（植物病理学专业论文）无毒基因AvrPto、AvrPtoB与感病番茄互作基因的初步研究.pdf

摘要番茄细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害，p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o( p s t ) 为其病原菌，r f 与番茄的互作系统是研究植物抗感病机理的典型模式系统。p s t 存在两种无毒基因：a v r p t o 和a v r p t o b ，它们编码的蛋白质均能与番茄抗病基因p t o 编码的s e r - t h r 蛋白激酶互作，符合f l o r “基因对基因”学说。a v r p t o 和a v r p t o b 在表达p t o 的抗病植物中，与p t o 互作，表现无毒功能，引发植物防御反应；而在缺失p t o 的植物中，它们具有毒性，促进细菌的生长。l e s c p t h 5 是感病番茄p t o 基因家族成员之一，与p t o 是同源基因，其编码的蛋白质具有激酶活性，推测其可能与p t o 类似，能够与a v r p t o 、a v r p t o b 互作。本文通过l e s c p t h 5 表达分析、l e s c p t h 5 与a v r p t o 、a v r p t o b 互作分析以及利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选与a v r p t o 、a v r p t o b 互作的蛋白，从而初步研究a v r p t o 和a v r p t o b 作为毒性因子的致病机理。研究的目的在于找到a w p m 和a v r p t o b 作为毒性因子在感病番茄中蔬四号中的作用靶标。根据l e s c p t h 5 基因序列设计引物，成功的利用r t - p c r 技术确定了l e s c p t h 5 能够表达，同时对该基因从核苷酸和氨基酸水平进行分析，为研究l e s c p t h 5 与a v r p t o 、a v r p t o b 的互作提供了基础。p c r 扩增得到a v r p t o 、a v r p t o b 以及l e s c p t h 5 特异性产物，并将目的基因分别连接到诱饵载体( p g b k t 7 ) 和猎物载体( p g a d t 7 ) 上，成功构建了诱饵载体p g b k t 7 - a v r p t o 、p g b k t 7 - a v r p t o b 和p g b k 1 7 l e s c p t h 5 以及猎物载体p g a d t 7 - a v r p t o 、p g a d t 7 - a v r p t o b 和p o a d t 7 l e s c p t h 5 。利用酵母双杂交系统，共转化分析l e s c p t h 5 与a v r p t o 、a v r p t o b 的互作关系，结果发现l e s c p t h 5 既不能与无毒蛋白a v r p t o 互作，也不能与a v r p m b 互作。因此推测，l e s c p t h 5 不是a v r p t o 和a v r p t o b 作为毒性因子的作用靶标，但是其具体功能还不清楚。成功的构建了感病番茄中蔬四号的c d n a 文库，并分别以a v r p t o 、a v r p t o b 作为诱饵蛋白，筛选与其互作的c d n a 编码蛋白。最终筛选到与a v r p t o 互作的阳性克隆1 9 个，将其分为四类：与a v r p t o b 互作的阳性克隆1 1 个，将其分为两类。发现与番茄细菌性斑点病菌a v r p m 、a w p m b互作的蛋白质主要是参与寄主光合作用的蛋白质，没有筛选到p r o 基因家族的任何成员，可见，： t o 基因家族成员并不是a v r p t o 和a v r p t o b 作为毒性因子的靶标。本实验围绕a v r p m 和a v r p t o b 在感病番茄中蔬四号中的作用靶标，证明k s 印t h 5 不能与a v r p t o 和a v r p t o b 互作，同时在酵母双杂交系统中筛选到与a v r p t o 、a v r p t o b 互作的蛋白，并发现与a v r p t o 、a v r p t o b 互作的蛋白质主要是参与寄主植物光合作用的蛋白质。推测a v r p t o 和a v r p t o b 作为毒性因子，通过i 型分泌系统进入植物细胞中，与植物光合作用有关的蛋白互作，或者影响卡尔文循环，或者影响叶绿素和叶绿体内相关蛋白质的合成，从而破坏植物光合作用，促进侵袭位点叶肉细胞衰老、死亡，引起细胞坏死。初步解释p s t 无毒基因的致病机理以及感病番茄感病信号转导，为寻找阻断无毒蛋白的作用靶标、控制番茄细菌性斑点病的危害奠定理论基础。