端 推进 ( 4 ) 在胚乳游离核细胞化之前胚乳合胞体的细胞质有一个高度液泡化的过程： 先在游离核周围的细胞质中出现许多小液泡，随后这些小液泡再融合形成较大冉勺 液泡，初始垂周壁就在两相邻游离核之间的细胞质中产生 ( 5 ) 初始垂周壁是来源于成膜体与胚囊壁内突的融合：初始平周壁来源于开放 性细胞的平周分裂产生的成膜体 ( 6 ) 初始垂周壁的游离生长末端常发生膨大，在其膨大末端附近的细胞质中各 种小囊泡在徽管的牵引下，向垂周壁的生长末端移动，引导初始垂周壁的向心游 离生长 ( 7 ) 在水稻的细胞质中发现一种含有多囊泡的液泡，我们称之为“成壁泡”其 在细胞质中产生并向新形成的细胞壁移动当其与新形成的细胞壁质膜发生融合 后，将其内的小囊泡释放到壁中，参与壁的充实 关键词：水稻；小麦；大麦；初始垂周壁：初始平周壁：游离核；细胞化；威 壁泡； 扬州大学硕士学位 2 s t u d y o ne n d o s p e r mc e l l u l a r i z a t i o ni nr i c ea n dw h e a t p o s t g r a d u a t e ：x i ez h a o w e i s u p e r v i s o r ：p r o w a n gz h o n g a b s t r a c t t h ee n d o s p e r mc e l l u l a r i z a t i o ni sq u i t ei m p o r t a n ts t a g eo f t h ee n d o s p e r md v e l o p m e n t t h ef o r m a t i o no f i l l ci n i t i a lc e l lw a l lc o n t a i n sa n t i c l i n a la n dp e r c i l i n a lw a l la n dt h e p r o c e s so f t h ec e l lw a l le n r i c h m e n tw e r es t u d i e db yr e s i ne m b e d d i n gc o m b i n e dw i t i l s e m i - t h i ns e c t i o nt e c h n o l o g ya n du l t r a - t h i ns e c t i o nt e c h n o l o g y t h em a i nr e s u l t sw c r ea s f o i l o w s ： ( 1 ) t h e r ew e r et w ow a y so f t h ee n d o s p e r mn u c l e a rd i v i s i o n ：m i t o s i sa n da m j t o s i s m i t o s i sw a st h em a i nw a y ( 2 ) t h ec e i l u l a r i z a t i o no f t h ee n d o s p e r mi si n i t i a t e di nt h ev i c i n i t yo f t h ep e r i p h e r a l e m b r y o s a ca n dp r o c e e d st ot h ei n n e re m b r y o 黜w h e r ei tr e m a i n ss y a c y t i a lu n t i lw e l l a f t e rt h er e m a i n d e ro f t h ee n d o s p e r mh a sc e l l u l a r i z e d ( 3 t h ec e l l u l a r i z a t i o no c c u r sa sw 艄o r i g i n a t i n gi nt h em i c r o p y l a rc h a m b e ra n d m o v i n gt h r o u g ht h ec e n t r a lc h a m b e rt o w a r dt h ec h a l a z a l 邱 ( 4 ) p r i o rt oc e l l u l a r i z a t i o n ，al o to f s m a l lv e s i c l e sw a se m e r g e di nt h ec y t o p l a s m w h i c hs u r r o u n d e dt h ef i e en u c l e u s ，t h e nt h e s es m a l lv e s i c l e sc o m b i n