（预防兽医学专业论文）鸭IL8+cDNA克隆与基因组结构分析及其重组蛋白的表达.pdf

摘要 为了阐明鸭自细胞介素8 ( i l 培) 分子特征。获得其重组蛋白，推进禽类i l - 8 的应用研 究，本研究采用同源克隆法首次获得了鸭i l 8 基因( a n p l - i l - 8 ) ，并解析了其基因组结构，表 达与鉴定了a n p l - i l - 8 重组蛋白( r a ，2 p t - i l - 8 ) 。 首先分离了鸭外周血淋巴细胞，采用c o n a 刺激后，提取其总r n a ，构建了e d n a p c r 文库。设计了简并引物，并采用r t - p c r 法扩增了a n p l - i l - 8 一基因片断，采用r a c e - p c r 克 隆了a n p l - l l - 8 基因5 端部分，最后采用a n c h o r e d - p c r 法扩增了全基因。在此基础上，对 a n p l - l l 8 的基因组d n a 进行了克隆。并设计一对表达引物，弧克隆a n p l - l l 罐成熟肽基因，并 插入到p q e 3 0 表达载体，构建了p q e 3 0 a n p l - i l - 8 原核表达系。 结果表明，a n p l i l 8 基因共编码1 0 3 个氨基酸，含2 1 个氨基酸的信号肽和8 2 个氨基酸的 成熟肽；与鸡i l 8 在核苷酸水平上的同源率是8 0 9 ，氨基酸水平上的同源率是9 0 3 。基因 组结构表明该基因含4 个外显子和3 个内含子，外显子序列和c d n a 序列完全一致，i l - 8 分 子进化树揭示了鸭与其它动物的进化关系。构建的p q e 3 0 i a n p l - i l 8 重组子转化大肠杆菌j m l 0 9 i 彳，经诱导表达得到了r a n p b l l 8 。表达蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经离心、超声 破碎、变性、n i - n t a 亲和层析纯化、复性得到了纯的r a n p l - l l 8 。t r i c i n es d s p a g e 电泳分 析表明r a n p l - l l - 8 分子量为9 o k d 。 本文为研究a n p l - i l - 8 在炎症性疾病和免疫应答中的分子作用机理奠定了基础 关键词：鸭，i l - 8 克隆，基因组结构，表达。 a b s t r a c t i no r d e rt oc l a r i f ym o l e c u l a rc h a r a c t e ro fd u c k1 l 一8 ，a n dt oo b t a i ni t sr e c o m b i n a n tp r o t e i n ，a n d t h e nt op r o m o t et h er e s e a r c ho fa v i a ni n t e r l e u k i n - 8 ( i l 一8 ) ，w ec l o n e dd u c k1 1 8 n p l - l l 8 ) f i r s t l ya n d e l u c i d a t e di t sg e n o m i cs t r u c t u r e f i n a l l yr e c o m b i n a n tp r o t e i no f a n p m l - 8 ( r a n p l - i l 8 1w a se x p r e s s e d a n di d e n t i f i e d f i r s t l y , ad u c ke d n ap c rl i b r a r yw i l sc o n s t r u c t e db a s e do ns e p a r a t i n gp e r i p h e r l c 坶m p h o c y t e f r o md u c kb l o o d ，s t i m u l a t e dw i t hc o naa n di s o l a t i o nt o t a lr n af r o mt h ec e l l ss t i m u l a t e d a c c o r d i n g t ot h es e q u e n c e sa l i g n m e n to fc h i c k e n ，h u m a na n do t h e ra n i m a l s ，ap a i ro fd e g e n e r a t ep r i m e rw a s d e s i g n e dt oa m p l i f yaf r a g m e n to ft h ed