关键词：番茄细菌性斑点病菌，无毒基因，致病性，酵母双杂交a b s t r a c tt h et o m a t ob a c t e r i a ls p e a kd i s e a s ei st h em a i nd i s e a s ew h i c hc a l la f f e c t t h et o m a t o sq u a n t i t ya n dq u a l i t y p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o ( p s t ) i st h ep a t h o g e no fb a c t e r i a ls p e c kd i s e a s ei nt o m a t oa n da r a b i d o p s i s t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n s ta n dt o m a t oh a sb e e ne s t a b l i s h e da sat y p i c a lm o d e ls y s t e mo fs t u d y i n gp l a n t - p a t h o g e ni n t e r a c t i o n t h e r ea r et w ot y p e so fa v i m l e n c eg e n e si np s t ：a v r p t oa n da v r p t o b t h e i re n c o d e dp r o t e i n sc a ns e p a r a t e l yi n t e r a c tw i t ht h er e s i s t a n c ep r o t e i np t oo f t o m a t ow h i c hi ss e 卜t h rk i n a s ep r o t e i ns p e c i f i c l y i tm a t c h e sw i t hf l o r sh y p o t h e s i s g e n ef o rg e n e ”l e s c p t h 5i sam e m b e ro f t og e n ef a m i l y , a n di sp t oo r t h o l o g yi nr e s i s t a n c et o m a t ol i n e s ，w h i c hc a ne n c o d ea c t i v ek i n a s ep r o t e i n t h ea v r p t oa n da v r p t o be l i c i ti m m u n i t y a s s o c i a t e dp r o g r a m m e dc e l ld e a t h ( p c d ) w h e ns h o w si nt o m a t op l a n t sc a r t i n gp t o h o w e v e r w h e ni ti si nt h el a c k so fp t op l a n t s ,t h e yf u n c t i o n st os u p p r e s si m m u n i t yi np l a n ta n dp r o m o t eb a c t e r i a lg r o w t h t h i sr e s s e a r c hc l a r i f i e dt h a tt r a n s c r i p t i o no fl e s c p t h 5c a ni d e n t i f yb yr t - p c r i tu s e dt h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e mt oa n a l y s el e s c p t h 5 si n t e r a c t i o nw i t ha v r p t o a v r p t o b i tu s e da v r p t o a v r p t o ba sb a i tt os c r e e ng e n e sw h i c hc a l li n t e r a c tw i t ha v r p t o a v r p t o bi nz h o n g s h u s i h a oe d n al i b r a r y t h eo b j e c t i v eo ft h er e s e a r c hw a sf i n d i n gt h et a r g e t so fa v r p t o a v r p t o ba sv i r l e n c ee f f e c t o r s ，a n da n a l y s e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na v r p t o a v r p t o ba n dl e s c p t h 5 p c rw a su s e dt oa m p l i f yr e v e r s e - t r a n s c i b e dm r n af r o mt o m a t oz h o n g s h u s i h a oi no r d e rt oi d e n t i f yt r a n s c r i b e dl e s c p t h 5 t h ea m p l i f i c a t i o np r o d u c tw a ss e q u e n c e da n dw ed i db i o i n f o r m a t i ca