e di n t oe a c ho t h e r a n df o r m e dl a r g e rv e s i c l e s a tl a s tt h ei n i t i a la n t i c l i n a lc e l lw a l lw a sd e v e l o p e db e t w e e n t h et w oa d j a c e n te n d o s p e r mn u c l e i ( 5 ) t h eo r i g i no f t h ei n i t i a la n t i c l i n a lc e l lw a l lc o m ef r o mt h ef u s i o no f t h e p h r a g m o p l a s t sa n d t h ei n w a r dp r o m i n e n c yo f t h ee m b r y os w a l l 。w h i l et h ei n i t i a l p e r c i l i n a lc e l lw a l lc o m ef r o mt h ep h r a g m o p l a sr e s u l t i n gi nt h ea l v e o l ip e r i c l i n a l d i v i s i o n ( 6 ) t h ef r e eg r o w i n gi n i t i a la n t i c l i n a lc e l lw a l ls h o w se x p a n s ca n da s w o l l e nd i s t a l t i p v e s i c l e sa r o u n dt h ed i l a t e da p e xm o v et ot h e 叩撒a n das w o l l e nd i s t a lt i pw i t h t h eh e l po f t h em i c m t u b e t h e nt h e s ev e s i c l e sf u s ew i t i it h ed i l a t e dt i pl e a d i n gt h ei n i t i a l a n t i c l i n a lc e l lw a l lp 托础c e n t r i p e t a l l y ( 7 ) i i lt h ec y t o p l a s mo f f i c e ，as p e c i a lk i n do f l a r g ev a c u o l e sw a sf o u n d , w h i c h c o n t a i nn u m b e r so f s m a l lv e s i c l e s w en a m e di t “e e l lw a l lf o r m a t i o nv e s i c l e t h i s v e s i c l ec o m ef r o mt h ec y t o p l a s ma n dm o v et ot h en e w l yf o r m e dc e l lw a l l t h e nt h e y f u s e dw i t ht h ee e l lm e m b r a n ea n dr e l e a s et h es m a l lv e s i c l e si n s i d et oe n r i c ht h ec e l l w a l i 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 3 k e yw o r d s ：r i c e ；w h e a t ；b a r l e y ；i n i t i a la n t i c l i n a lc e l lw a l l ；i n i t i a lp e r c i l i n a lc e l lw a l l ； f r e en u c l e u s ；c e l l u l a r i z a t i o n ；c e l lw a l lf o r m a t i o nv e s i c l e 简写符号 a p ： a c - ： c ： c v ： c g ： c p ： g ： e ： e c ： e r ： e s 霄： f n - m ： m t ： n ： n u ： o v ： p c 霄： p e ： p h ： p m v ： 中文全称 反足细胞 垂周壁 成壁泡 中央大液泡 细胞壁 细胞扳 高尔基体 胚 胚乳细胞 内质网 胚囊壁 游离核 线粒体 微管 细胞核 珠心 子房 平周壁 果皮 成膜体 质膜 小泡 符号说明 英文全称 