u c ki n t e r l e u k i n - 8 叫n p l - i l - 8 ) r a c e - p c rw a sa d o p t e dt o a m p l i f yt h e5 e n do f a n p l - l l 一8 a n dt h e na n p l - i l 一8f u l le d n aw a sc l o n e db ya n c h o r - p c r a tt h e s a m et i m e ，t h eg a n o m eo f a n p m l 一8w a sc l o n e da n da n a l y z e di t ss t r u c t u r e f i n a l l yap a i ro fe x p r e s s e d p r i m e rw a sd e s i g n e dt os u b c l o n et h em a t u r ep e p t i d eo f a n p m l 一8 w h i c hw a si n s e r t e di n t op q e 3 0 e x p r e s s i o ns y s t e mt oc o n s t r u c tp q e 3 0 a n p l - i l 一8p r o k a r y o t i cs y s t e m t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec l o n e da n p l - i l 8c o d e d1 0 3a m i n oa c i d sp e p t i d e , i n c l u d i n g2 1a m i n o a c i d so fs i g n a lp e p t i d ea n d8 2a m i n oa c i d sm a t u r ep r o t e i n i ts h a r e sa n8 0 9 n u c l e o t i d ea c i d s h o m o l o g ya n da9 0 3 a m i n oa c i d sh o m o l o g yw i t ht h ec h i c k e n g e n o m eo fa n p m l 8w a sc l o n e d a n da n a l y s i s e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eg e n e n o mi n c l u d e4e x 打o n sa n d3i n t r o n s ，a n dt h es e q u e n c e o f t h ee x t r o n s w a s t h es a m e t o t h e e d n a o f t h e a n p l - i l - 8 t h e p h y l o g e n e t i e t r e e o f l l 一8i n d i c a t e s t h e e v o l u t i o n a r yp a t h w a y st oo t h e ra n i m a l s a tt h es a m et i m e ，ap r o k a r y o t i ee x p r e s s i o ns y s t e mo ft h e p q e 3 0 a n p m l - 8w a sc o n s t r u c t e da n du s e dt oe x p r e s sa n p l - i l 一8 t h ec e l l sw e r ec e n t r i f u g e d s o n i c a t e di no r d e rt og e ti n c l u s i o nb o d i e s ，a n dt h ei n c l u s i o nb o d i e sw e r ep u r i f i e db yt h en i - n t a a f f i n i t y t h er e s u l t so f t r i c i n ed s d p a g es h o wt h a tt h er a n p m l 一8h a dam o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t 9 o k d t h er e s e a r c ho na n p l - i l - 8p r o v i d et h ed a t e sf o rf u r t h e rs t u d yt h em e c h a n i s mo fi n f l a m m a t o r ya n d i m m a n i t yr e s p o n s e so f t h ea n p m l - 8 k e yw o r d ：d u c k ，i l - 8 ，c l o n e ，g e n o m e so r g a n i z a t i o n ，e x p r e s s i o n l i 缩略词 缩略词英文全名中文全名 i l 8i n t e r l e u k i n - 8 白介素。