n a l y s i st ot h i sg e n ef r o mb o t hn u c l e o t i d el e v e la n da m i n oa c i dl e v e l t h i sp r o v i d e df u n d a m e n tt oa n a l y s i so ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nl e s c p t h 5a n da v r p t o a v r p t o b a v r p t o 、a v r p t o ba n dl e s c p t h 5s e q u e n c e sw e r ea m p l i f i e dw i t hp r i m e r st h a td e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e da v r p t o 、a v r p t o ba n dl e s c p t h 5s e q u e n c e sa n di n c o r p o r a t e da p p r o p r i a t er e s t r i c t i o ne n z y m es i t e s n ea m p l i f i c a t i o n sw e r ec l o n e di n t ob o t hb a i tv e c t o r ( p g b k t 0a n dp r e yv e c t o r ( p g a d l 7 ) s e p a r a t e l y b yt h ey e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m ，c o t r a n s f o r m e dy e a s ts t r a i na h l 0 9w i t hp g b k t 7 - a v r p t o p g b k i t - a v r p t o ba n dp g a d t t l e s c p t h 5 w ef o u n dl e s c p t h 5c a l ln e i t h e ri n t e r a c tw i t ha v r p t on o ra v r p t o b t h e r e f o r e ，i ts u g g e s t st h a tl e s c p t h 5i sn o tt h et a r g e to fa v r p t o a v r p t o b ，h o w e v e r , t h ef u n c t i o no fl e s c p t h 5i sn o tc l e a r w es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dz h o n g s h u s i h a oe d n al i b r a r yi no r d e rt os c r e e ng e n e sw h i c ha v r p t oo ra v r p t o bc o u l di n t e r a c tw i t h f i n a l l yw es e l e c t e d1 9p o s i t i v ec l o n e sw h i c hc o u l di n t e r a c tw i t ha v r p t oa n dc l a s s i f i e dt h e mi n t o4t y p e s w ea l s of o u n d1 1p o t i v ec l o n e sw h i c hc a l li n t e r a c tw i t ha v r p t o ba n dc l a s s i f i e dt h e mi n t o2d i f f e r e n tt y p e s h o w e v e f ，w ec o u l dn o tf i n da n yt t og e n ef a m i l ym e m b e r s t h ep r o t e i n sw h i c hi n t e r a c t e dw i t ha v r p t o a v r p t o bw e r em o s t l ye f f e c t o r sp a r t i c i p a t i n gi np h o t o s y n t h e s i s t h e s ed a t ai n d i c a t et h a tt t oh o m o l o g si sn o tt h et a r g e to f a v r p t o a v r p t o b t h i sp a p e rw a sa i mt of m dt h et a r g e t so fa v r p t oa n da v r p t o bi ns u s c e p t i b l et o m a t oc u l t i v a rz h o n g s h u s i h a o i tw a sp r o v e dt h a tl e s c p t h 