a n a p o d a lc e l l a n t i c l i n a lc e l lw a l l c c l lw a l lf o r m a t i o nv e s i c l e c e n t r a lv a c l e c e u w a l l c e l lp l a t o ( 3 0 l g o $ o m e e m b r y o e n d o s p e r mc e l l e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m e m b r y os a cw a l l f r e en u c l e u s m i t o c h o n d r i o n m i c r o t u b u l e n u c l e u s n u c e u u s o v a r y p e r c i l i n a lc e l lw a l l p e r i c a r p p h r a g m o p l a s t p l a s m am e m b r m 圮 v a c u o l e 扬州大学硕士学位 4 引言 胚乳是被子植物双受精过程中一个精子与两个极核融合的产物，大多效为三 倍体其主要功能是为胚或幼苗的发育提供营养和分泌与胚发育有关的激素胚 乳败育常引起胚发育不良或者败育 1 胚乳发育类型概述 ， 被子胚乳依据其发育过程可分为3 种类型：核型胚乳，细胞型胚乳和沼生目 型胚乳核型胚乳是指初生胚乳核的最初分裂并不伴随细胞壁的形成。只是在中 央细胞中形成许多胚乳游离核，位于中央细胞的细胞质中。到发育后期才形成胚 乳细胞：细胞型胚乳的发育不同于核型胚乳发育的地方，是在初生胚乳核发生第 一次分裂后随即伴随细胞质的分裂和细胞壁的形成，以后进行的分裂全属细胞分 裂，所以胚乳白始至终是细胞的形式，不出现游离核时期，整个胚乳为多细胞结 构；滔生耳型胚乳的发育，是核型和细胞型的中间类型，受精极核第一次分裂时 胚囊被分为2 室，即珠孔室和合点室珠孔室较大，这一部分的核进行多次分裂， 成游离状合点室的分裂次数较少，并一直保持游离状态以后。珠孔室的游离 核形成细胞结构，完成胚乳的发育属于这一胚乳发育类型的植物，仅限于沼生 目种类稻麦的胚乳发育属于核型胚乳，其发育过程可分为核期( c o c n o c y t es t a g e ) 和细胞期( c e l l u l as t a g e ) 两个时期，细胞期又可分为胚乳细胞化期( c c l l u l a r i z a t i o n s t a g e ) 、胚乳细胞生长分化期( d e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o ns t a g e ) 和胚乳成熟期 ( m a m r a , i o n ) 。 2 关于细胞化的研究现状 对胚乳细胞化问题的详细研究是高顿( g o r d o n ) 于2 0 世纪2 0 年代首先在禾 谷类植物上进行的，主要借助于石蜡切片和显微镜观察当时认为在胚乳发育过 程中，首先在胚囊周围形成一层细胞胚乳形成层，胚乳形成层的细胞进行平 周分裂，产生胚乳细胞1 9 6 3 年。巴特罗斯( b u t t e r o s e ) 第一次用电子显微技术 研究了小麦胚乳发育过程他发现细胞壁不是经过细胞分裂产生的。而是由膜分 隔细胞质，然后在膜上沉积壁物质，形成胚乳细胞壁2 0 世纪7 0 年代以后。更 多的学者投入到对这一问题的研究工作中去随着固定剂的改进、染色方法的提 高、免疫细胞化学、荧光技术以及电子显微镜的应用，人们对这一问题展开了更 为广泛和深入的研究研究的材j ；幸除禾谷类作物外。还有花生( 邢树平和席湘媛， 1 9 9 5 ) 、大豆( o t e g u i 等，1 9 9 9 ) 、菜豆( y o u n g 和c a v e y 。1 9 8 8 ) 、大葱( 席湘缓。 1 9 8 7 ) 、繁缕( n e w e o m b 和f o w k elc ，1 9 7 3 ) 、罂粟( b h a n d a r i 等，1 9 8 6 ) 、石 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 5 龙芮( x u 和v a n ，1 9 9 3 ) 、白剌( 李师翁等，1 9 9 2 ) 、绣球百合( n e w c o m b ，1 9 7 8 ) 和细叶阿福花( c h i t r a l a k h 等。1 9 9 2 ) 等植物，除后两种植物属双型胚乳植物外。 