8 l l 8 ri n t e r l e u k i n 8r e c e p t o r 白介索8 受体 c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互： i d n a r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s 快速扩增c d n a 末端 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦炭酸二乙酯 a aa m i n oa c i d 氨基酸 a m pa m p i c i l l i n氨苄青霉素 b pb a s e p a i r 碱基对 d n a d e o x y r i b o n u c l e t e i ca c i d脱氧核糖核酸 d n t p d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e三磷酸脱氧核苷 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 hh o u r 小时 i p t g i s o p r o p y l 一争d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基- b d + 硫代半乳糖苷 k dk i l o d a l t o n 千道尔顿 l b l u r i a - b e r t i n im e d i u m l b 培养基 m gm i l l i g r a m毫克 m i nm i n u t e 分钟 m l m i l l i t e r 毫升 m o l am o l e ，l i t e r 摩尔升 n tn u c l e o t i d e 核苷酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nt e a c f i o n 聚合酶链式反应 r n a s e a r i b o n u e l e a s ea 核糖核苷酸酶a r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s e cs e c o n d 秒 gm i c r o g r a m m e微克 i d m i c r o l i t r e 微升 x g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o t o - 3 一i n d o l y l 一1 3 一d g a i a e t o s i d e5 - 溴- 4 氢3 吲哚1 3 d 半乳糖营 c o na c a n a v a i i n e 刀豆蛋白 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成累。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：卞奇、亚江 时间：噼t 1 月万日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发：轰、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：。酪卫江 导师签名 一 时间：2 晒年f 月西f 1 时间：莎年月矿同 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓l 言 第一章引言 i l 8 是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化性细胞因子( c h e m o k i n e e h e m o t a c t i cc y t o k i n e ) 同时 具有内源性白细胞趋化和活化作用。i l 8 与多种疾病相关，因而抗i l - 8 单抗及相关生物产品在临 床上得到了广泛应用。趋化性细胞因子是一类由组织细胞产生的、具有白细胞趋化活性的肽分子， 属- - d 分子活性肽家族i lj 。