5c a l ln e i t h e ri n t e r a c tw i t ha v r p t on o ra v r p t o b w ea l s os c r e e n e ds o m ep o s i t i v ec l o n e sw h i c hc a ni n t e r a c tw i t ha v r p t oo ra v r p t o ba n dm o s to ft h e mw e r ep r o t e i n sw h i c hp a r t i c i p a t ei nh o s tp h o t o s y n t h e s i s w es u p p o s e dt h a ta v r p t oa n da v r p t o b ，a sv i r l e n c ef a c t o r s ，i n t e r a c t e dw i t hp r o t e i n sw h i c hp a r t i c i p a t ei np h o t o s y n t h e s i s ，c a l li n f l u e n c ec a l v i nc y c l eo rs y n t h e s i so fc h l o r o p h y l la n do t h e rp r o t e i n si nc h l o r o p l a s t c o n s e q u e n t l y , i tl e dt ot h el e a fc e i l sd e a t h t h e s er e s u l t sc a ne x p l a i nal i t t l eb i to fw h yz h o n g s h u s i h a oi ss u s c e p t i b l et ot s t i th e l p e du st ob u i l du pt h ef u n d a m e n t a lt h e o r yo fc o n t r o l l i n gt h et o m a t ob a c t e r i a ls p e a kd i s e a s e k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o ，a v i r u l e n c eg e n e ，p a t h o g e n i c i t y , y e a s tt w o h y b r i ds y s t e mn i英文缩略表v 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：地日娟时间：川年6 ，月1 0 日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)时间：减年6 月l d 日时间：以年g 月、a 日中国农业科学院硕i ：学位论文第一章绪论l第一章绪论1 1 番茄细菌性斑点病研究进展1 1 1 番茄细菌性斑点病及其病原菌简介番茄是重要的经济作物，每年因病虫害的危害，造成其大量减产( 吕晓梅等，2 0 0 2 ) 。番茄细菌性斑点病是危害番茄生产的重要病害之一，为一种世界性病害，主要危害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实。自1 9 3 3 年首次报道以来，在全球2 6 个国家均有发现，我国也于1 9 9 8 年发现。据报道，该病可造成产量5 7 5 的损失( 赵廷昌等，2 0 0 1 ) 。该病的病原菌是丁香假单胞番茄致病变种p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o ( p s t ) 。p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 是农业上重要的植物病原细菌，根据其宿主特异性，该菌可分为5 0多种致病变种( h i r a n oe ta 1 ，2 0 0 0 ) ，愚f 是其中的一种致病变种，该菌菌体短杆状，直或稍弯，大小为0 1 1 l x m x l 5 4 t a m ，革兰氏阴性，在含蔗糖的培养基上能产生绿色荧光，超过4 1 不能生长。该菌株能够侵染番茄和拟南芥( 赵廷昌等，2 0 0 1 ) ，在叶片上能够看到褐色坏死斑点，斑点周围有黄色晕圈。p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t od c 3 0 0 0 是风f 的模式菌株，2 0 0 3 年b u e hc r 等报道了它的全基因组序列，这是丁香假单胞菌属中第一个被完全测序的菌株，此工作的完成为研究a f的致病机理奠定了基础( b u e he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。1 1 2 植物防御反应机制植物机体内存在防御机制，当植物受到病原菌侵袭时，能够检测到病原菌，从而抑制或延迟症状的发生( z i p f e l e t a l ，2 0 0 4 ；z e i d l e r e t a l ，2 0 0 4 ：n u m b e r g e r e t a l ，2 0 0 4 ) 。