其余均为核型胚乳植物但因不同的研究者所采用的实验方法、实验材料不同，得 出的结论也不完全相同 3 胚乳合胞体的形成 双受精完成后初生胚乳核在分裂的早期只进行核分裂( 主要以有丝分裂为 主) ，分裂后不伴随细胞壁的形成，产生的大量胚乳游离核连同周围的细胞质共同 组成合胞体，在中央细胞壁和中央大液泡之间形成一薄层早期研究认为，胚乳游 离核分裂过程中形成的纺锤体解体后，不形成成膜体，因而不能和分生组织的有丝 分裂一样产生细胞壁但是利用免疫荧光技术对大麦胚乳的研究发现在胚乳游离 核的分裂过程中，不仅出现纺锤体，而且在末期两子核问也形成桶状的成膜体，但 最终未形成细胞扳和细胞壁原因可能是含有细胞壁前体物质的小泡不能被运输 到赤道面的位置，或者是虽被运输到赤道面位置但不能融合形成细胞板 4 核型胚乳细胞化的机理 关于核型胚乳的细胞化，目前公认的观点认为是先从胚乳游离核的外围逐步 向内进行细胞化在细胞化过程中先在外围的胚乳游离核之问形成向心游离生长 的初始垂周壁，这样就在胚乳游离核的周围形成杯状的细胞壁这时，每个游离 核的四周被外切向壁和垂周壁所包围，仅余内切向面( 即与中央液泡膜相连的一 面) 无壁这样一种结构在胚乳细胞形成过程中有一个专门术语，州傲“开放性” 细胞，然后，“开放性”细胞再进行平周分裂形成初始平周壁。随着垂周壁的不断 向心游离生长和平周壁的不断形成，游离核的细胞化逐步向心推进，细胞层次逐 渐增多，直至胚乳细胞充满整个胚囊内部空间为止。但是，对于初始垂周壁和初 始平周壁的来源，因不同的研究者应用的实验方法、实验材料不同，得出的结论也 不完全相同，甚至对于同种材料。不同的研究者也有不同的研究结果 4 1 初始垂周壁的发生 关于胚乳游离核初始垂周壁的形成，目前归纳起来大致有三种不同的观点： 一种观点认为，在核型胚乳细胞化过程中，初始垂周壁是来源于胚囊壁的内突向 心游离生长即胚囊壁向胚囊一侧形成内突，内突再向心生长，在两个胚乳游离核 之间形成初始垂周壁；另一种观点认为，游离核细胞化开始时初始垂周壁是来自 有丝分裂过程中产生的成膜体。再由成膜体介导垂周壁的形成；近年的研究已初 扬州大学硕士学位 6 步明确，胚乳游离核的细胞化是通过一个固有内在机制和r 峪( 核周放射微管系统， r a d i c a lh i c r o t u b l a rs y s t e r m s ) 来实现调节的 4 1 1 由胚囊壁内突形成初始垂周壁 已获得的数据证明，被子植物胚囊壁是十分复杂并有各种变异的然而，一 个较为普遍的特征是：多数被子植物的胚囊壁都发育壁内突，尤其在牦近珠孔端 更为发达胚囊壁内突表现为两种类型，其一是珠孔区域发达的指状壁内突；其 二是周缘区域有规律的钉状壁内突壁内突不仅增加了胚囊壁的吸收面积，有利 于从珠心组织中汲取营养物质，且当细胞化开始时，壁内突还可以向心游离生长 形成初始垂周壁 胚囊壁内突向心游离生长插入游离核之间便形成了初始垂周壁( 图1 ) 这种 初始垂周壁的形成方式已在小麦( - 4 0 r r i s o n 和0 b r i e n ，1 9 7 6 ) ，罄粟( s h a d a r i 等，1 9 8 6 ) 、矮生菜豆( 冒风利和邵宗泽，1 9 9 1 ) 、绣球百合( n e , c o m b 。1 9 7 8 ) 、 萝卜( 鄙德勃和珏r b e r d ，1 9 8 8 ) 、菜豆( y o u n g 和c a v e l1 9 8 8 ) 等植物中均见有报 导 h 圈l 示胚囊壁形成的机理( 自m a r e s 等1 9 7 7 ) a 瓣离桉( 示中央细胞壁和质膜) b 胚囊壁内突形成出示垂周壁c d 初始垂周壁的向心廷伸e 一开放性。 谢兆伟；关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究7 细胞胚乳核进行平周分裂产生两个子棱f 平周分裂后产生的细胞板g 由平周分袭产生的细臆扳形成初始 平周壁h 随着平周分裂的不断进行，逐步完成细胞化 4 1 2 由细胞板形成初始垂周壁 这一观点是f i n e r a n 在研究小麦胚乳发育后首先提出的他认为初始垂周壁来 源于细胞板，即胚乳核进行有丝分裂形成与成膜体有关的细胞板。细胞板向周围扩 展一侧与中央细胞壁接触并发生融合，另一则向中央大液泡方向生长( 图2 ) 在 对小麦( f i n e r a n 等，1 9 8 2 ) 、大葱( 席湘缓，1 9 8 7 ) 、白利( 李师翁等1 9 9 2 ) ，石 龙芮( x u 和v a n 1 9 9 3 ) 等植物胚乳游离核的细胞化研究中均发现初始垂周壁来源 于细胞板的证据 但从数学的角度分析，只通过细胞有丝分裂产生细胞板形成细胞壁是无法满 足胚乳细胞化所需细胞壁的数量的，因为它只能解释姐妹胚乳核( 由同一个胚乳 游离核分裂而来) 之间细胞壁的来源，不能解释非姐妹胚乳核( 相邻的两个胚乳 核，但不是由同一个细胞核分裂而来) 之间细胞板的来源后来的研究表明，来源 于胚乳核有丝分裂细胞板的初始垂周壁只占初始垂周壁的一部分 图2 小麦胚乳游离核以成膜体形式形成初始垂周壁的方式( 自f i n e r a n1 9 8 2 ) a 游离核分裂后产生细胞板b 细胞扳向两侧延伸。