人的i l _ 8 是y o s h i m u r l 2 于1 9 8 7 年发现的第一个趋化因子当时被命 名为单核细胞产生的中性粒细胞趋化因子( m o n o c y t e d e r i v e dn e u t r o p h i lc h e m o t a c t i c f a c t o r ，m d n c f ) 1 9 8 8 年，在嗜中性粒细胞国际会议上将其命名为i l 一8 。同年，m a t s u s h i m a 首先克 隆成功人的i l 一8 基因，并且在大肠杆菌中成功表达。随后，小鼠、猪等其他动物的i l 一8 相继被报 道，鸡i l 一8 研究开始于1 9 9 3 年。 迄今为止，人类发现的趋化因子属家族成员有5 0 多个，分子虽在8 1 4 k d a 左右【3 1 。所有的趋 化因子都含有4 个或2 个半胱氨酸，形成特征性的链内二硫键。根据其蛋白质一级结构的特点和细 胞来源进行分类，趋化因子分为四个亚家族：c x c 、c c 、c 、c x 。c 弧家族。i l 一8 是c x c 亚家族一重 要成员，根据氨基酸序列分析，i l 一8 分子量为8 k d ，耐热。在p h 值为1 0 的条件下，3h 仍能保 持9 0 的活性。它对中性粒细胞有激活作用，可以诱导其变形、趋化、脱颗粒、胞浆内钙离子短 暂上升、台成生物活性脂类、整合素上调以及呼吸爆发等，增强细胞粘附和杀伤病原体的能力4 “。 目前鸟类中，只有鸡的i l - 8 基因被报道，其它鸟类i l 8 基因的分子特征及其重组蛋白生物学 特性的研究还未见报道。 1 i l 一8 及i l 。8 r 的结构与特性 i l 一8 的二级结构为n 螺旋和8 片层。核磁共振晶体衍射结果显示了其三维结构：六股反向 平行的b 片层和两个对称的反向平行的n 螺旋二聚体，如图卜1 所示。等电点为p h8 8 5 ，有 肝素交联，没有糖基。氨基末端和羧基末端均为丝氨酸。i l 一8 的成熟形式有4 种，即分别由7 2 个 ( 7 0 ) 、7 7 个( 1 7 ) 、7 0 个( 8 9 6 ) 和6 9 个( 5 ) 氨基酸残基组成”3 。i l 一8 前体，由9 9 个氨 基酸残基组成、其n 一端的2 2 个氨基酸残基构成引导序列。由白细胞产生i l 一8 的m r n a 3 端a u t 丰富， 使m r n a 高度不稳定而且容易降解，其半衰期一般小于l h 。 从人基因组d n a 中克隆出来的i l 一8 基因全长5 1 9 1 b p ”1 。由4 个外显子和3 个内含子组成。 其1 8k b 的m r n a 翻译为9 9 个氨基酸组成的前体蛋白。i l - 8 的5 1 端存在一些转录调控元件的结合 位点，这些结合位点包括糖皮质激素受体。在i l - 8 的第7 、9 、3 4 和5 0 位上均有4 个保守性半胱 氨酸残基，在n 端4 、5 和6 位置有- - e l r 序列( g l u l e u - a r g ) 。关于i l 一8 基因表达的调节，目前的 文献主要研究i l 一8 基因在转录水平上的调控，但是也有研究转录后水平调控的” i l - r 属于g 蛋白藕联受体超家族成员，它有保守的氨基酸结构胞内区与g 蛋白偶联，其典型 特征为具有7 个穿膜区，胞内区有与g 蛋白结合的结构，并在c 末端含丝氨酸，苏氮酸，可产生磷酸化， 参与信号转导。g 蛋白由y 、1 3 、n 三个亚单位组成，y0 亚单位通常形成紧密的二聚体，共同 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓i 言 圈1 - 1i l - 8 和i t - 8 r 受体的三维结构示意图 发挥作用。不同g 蛋白结构上的差别，主要表现在a 亚单位上，n 亚单位的多样性实现了g 蛋 白对多种功能的调节。不同的n 亚单位都有g t p 结合位点和g t p 酶活性，当外环境中不存在趋 化因子等激动剂时，g 蛋白的三个亚单位呈聚合状态，a 皿单位与g d p 结合，当趋化因子与受 体结合时，g t p 取代g d p ，与a 距单位结合，同时形成游离的y1 3 二聚体，分别活化下游效应 物，如磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) ，肌醇磷脂一3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t 0 1 3 一o hk i n a s e s ， p 1 3 k ) 和蛋白酪氨酸激酶( p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e p t k ) 等”1 。 