植物的防御反应包括两种：一种是基础防御反应，包括细胞壁的加厚，防御相关蛋白的表达等( m a r t i n e t a l ，2 0 0 3 ) ；另一种是依赖于抗病蛋白的过敏性坏死反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) ，是指在抗病植物中存在抗病基因( r ) ，其表达的抗病蛋白( r 蛋白) 能够识别病原菌i 型分泌系统( t y p eh is e c r e t i o ns y s t e m ， i t s s ) 的效应因子，与之互作，从而激活植物防御反应系统，引起过敏性坏死反应( h r ) ，过敏性坏死反应的主要表现就是引起侵染位点的局部快速的程序性坏死反应( p r o g r a m e dc e l ld e a t h ，p c d ) ，从而抑制侵染位点病原菌的生长和扩展( g r e e n b e r ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。病原菌必须克服植物防御反应，从中获得营养得以增殖，才能够使植物发病。很多革兰氏阴性菌侵袭植物都需要t r s s ，病原菌通过t r s s 将效应蛋白注入植物体内( a b r a m o v i t c he ta 1 ，2 0 0 4 ；a l f a n o e t a l ，2 0 0 4 ) ，目前已鉴定了5 0 多种可以进入寄主细胞的病原菌效应蛋白( h i r a n oe f a l ，2 0 0 0 ) ，这些效应蛋白进入寄主细胞后，修饰或改变寄主的关键蛋白以改变植物的生理中国农业科学院硕卜学位论文第一章绪论曼曼曼曼曼曼! 皇! 皇曼皇曼皇曼鼍曼鼍曼皇曼! 皇曼鼍曼鼍曼鼍曼1 鼍曼曼曼曼曼曼曼皇量曼皇曼曼曼皇曼皇曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼寡状态，抑制植物防御反应，从而提高病原菌的生存适合度，最终导致其大量增殖，致使植物发病( 韩德俊等，2 0 0 5 ) 。t r s s 中编码i 型泌出通道的h r p ( h ra n dp a t h o g e ni c i t y ) 和h r c ( h ra n dc o n s e r v e d ) 基因、编码效应蛋白的a v r ( a v i r u l e n c e ) 和h o p ( h r p - d e p e n d e n to u tp r o t e i n ，依赖h r p的泌出蛋白1 基因，均决定着植物病原细菌在寄主和非寄主植物上的反应( a l f a n oe t a l ，2 0 0 0 ) 。无毒基因( a v r ) 是病原菌的遗传因子，其编码产物能够激发病原物与寄主特异性互作。病原物无毒基因与植物抗病基因产物之间相互作用导致产生的基因对基因抗病是植物抗病性的重要形式( 叶青静等，2 0 0 5 ) 。无毒基因被认为是一类两性效应因子( b i f u n c t i o n a le f f e c t o r ) ，在决定病原细菌的无毒性和致病性两方面均起作用：在含互补抗病基因植物中表现无毒效应，而在不含互补抗病基因植物中显示毒性效应。虽然大部分无毒蛋白的功能至今还不清楚，但已探清一些无毒蛋白的氮基酸序列和已知蛋白序列同源，如a v r b s 3 、p t h a 以及a v r b 6 都具有n l s( n u c l e a rl o c a l i z a i o ns i g n a l ) 序列，将含有放射性标记的基因嵌入到n l s 区，能定位到细胞核中。这就表明，定位于细胞核对于发挥无毒基因功能是必要的( 陈功友等，2 0 0 2 ) 。1 1 3 番茄细菌性斑点病病原菌无毒基因a v r p t o a v r p t o b风f 存在两种无毒基因：a v r p t o 和a v r p t o b 。这两种无毒基因均已克隆并获得全序列，1 9 9 2 年从n t 中克隆到无毒基l ；! p t a v r p t o ，2 0 0 2 年又克隆到了无毒基 丑a v r p t o b 。a v r p t o 和a v r p t o b 序列一致性很低，分别编码具有1 8 k d 和5 9 k d 的蛋白质。a v r p t o p t o 和a v r p t o b p t o 互作符合f l o r “基因对基因”学说。a v r p t o 和a v r p t o b 通过t r s s进入到植物体中，在缺失 t o 的番茄中，它们是毒性因子，能够促进细菌的生长；在表达p r o的番茄中，它们作为无毒蛋白，能够引起宿主的h r 反应。p t o 存在于抗病番茄中，能够特异性的识别a v r p t o 或a v r p t o b 编码的无毒蛋白，激活植物防御反应系统，从而引发植物的抗病反应( r o n a l de ta 1 ，1 9 9 2 ) 。1 1 3 1 无毒基因a v r p t o无毒基因a v r p t o 编码一个由1 6 4 个氨基酸组成的1 8 k d 亲水性蛋白质，其n 末端具有十四烷基结构域和棕榈酸盐结构域，这两个结构域能将蛋白定位并稳定于植物细胞膜上( s h a n e t a l ，2 0 0 0 ) 。