当其一墙与胚囊壁接触后就形成了韧始垂周壁c “开 放性”细胞通过平周分裂产生成膜体d 由成膜体形成初始平周壁e 处于胚囊中心的。开放性。细胞之同 形成成膜体，最终形成细胞壁 扬州大学硕士学位 8 4 1 3 核周放射微管在细胞壁形成过程中的作用 o d d - a r n eo l s e n 等人在对拟南芥研究的基础上提出：起源于核膜的核周放射 微管( 跚s ) 在核型胚乳的细胞化进程中起着重要作用他们认为：在胚乳核细胞 化初期，胚乳游离核问的放射性微管相互交织形成立体的网状结构使许多的胚乳 游离核均匀分散并定位在细胞质中，形成相对独立的结构和功能的单位核质 域( n s 。n u c l e a rc y t o p l a s m i cd o m a i n s ) ，然后在核质域之同的胚乳细胞质中 聚集许多小液泡，小液泡不断融合，使核质域在垂直于胚囊壁的方向上伸长形成 一层“开放性”细胞同时核质域内的胚乳游离核也在同一个方向上由球形伸长 成椭球形，核基放射微管也重新排列，集中到核的两端呈放射状排列，来自于高尔 基体和内质网的含有细胞壁前体物质的小泡，在此聚集形成不定性成膜体再由不 定性成膜体引导初始垂周壁的向心游离生长，伸长的“开放性”细胞进行平周分 裂形成多层胚乳细胞，最终在胚囊中央相汇，中央大液泡消失( 图3 ) 新形成的胚 乳细胞进行一段时间的分裂以增生胚乳组织 胡豳倒 蓑 a b cde 图3 核质域极化形成初始垂周壁和。开放性”细胞的过程( 自o d d - a r n e0 1 s e n 等l 嘲) 核周放射徽管介导形成援质域b 援周放射徽管重新捧布c 在相邻核质域之问形成韧始垂周壁并在不定 成膜体的引导下向心生长d 。开放性4 绷胞进行平周分裂产生成膜体e 由成膜体形成平周董 4 2 初始平周壁的发生 对于胚乳细胞化时初始平周壁的来源，至今已报导的研究结果，也有两种不 同的观点。一种认为：胚囊壁内突向心生长形成自由生长壁，自由生长壁末端发 生分支，两相邻自由生长壁的分支末端相互融合，形成初始平周壁( 图4 ) 如繁 缕( n e w c o m b w 和f o w k e l c ，1 9 7 3 ) 、白刺( 李师翁等，1 9 9 1 ) 、绣球百合( n e - c o m b ， 1 9 7 8 ) 、小麦( w o r r i s o n 和0 ，b r i e n ，1 9 7 6 ) 和花生( 邢树平和席湘嫒，1 9 9 5 ) 等。 另外，也有一些学者认为初始平周壁是由细胞板形成的，当初始垂周壁形成后， 胚乳游离核即进行平周分裂，形成成膜体和细胞扳，由细胞板形成初始平周壁， 并与垂周壁融合，形成两层细胞，外层为具有完整细胞壁的胚乳细胞而内层仍为 。开放性”细胞在大葱( 席湘嫒，1 9 8 7 ) 、菜豆( y o u n g 和c a v e y 等，1 9 8 8 ) 、小 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 9 麦( f i n e r a n 等，1 9 8 2 ) 和石龙芮( x u 和v a n 1 9 9 3 ) 等植物上都观察到胚乳细胞以这 种方式形成初始平周壁 圈4 白刺以自由生长壁末端分又的方式形成初始平周壁( 自李师翁等1 9 9 1 ) 示游离胚乳棱& 示游离核进行有丝分裂，形成成膜体和细胞扳c 细胞板形成后其两端开始壁的游离生 长，近胚囊壁端迅速与胚囊壁结合，另一靖向心游离生长d 向心的游离束墙发生分枝e 分技末端在中央液 泡一确融合形成胚乳细胞f 胚乳细胞进行早周分裂，向心的分枝继续游离生长g 通过早周分裂和向心游离 末端的融合增加胚乳细胞层 爱德斯卡( e r d e l s k ao ) 根据胚和胚乳发育的时间先后关系将植物分为3 类： ( 1 ) 胚乳发育比胚发育快 ( 2 ) 胚乳和胚发育几乎同时 ( 3 ) 胚的发育比胚乳快 车塔莱卡( p c hi t r a l e k h a ) 根据爱德斯卡的分类将初始垂周壁分别来自胚 囊壁突起和细胞板的植物简单归类属于上述类型( 1 ) 和大多数类型( 2 ) 的植 物，其初始垂周壁主要来自细胞板，如大葱、小麦、石龙芮和细叶阿福花等类 型( 3 ) 的植物和少数类型( 2 ) 的植物，其初始垂周壁主要来自胚囊壁内突形成 的自由生长壁，如繁缕、菜豆、向日葵和绣球百合等 4 3 胚乳细胞壁的组成物质 胚乳细胞壁和体细胞壁都有木聚糖( b - i ，4 - 葡萄糖) 的存在( m o o r e 等，1 9 8 6 ： z h a n g 和s t a e h e l i n ，1 9 9 2 ；o t e g u i 和s t a e h e l i n ，2 0 0 0 ) ，木聚糖在高尔基体中 蹲哑瘿 扬州大学硕士学位 1 0 合成，以分泌小泡的形式参与细胞板的形成，进而形成细胞壁在体细胞中，木 聚糖的末端残基岩藻糖始终存在，但在胚乳细胞中，岩藻塘自始至终都不存在 r e i d ( 1 9 8 5 ) 也发现胚乳细胞中木聚糖缺少末端残基岩藻糖l e v y 等( 1 9 9 l ，1 9 9 7 ) 认为木聚糖的末端残基岩藻糖具有稳定木聚糖构象的作用，使之与纤维素纤丝相 连接。