i l 一8 受体( 1 l 一8r e c e p t o r ，i l 一8 r ) 是一个由5 9k d a 和6 7k d a 孤单位组成的二聚体 糖蛋白存在于许多种类型的细胞中，甚至包括一些不表达i l 一8 的细胞。i l 一8 r 主要分布在中 性粒细胞表面，其受体密度为2 0 0 0 0 受体细胞。在外周血单核细胞为10 4 0 受体细胞，t 淋 巴细胞为3 0 0 受体细胞。i l 一8 r 属于g 蛋白藕联受体家族成员，目前己知至少有两种不同类 型的i l 一8 r ”。i 型受体( c x 2 c r l ) 特异性地与i l 一8 结台( k i = l 2n m o l l ) 。i i 型受体( c x c r 2 ) 除了与i l 一8 结合( 和i l 一8 结合时，k i 1 0 0n m o l l ) 外，还可以和生长调节癌基因( g r 9 ) 、巨 噬细胞炎性蛋白一2 ( mi p 一2 ) 和中性粒细胞激活蛋白一2 ( n ap 2 2 ) 等结合。这两种类型的受体基 因均被定位于人染色体2 q 3 5 。编码两种类型i l 一8 r 的c d n a s 己被分离获得，两者之间c d n a s 编码 的氨基酸序列约有7 8 9 6 的同源性。从中性粒细胞中克隆出的人i l 一8 r c d n a 序列中，含有一个长开 放阅读框( o r f ) 和一个翻译起始部位序列。0 r f 编码一个含有3 5 0 个氨基酸残基的蛋白质分子， 有一个疏水跨膜区和n 连接糖基化部位。 2 i l - 8 介导的信号传导 应用基因定点突变和化学合成肽技术，发现识别i l 一8 信号而激活中性粒细胞的关键区域 在i l 一8 r 的n _ 端。如果删除i l 一8 分子n 一端第一个半胱氨酸前面的谷氨酸一亮氨酸一精氨酸基 序或者置换这三个碱基，与其受体结合的功能完全丧失。i l 一8 介导的信号传导的过程，如图 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 卜2 所示i l 一8 c x c l 8 受体的n 亚单位为百日咳毒素敏感的g c t i ( 6 ) 。当外环境中不存在i l 一8 时，g 蛋白的三个亚单位呈聚合状态，亚单位与g d p 结合；当i l 一8 与受体结合时，g t p 取代 g d p ，与“亚单位结合，同时形成游离的b y 二聚体，所二聚体活化两条主要信号传导途径中的酶： 磷脂酶cb2 、n3 ( p h o s p h o l i p a s ecb2a n db3 ，p l cb2 a n d3 ) 和肌醇磷脂3 激酶 ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t 0 1 3 o hk i n a s e s ，p 1 3 k ) 。p l c 活化后，水解细胞膜上磷酸肌醇酯，产生三 磷酸肌醇( i p 3 ) 和甘油二脂( d a g ) 。三磷酸肌醇促使胞内储存钙的释放，引起胞内钙离子浓 度的快速升高，甘油二脂活化p k c 。p 1 3 k 活化后，快速产生大量的3 ，4 ，5 三磷酸激醇，活化 蛋白激酶b ( p r o t e i nk i n a s eb ，e k b ) 。近来研究表明：所亚单位二聚体还能导致m a p 激酶的 活化，具体机制尚在研究之中：而亚单位的作用不仅是通过与g t p 或g d p 的结合调控d 7 i 垭单 位= 聚体而发挥间接作用，还能通过活化酪氨酸激酶而发挥作用。当g t p 水解后，g a g d p 与p 7 二聚体重新结合，结束信号转导过程1 。 3 i l 一8 的功能 i l 一8 通过与其受体结合而发挥作用，人i l 一8 的生物学作用并不表现出种族特异性，i 卜8 可 以影响下列类型的细胞 ( 1 ) 中性粒细胞“5 ”i l 一8 能够诱导中性粒细胞所有由c h 和f m lp ( f o l l y lp e p t i d e s f m e t l e u p h e ，甲酰肽) 诱发的反应，如激活中性粒细胞运动装置，使其能定向游走( 趋化作用) ：促 使其表达黏附分子：刺激中性粒细胞脱颗粒及呼吸爆发：促进溶酶体酶释放( 髓过氧化物酶、弹 性蛋白酶、b 2 葡萄糖醛酸酶) ：促使胞浆内游离的钙离子浓度快速而短暂地升高：使胞浆的4 8 k d a 蛋白磷酸化。 ( 2 ) t 淋巴细胞“i l 一8 对t 淋巴细胞有趋化作用。局部注射i l 一8 可使局部和引流区淋巴 结的t 淋巴细胞明显增多。在免疫应答过程中，i l 一8 通过对淋巴细胞的趋化作用，来调节淋巴细 胞的再循环，从而影响对抗原的识别和杀伤。 ( 3 ) 嗜碱性粒细胞“”i l 一8 对嗜碱性粒细胞的趋化作用低于对中性粒细胞和t 淋巴细胞。 