缺失n 末端十四烷基结构域的a v r p t o 突变体g 2 a ，既不能将a v r p t o 定位于植物细胞膜上，也不能与p t o 互作，从而不能引起基于p t o 的抗病反应( s h a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。因此，认为无毒蛋白a v r p t o 在风f 的细胞质中合成，通过t i s s 进入到植物细胞中，在植物细胞膜上与p t o识别、互作、引起植物的抗病反应( y a l o v s k ye ta 1 ，1 9 9 9 ) 。a v r p t o 和其他无毒蛋白一样，在g e n b a n k 和e m b l 中没有发现它的同源序列( s e t u b a l e t a l ，1 9 9 3 ) 。a v r p t o 在表达p r o 的番茄上具有无毒功能，在缺失 t o 的番茄上具有毒性功能。接种内于表达 t o 的番茄中，引起寄主的h r 反应( r o n a l de ta 1 ，1 9 9 2 ) ；将a v r p t o 采用农杆菌的方法转化到表达p t o 的n i c o t i a n at a b a c u m 和n i c o t i a n ab e n t h a m i a n a 的叶片中，能够引起烟草的h r反应( s h a he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。说明a v r p t o 是一个能够单独起作用无毒因子，p t o 基因家族的成员能够直接或间接地识别它，引起抗病反应。2中同农业科学院硕l j 学位论文第一章绪论皇曼曼皇曼穹曼曼曼曼量皇, ,iii_ii-一iiei 皇曼皇皇曼鼍詈量曼曼a v r p t o 和p t o 是否能够直接互作呢? 1 9 9 6 年t a n g 等通过酵母双杂交系统分析，结果表明，a v r p t o 能与p t o 发生高度特异性互作，而与 t o 基因家族的其他成员不能互作。迄今为止，通过纯化的蛋白还不能证明a v r p t o 和p t o 能否在体外互作，因此还不能证明是否有其他宿主蛋白参与互作( t a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。后续的研究发现要激活植物抗病，除了需要a v r p t o 和p t o 外，还需要富含亮氨酸重复( l e u c i n e - r i c hr e p e a t ，l r r ) 的p r f 蛋白( s a l m e r o ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。为了研究a v r p t o p t o 互作机制，s h a l l 等构建了a v r p t o 的多个突变体，发现a w p t o 的1 6 4个氨基酸并不都是与p t o 互作所必须的( s h a ne ta 1 ，2 0 0 0 ；s c o f i e l de ta 1 ，1 9 9 6 ；t a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ；c h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；s h a he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。m 等构建重组a v r p t o 蛋白，即第1 - 9 个氨基酸( 包含十四烷基化结构域和十六酰基化结构域) 和部分a v r p t o 蛋白( 2 9 1 3 3 ) 构成重组蛋白，通过农杆菌方法转化到表达p t o 基因的番茄中，发现仍然能够引起h r 反应( l i ne ta 1 ，2 0 0 5 ) ；去掉n 末端的3 0 个氨基酸以及c 末端的4 0 个氨基酸也不影响a v r p t o 与p t o 在酵母双杂交系统中的互作，说明a v r p t o 的n 末端和c 末端并不是a v r p t o p t o 互作所必须的( s a l m e m ne ta 1 ，1 9 9 6 ) ：点突变a v r p t o 蛋白1 6 4 个氨基酸中的6 0 个不影响其与p t o 的互作( s h a h e t a l ，2 0 0 0 ；c h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；s h a he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。研究还发现a v r p t o 有两个显著的结构域，其中$ 9 4 、1 9 6 和g 9 9 所编码a v r p t o 的一个结构域对于识别p t o 蛋白中n 1 4 5 、p 1 4 6 、s 1 4 7 和$ 1 5 3 编码的结构域很重要，它们可能参与a v r p t o p t o互作( w h l f 甜口z ，2 0 0 4 ) 。a v r p t o 除了能够和p t o 互作，引发p t o 介导的抗病反应之外，还能够抑制非致病菌引起的h r 反应。p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t ot 1 是n b e n t h a m i a n a 的非致病菌，它能够在n b e n t h a m i a n a 上引起h r 反应，然而在此植株上如果同时再接种只s p v t o m a t od c 3 0 0 0 时，这种坏死反应就会被延迟( t a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。