丽岩藻糖残基的缺失，使木聚糖丧失了原有的构象。而不能与纤维素相连。 这样，木聚糖更易受到水解酶的水解，也即缺少岩藻糖的木聚糖更适合作为多糖 的贮存形式同时，由于纤维素没有木聚糖的连接而变得很少交联，进而导致细 胞壁机械强度很弱，可塑性增强 o t e g u i 和s t a e h e l i n ( 2 0 0 0 ) 利用免疫细胞化学定位研究发现：胼胝质( e l ， 3 一葡萄糖) 在胚乳细胞板的形成中就出现，这一点与体细胞在细胞板形成时相似 ( s a m u e l s 等，1 9 9 5 ) ，但与体细胞不同的是，胼胝质在体细胞细胞壁形成后消失， 而胚乳细胞壁中胼胝质并不消失。b r o w n 等( 1 9 9 7 ) 在谷类佟物胚乳细胞壁中也观察 到胼胝质的存在。o t e g u i 和s t a e h e l i n ( 2 0 0 0 ) 认为，胼胝质在胚乳细胞壁中可能 起两个作用：第一是作为碳水化合物的一种贮存形式，为以后胚的发育提供营养物 质：第二是由于胼胝质具有胶状的物理特性。能够提高胚乳细胞壁的可塑性，尤 其是在快速发育胚周围的胚乳细胞，其形状改变为胚的扩张提供可能 4 4 壁物质的来源 不同植物胚乳的细胞化过程中，构成壁的物质来源可能不同已有报道认为 来源有；( 1 ) 高尔基体，如在向日葵中，壁生长主要靠其末端的高尔基体合成 ( n e w c o m b1 9 7 3 ) ：( 2 ) 内质网，如花生( 邢树平和席湘嫒1 9 9 5 ) ；( 3 ) 游离核膜， 外层核膜发生明显外突小泡是从外突的核膜上分离下来的( 国凤利和邵宗泽 1 9 9 1 ) ：( 4 ) 线粒体，如白刺( n i t r a r i as i b i r i c a ) ( 李师翁等1 9 9 2 ) ；( 5 ) 外围珠 心解体产物，如小麦( 张伟成等1 9 9 0 ) ；( 6 ) 微体，如繁缕( n e w c o m b 和f o w k e1 9 7 3 ) 在某一种植物中往往有2 种或2 种以上的来源，如在棉花中，除高尔基体小泡在 壁生长末端融合外，内质网和微管也可能与这种壁的形成有关( j e n s e n 等1 9 7 7 ) 王忠认为：细胞质中高尔基体小泡等小囊泡先集中排列在两核问的同个面上， 然后向四周延伸组成成膜体，成膜体内的小泡膜相互融合形成新细胞的质膜，其 中内含物连成一片，构成细胞板，穿插在成膜体中的内质网成为胞间连丝细胞 板形成后，造壁物质在高尔基体小泡内继续运输，并释放到质膜外，使新形成的 壁就得以充实，也就是说，合成胚囊细胞壁的物质可能是通过“内质两合成 高尔基体加工高尔基体小泡运输小泡与质膜融合后外排”途径向质膜外 转运成壁物质的( 王忠等2 0 0 5 ) 。 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 l l 5 研究的目的和意义 水稻、小麦、大麦的胚乳是人类食粮、禽畜饲料和食品工业原料的主要来源。 胚乳是由初生胚乳核反复分裂后发育起来的营养组织，在水稻，小麦和大麦的籽 粒中占据着较大的比重它在胚的发育和种子萌发过程中起着重要的作用稻麦 胚乳细胞的分裂、发育状况决定着稻米和麦粒的产量与品质，影响稻麦的经济效 益。 关于核型胚乳细胞化的研究，因不同的研究者所采用的材料、方法的不同， 得出的结论也各不相同，甚至对于同一种材料，不同的研究者得出的结论也不相 同。本研究利用树脂包埋结合半薄、超薄切片法研究了稻麦胚乳游离核细胞化过 程中初始细胞壁的来源，为核型胚乳的细胞化以及细胞壁的充实研究提供了新的 理论和方法。 扬州大学硕士学位 1 2 材料与方法 1 试验材料 1 1 试验材料： 水稻：选用扬稻6 号( 扬州里下河农科所供种) 小麦：选用扬麦1 2 号和扬麦1 5 号两个品种 大麦：选用沪1 1 5 4 ( 开颖) 1 2 试验设计： 将以上材料在适宜的播种期播种。水稻通常在五月中旬播种育秧，于六月中旬 移栽至大田，正常田间管理；大、小麦于十月中旬播种正常田问管理以上材 料常采用分期播种的形式以延长花期。 1 3 标花： 于盛花期的上午采用挂牌( 在穗茎上挂附有开花日期的塑科小牌) 与点颍( 水 稻) 或剪芒( 大、小麦) 的方法准确标记颖花开放的时间。若遇不良气候( 阴雨 天气) 则会影响开花，对于水稻可以采用c & 促进开花对于大、小麦可以采用搓 穗的方法促进颖花开放。 