1 1 3 2 无毒基因a v r p t o ba v r p t o b 广泛存在于植物病原细菌各菌属中，包括假单胞菌属( p s e u d m o n a s ) 、黄单胞菌属( x a n t h o m o n a s ) 、雷尔氏菌属( r a l s t o n i a ) 和欧文氏菌属( e r w i n i a ) 。a v r p t o b 蛋白一方面枷缺失的植株中增加细菌的毒性，抑制免疫反应及p c d ，促进细菌的生长；另一方面在表龇植物中，a v r p t o b 蛋白通过型分泌系统进入植物细胞，与p t o 激酶互作，引发h r 反应。a v r p t o b 编码一个5 9 k d 的蛋白质，该蛋白是一个组成性的蛋白质，可以分为n 末端和c末端两部分( b u e l l e t a l ，2 0 0 3 ；k i m e t a l ，2 0 0 2 ) ( 见图1 - 1 ) 。a b r a n m o v i t c h 等构建了仅包括n 端1 - 3 0 8 个氨基酸序列的a v r p t o bc 末端缺失突变体，发现该突变体能够在酵母双杂交系统中与p r o 互作，并能引起m b e n t h a m i a n a 的h r 反应( a b r a m o v i t c he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。由此可见，a v r p t o b 的n 端是其与p r o 互作所必须的。a v r p t o b 的c 端( 3 0 8 5 3 3 ) 具有c d s ( c e l ld e a t hs u r p r e s s o r ) 的活性，能够抑制寄主植物的p c d 反应。c 端具有g i n p 结构域，虽然对于a v r p t o b p t o 的互作没有影响，但会影响p t o 引起的h r 反应( k i me ta 1 ，2 0 0 2 ) 。k i m 等构建突变体发现，a w p t o bc 末端的4 4 个氨基酸对于抑制p c d 反应是必须的，当突变该4 4 个氨基酸时，a v r p t o b 突变体就会引起n b e n t h a m i a n a 上的程序性坏死反应，这种p c d 反应的获得表明a v r p t o b 的c d s 活性能够抑制p c d 反应( a b r a m o v i t c he ta 1 ，2 0 0 5 ) 。3中囝农业科学院硕i ：学位论文第一章绪论曼鼍皇曼曼_ 一一li ii；liilii 。i ；n ；i i l 皇皇曼曼曼一yi p t o r s b m e d i a t e dp c dc t e r m i n a lr e g i o n3图1 - 1a v r p t o b 结构特点f i g1 - 1m o d u l a rp r o t e i na v r p t o b在抗病番茄中，a v r p t o b 像a v r p t o 一样，在p r f 存在的情况下，能够和抗病蛋白p t o 互作，引起h r 反应。在t t o 缺失的情况下，推测a v r p t o b 是p c d 的抑制因子，能够抑制p c d 反应，促进细菌的生长。研究发现，转化a v r p t o 和p t o 到n b e n t h a m i a n a 中，能够引起h r 反应( s c o f i e l de t a l ，1 9 9 6 ：a b r a m o v i t c he ta 1 ，2 0 0 3 ；s e s s ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。因此，人们推测当a v r p t o b 和p t o 在n b e n t h a m i a n a 中共表达的时候，也应该能够看到h i t 反应，然而结果却发现，a v r p t o b 和p t o共表达时没有发现基于h r 的p c d 反应，而是引起感病反应。前人研究发现a v r p t o b 的同源基因v i r p p h a 能够抑制基于h r 的p c d 反应，因此推测a v r p t o b 也具有此功能( a b r a m o v i t c h e t a l ，2 0 0 5 ) 。进一步研究发现，a v r p t o b 不仅抑制p t o 介导的p c d ，还抑制抗病蛋白c f 9 和小鼠蛋白b a x 介导的p c d 以及酵母的p c d ( v a n d e r e t a l ，2 0 0 0 ；l a c o m m ee t a l ，1 9 9 9 ) 。由此可见，a v r p t o b可能作用于真核生物p c d 的一个保守因子，从而抑制p c d 反应。r g p t o l l 是t t o 基因突变的番茄品种，当接种野生型d c 3 0 0 0 至r g p t 0 1 1 ，能够引起番茄细菌性斑点病( s a l m e r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。d c 3 0 0 0 ：m u t 5 是c 末端缺失的a v r p t o b 突变体，接种其到r g p t 0 1 1 的植株上，却引起h r 反应。当转入含有完整a v r p t o b 基因的质粒到该突变体中，就会恢复d c 3 0 0 0 ：m u t 5 对r g - p t 0 1 1 的致病性。由此可见，a v r p t o b 的c d s 活性的丧失会令宿主获得对a fd c 3 0 0 0 的免疫性，而重新获得c d s 活性又会使宿主感病( a b r a m o v i t c he ta 1 ，2 0 0 5 ) 。因此，c d s 的活性与病原菌的致病性有关，a v r p t o b 的c 末端能够抑制基于h r 的p c d反应。lz j ，一压巫亘互匝亘童d图l - 2 无毒蛋白a v r p t o b 保守序列分析f 1 9 1 - 2c o n s e r v e dd o m a i na n a l y s i so f a v r p t o b进一步分析a v r p t o b 编码的蛋白结构发现，其c 末端具有真核生物泛素e 3 连接酶( u b i q u i t i np r o t e i nl i g a s e ) 活性，与u - b o x 和r i n g - f i n g e r 同源( j a n j u s e v i ce ta 1 ，2 0 0 6 ) ( 见图1 2 ) 。泛素化是体内蛋白质翻译后重要修饰之一，是蛋白质降解的信号，泛素连接酶e 3 是泛素化过程中的关键酶之一，介导活化的泛素从结合酶e 2 ( u b i q u i t i nc o n j u g a t i n ge n z y m e ) 转移到底物，不同的泛素连接酶作用于不同的底物蛋白，决定了泛素化修饰的特异性( 杨娜等，2 0 0 8 ) 。a v r p t o b l 3 8 7能够特异性的与f e n 激酶互作，激活植物的免疫反应，而由于a v r p t o b 的c 端具有e 3 连接酶活性，能够模拟宿主的e 3 连接酶，特异性的使f e n 泛素化，继而蛋白酶体识别泛素化的f e n ，4中国农业科学院硕【= 学位论文第一章绪论将其降解，从而抑制了f e n 引起的免疫反应( r o s e b r o c ke ta 1 ，2 0 0 7 ) 。这就解释了a f 侵染p t o缺失的番茄，抑制p c d 使其感病的原因。1 1 4 番茄细菌性斑点病抗病基因p r o番茄细菌斑点病抗病基因p r o 为单基因半显性遗传，m a r t i n 等在1 9 9 3 年用图位克隆的方法克隆得到。p r o 是第一个被克隆出来的符合“基因对基因”学说的抗病基因( m a r t i n e t a l ，1 9 9 3 ) 。这个基因的克隆使得寄主与病原物互作的分子机理研究得到迅速的发展。 t o 编码一个具有3 2 1 个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质具有丝氨酸苏氨酸激酶催化域，但是缺少富含亮氨酸重复区域( l r r ) ，同时p t o 激酶缺少跨膜结构域，因此可能定位于植物细胞质中( m a r t i ne ta 1 ，1 9 9 9 ；p a t n t s k ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。p t o 激酶的n 末端具有十四烷基化位点( g 2 ) ，该位点可能将p t o 激酶定位于原生质体膜上。赫番茄2 ；2 擘3 掣翟掣感病番茄- i pj i l l l l一，+e p t h 4p f fe f e ne p t h 3e p t h 2e p l h 5图1 - 3 抗病番茄和感病番茄肋基因家族成员( c h a n g e t a l ，2 0 0 2 )f i g1 - 3t h ep r og e n ef a m i l yi nr e s i s t e n c et o r e r oc u l t i v a rl p i m p i n e l l i f o l i u ma n ds u s c e p t i b l et o m a t oc u l t i v a rl e s c u l e n t u mp t o 是_ p t o 基因家族成员之一，p r o 基因家族既存在于抗病番茄中，也存在于感病番茄中。在抗病番茄n l y c o p e r s i c o np i m p i n e l l i f o l i u m ( p i m p i n e l l i f o l i u m ) 中，p t o 基因家族包括六个成员：而在感病番茄y c 印p 髂记伽e $ c u l e n t u m ( l e s c u l e i l t u m ) 中，仅包括五个成员，p t o 基因缺失( 见图1 3 ) 。工p i m p i n e l l i f o l i u m 和l e s c u l e n t u m 的p t o 基因家族成员之间的亲缘关系如图1 5 所示。e r r s _ p r o 基因介导抗病以及艮打介导倍硫磷敏感性的一个必需因子，它位伽基因家族基因座内，与f e n 基冈相邻。p 瞧白类似于抗病蛋白，