1 4 取样： 水稻在花后2 3 天，大、小麦花后3 4 天，每天分别于上午八点，下午一点和 六点取样三次，水稻花后4 5 天，大、小麦花后5 6 天改为每天上午八点、下 午六点取样两次。 2 实验方法： 主要采用树脂切片结合电镜观察法以及整体解剖法研究胚乳的细胞化过程 2 1 材料的同定 ( 1 ) 管瓶编号：根据固定样本数编写管瓶号码 ( 2 ) 前固定：剥出籽粒用双面刀片将其切成l m m 厚的薄片，把薄片放入盛有l 2 m l2 5 的戊二醛固定液的管瓶中进行前固定，固定时要将管瓶盖盖紧。 将管瓶放在振荡机上低速振荡3 h 左右。 ( 3 ) 清洗：吸去管瓶中的前固定液，加入l 2 m l 二甲基砷酸钠缓冲液于管瓶， 将管瓶放在振荡机上低速振荡，l o m i n 后吸去缓冲液。共清洗3 次，每次 l o m i n 。 ( 4 ) 后固定：清洗后，管瓶中加入0 5 m l1 的锇酸固定液，振荡固定3 h 左右， 使固定材料逐渐变黑。 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究1 3 2 2 脱水： ( 1 ) 用吸管吸去管瓶中的后固定液，用二甲基砷酸钠缓冲液清冼管瓶和固定的 材料三次，每次l o m i n ( 2 ) 用2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、9 0 、9 5 的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度 处理2 0 3 0 m i n ( 3 ) 1 0 0 乙醇浸渍材料3 次，每次3 0 r a i n 2 3 置换l ( 1 ) 在管瓶中加入2 m l 无水乙醇和i m l 环氧丙烷处理材料l o m i n ( 2 ) 向管瓶中追加i m l 环氧丙烷，处理材料l o m i n ( 3 ) 向管瓶中再追加2 m l 环氧丙烷，处理材料l o m i n ( 4 ) 倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液。加入纯环氧丙烷3 次。每次 l o m i n 在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中湿 气进入有机溶液 2 4 浸透： ( 1 ) 在管瓶中加入i m l 环氧丙烷，向内滴入l 滴s p u r r 树脂，将管瓶放在振荡 机上低速振荡1 2 h ( 2 ) 向管瓶中追加1 至数滴s p u r r 树脂，使s p u r r 树脂的浓度逐渐提高，每滴 加一次s p u r r 树脂，振荡l 2 h 。共滴加0 3 m l 左右的树脂，使树脂浓度达 到2 5 左右。 ( 3 ) 用吸管吸去管瓶中0 5 0 8 m l 的环氧丙烷和s p u r r 树脂的混合液，然后加 入纯s p u r r 树脂0 5 m l ，使树脂浓度达到5 0 6 0 左右，振荡2 3 h ( 4 ) 用吸管吸去管瓶中的环氧丙烷和s p u r r 树脂的混合液加入0 5 o 8 m l 的 s p u r r 树脂，振荡2 3 h ( 5 ) 更换新配制的s p u r r 树脂i m l ，振荡1 2 h 左右 2 5 包埋与聚合： ( 1 ) 调温：先将恒温箱调至温度至7 0 1 2 ，包埋模事前烘干置干燥器中存放 ( 2 ) 浸透：在包埋模的中放上已浸透的材料，用滴管吸取新配制的s p u r r 树脂， 并注满每个穴孔，用镊子拨正样品的位置 ( 3 ) 聚合：将包埋样品的包埋模放入7 0 1 2 恒温箱中聚合，1 2 h 后取出置干燥器 中存放 2 6 切片与观察： 扬州大学硕士学位 1 4 包埋好的材科在l e i c a 半薄切片机上切成厚约1i im 的的半薄切片，l 甲苯 胺蓝染色后置于光镜下观察。在此观察的基础上，进一步制作5 0 h m 的超薄切片， 经柠檬酸铅和醋酸铀双重染色后，在透射电镜下观察胚乳游离核细胞化过程的 超微结构 2 7 荧光观察： 采用整体解翻法在体视显微镜下执出水稻、大小麦的胚囊，展片后置于荧光 显微镜下观察、拍照 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 1 5 结果与分析 1 胚乳游离核的发育及胚乳合胞体的形成 双受精完成后，由两个极核与一个精子融合形成三倍体的初生胚乳核，接着 初生胚乳核分裂形成两个胚乳游离核后便开始胚乳游离核的发育。胚乳游离核较 大，呈球状( 图版i ，1 - 2 、4 ) 在分裂间期核膜明显核中央有一个大核仁，大、 小麦的胚乳游离核中有数个核仁，常为2 3 个核仁( 图版i ，l 、3 ) ，核周围的原 生质中富含质体、线粒体、高尔基体、内质网和液泡等细胞器( 图版i 。4 ) 游 离核的分裂能力很强，由游离核分裂产生的子核都能继续成倍分裂。在游离核增 殖的同时，核周围的细胞质以及其中的细胞器也在不断增殖胚乳游离核起初分 布在受精卵与反足细胞之间，以后增殖的游离核排列在胚囊边缘多以垂周分裂 方式形成一层胚乳核层。近胚端的游离核分裂最快使胚很快埋没在多核体的胚 乳组织中。据观察胚乳游离核的分裂方式有两种：有丝分裂和无丝分裂( 图版i ， 5 箭头示无丝分裂) ，以有丝分裂为主胚乳游离核最初只进行核分裂而不进行胞 质分裂，因此分裂产生的胚乳游离核均匀的散布在周围的细胞质中。刚形成的胚 乳游离核位于胚囊腔中央近珠孔端胚的周围( 图版i ，6 ) ，随着分裂的不断进行， 胚乳游离核的数量不断增多，同时由于胚囊中央大液泡的不断增大，使得胚乳游离 核逐渐贴近胚囊壁并沿着胚囊壁朝着合点端扩展。在胚乳游离核发育的早期，珠 心组织非常发达，尤以珠孔端为甚，厚厚的珠心组织包裹着胚囊( 图版i ，7 ) 由于胚乳游离核只进行核分裂不进行胞质分裂，分裂后不立即形成细胞壁，这使 得胚乳游离核在数量上得以快速增加，至授粉后l d ，在胚囊壁与中央大液泡膜之间 形成一薄层，这一时期的胚囊称之为胚乳合胞体( s y n c y t i u m ) ( 图版i 。8 ) 水稻大约在授粉后2 4 h ，花粉管已从珠孔端进入胚囊( 图版i i 。l 2 ) ，释放 出2 个精细胞完成双受精，形成三倍体的初生胚乳核( 原核) 初生胚乳核不形成 细胞壁，不进入静止期，直接进行分裂，在授粉后约1 2 小时，可观察到由胚乳原 核分裂产生胚乳游离核( 图版i i ，5 ) ，增加的游离核，均匀的分布于胚囊边缘。 至授粉后约3 6 小时，胚乳游离核在中央液泡膜与胚囊壁之间形成一薄层从胚囊 纵切面观察：游离核之间通过细胞质里串珠状连接在一起( 图版i i ，6 、8 ) 随着 胚乳游离核数量的不断增加，游离核之间的间距逐渐缩短( 有的甚至出现双层游 离核的结构) 细胞质逐渐增多将胚乳游离核包裹起来( 图版i i ，7 ) ，串珠状结构 也随之消失。 在游离核的发育初期，核的分裂方式以有丝分裂为主，且分裂比较同步，都 扬州大学硕士学位 1 6 处于分裂问期或处于分裂相，( 图版i i ，8 ) 其后随着游离核数目的增加，分裂的 同步性降低，无丝分裂的比例增加。伴随着胚乳游离核分裂的不断进行水稻的 胚囊也随之纵向伸长生长，其结果是反足极与胚间的距离拉长。随着游离核的快 速分裂和游离核数目的不断增加，胚乳合胞体的中央细胞也不断扩大，细胞质连 同游离核被挤向胚囊的周围，从而形成胚乳囊。 大、小麦的花粉管进入胚囊的时间要比水稻稍晚。大约在授粉后3 5 小时才 能进入胚囊释放出两个精子完成双受精( 图版i i ，3 4 ) 初生胚乳核刚形成不久 就开始进行第一次有丝分裂，形成两个胚乳游离核。随后，胚乳游离核分裂较为 同步，速度较快，大致每小时分裂一次，这使得胚乳游离核大量增值：开花后l 天， 胚乳游离核可达5 0 8 0 个，沿着胚囊内壁分布：开花后2 3 天胚乳核游离核的 数目进一步增加，分裂不再同步，游离核间的间距缩短，它们以原生质互相联络， 在胚囊内壁铺成一薄层：直到开花后3 4 天，在布满胚囊内壁的游离核之间才产 生细胞壁，形成一层胚乳细胞。对开花后2 天的大、小麦籽粒沿着与腹沟平行和 垂直的方向分别进行纵向和横向切片发现：此时的胚乳游离核在胚囊中不再呈均 匀分布了，分裂速度也是不均等的：胚周围的游离核分裂速度最快，数量也最多 ( 图版i ，6 ) ，花后2 天已形成大量游离核聚集在胚的周围，细胞质发达：靠近 背部维管束的一侧，游离核分裂速度较快，形成的胚乳游离核较多，核间距较短， 细胞质也较为浓厚，游离核被周围的细胞质完全包裹( 图版i i i 1 2 ) ；而靠近籽 粒腹部的一侧，胚乳游离核分裂的速度最慢形成的胚乳游离核较少，游离核之 间的闻距较大，周围的细胞质较少，部分游离核被细胞质包裹，部分游离核裸露， 其横断面呈串珠状的独特的核质结构。( 图版m ，l 3 ) 谢兆伟：关于稻麦胚乳游离核细胞化的研究 1 7 图版i 稻麦胚乳游离核的结构 1 小麦花后2 3 天纵切，示多核仁结构x 4 0 02 水稻花后2 天纵切，示胚乳游离核x 4 0 0 3 小麦花后2 天游离核超微结构x 3 9 0 04 水稻花后2 3 天游离核超微结构x 9 7 0 05 小 麦花后2 3 天胚囊纵切，黑箭头示无丝分裂2 0 06 小麦花后2 天胚囊纵切1 0 07 小 麦花后2 天胚囊纵切x1 0 08 小麦花后2 3 天胚囊纵切，示胚乳合胞体2 0 0 扬州大学硕士学位1 8 圈版稻麦花耪的萌发、生长授粉及游离核的结构 l 水稻花粉粒在柱头发x 2 0 02 水稻花粉管朝向子房生长2 0 03 大麦花粉粒在柱头萌 发x 2 0 04 大麦花粉管朝向予房生长x 2 0 05 水稻授粉后1 2 h 胚乳游离核x 2 0 06 小麦花 后2 天胚囊纵切，示胚乳合胞体串珠状结构x 2 0 07 小麦花后2 3 天胚囊纵切。示胚乳合 胞体4 0 0