在i l 一3 存在的条件下，能促使嗜碱性粒细胞大量释放组织胺和白三烯，可能参与速发型超敏反 应的发生。 i l - 8 分子n 端附近位置有一e l r 它可以高亲和力与c x c r 2 受体结合相互作用，该受体高度 表达于中性粒细胞上，引起i l 一8 发挥急性炎症效应的主要原因，促进它们黏附内皮细胞( e c ) 、 随后通过血管壁迁移、组织入侵、沿基质蛋白和细胞表面上趋化冈子梯度迁移到局部炎症部位， 在更高浓度时，趋化因子活化中性粒细胞产生氧基和脱颗粒。随后释放一些颗粒成分，进一步 扩大正在进行的炎性和免疫反正。 i l _ 8 在抗感染，免疫调节方面也有重要作用。它能活化中性粒细胞，引起胞内钙离子浓度 的增加，细胞发生形态改变，脱颗粒、呼吸爆发。增强细胞粘附和杀伤病原体的能力。趋化因 子与急、慢性炎症性疾病和自身免疫病密切相关。机体在病毒、细菌脂多糖等外源刺激或i l l 、 t n f 、i f n 等内源刺激作用下产生大量的趋化因子，趋化白细胞到炎性部位并活化白细胞，显 然趋化因子和趋化因子受体在抵御病原体感染过程中发挥着关键作用。在细菌性上呼吸道感染 耋星垒些丈兰堡圭耋尘窒耋三，。，。，。，。，。，。，。，。，。茎：茎。：尘耋 中细菌刺激呼吸道上皮细胞产生i l - 8 ，i l 一8 趋化嗜中性粒细胞并使之活化，清除细菌。另外 l l - 8 抗肿瘤方面也有重要作用【1 4 ”1 。它可以促进血管生成，为肿瘤的生长提供营养，并为血道 转移提供可能。此外i l - - 8 可能还是一种神经细胞保护剂，以及在心血管系统调节方面可能发 挥作用。i l - - 8 的研究将推动对炎症性疾病、感染的发生、发展。肿瘤免疫以及所有以中性粒 细胞、淋巴细胞浸润为特征的疾病认识【1 6 1 。 f i 蝌u r a2 c h o m o k i m er l l c q i p t o rs i g n a i i n 垡1 r h 。i n i t i a l 酬眦衲e t m r n d o n a - 打蚓 l | c ds 蛔n 醴l 雕i c # 蚓b 睁d a c a n m a r l at h o u t t z m n * 霹曲删隋p o r l 辘a n dn l u s t 缸i 婚 叠呦i n 柏p r d x l m l t y 罐帅r 蝴啦龇t h e 删黼峨i _ 棚曲穗th 啪呲t o 嘶o o 脚 p 瞻钿，p m 船t t 静n i t 鲫嘲瞳m d 幅狮畦_ m o 【晡蕊辨i h 誊蛔柑扯- d no f 飘c d e 培p 1 3 魁姆蠹t 锄砘讧 畦箍，呻摹骜e 赡哇 锄雠1 k 囊强啊黼稿t t 将f a k r 话键嘲t ，r o - s n ek 厢n s of o 捧z 断阮鳓抽- 诳li s 轴d 鼬w 屯w h 刚皤| | b q p - l m l m ag 峨d l t a c t 峥瞅k 岫s r c 4 1 1 挺h 翻靖蛾1 | ! 茂岫i n t 嗍：l l a t ap h 埔b h 峨艚睁耘两矗嘲bs 畦r 哪l a 协t i ma c t s - 恢瞳| o n o f 叶坤雄a 曲确霸嘲鞲嘲i | ；i 蜥蝴茸h 嘲黼f a k 耐嘏耪阻乏捌d ；p o s s 诽静艟嚣弧u v a m l i kq 瞄a 鼬，1 h 酶掣莹诵嘲瞄暂轴6 辅阿9 嘣t ，怕酬卅口“蛳p h 馥艰h o n 由碰l 讲话t h a t d l r i c it | 霉巾鼻冒陆h 峨鞠嘲j c t l 吲t k ) no fp “建喇n q 鬃。啪非a hs 1 - 1 2d o m a i n s s 岫 r n 翻：r q 州黜料弼b 期b t | 嚼艇飘i h ，拥| 妇p 斟x i 劓1 t 矗扣n 白i 勺瞄曙| p 1 3 k so n d i 蛐 l op r o t r 韩钿l dn 枷m q 砖瓣毁、b 删o r l 憎f o r 曲嗍埘c 蛳t _ 珥 e m 鑫is 睁碍i h 唯 h 嚏w 硝m 抽秘蚺b 嘲眄i sl r 如l 蛆粥帅。 i 廖譬翮“ 4 i l 8 的研究进展 围卜2i i - 8 介导的信号传导 迄今为止，人和哺乳动物i l 一8 的研究较为详细，结构和功畿已十分清楚，1 9 8 8 年m a t s u s h i m a , 等7 “”首先报道人i l 8 序列，随后其研究小组将i l 8 基在人类基因图谱上定位于4 q 1 2 - q 2 1 。在人 类医学上，1 9 9 4 年gl i n ，u d a ip 【l ”等对i l 8 r 敲除的小鼠进行了趋化因子方面的研究，发现一些趋 化因子可以通过i l - 8 r 调节动物的适应性免疫应答。gl i n 等【驯克隆了猪i l 8 研究表明在l p s 刺 激猪肺泡巨嗜细胞3 6 h 后i l - 8 的表达量达到最高峰，比静止的肺泡巨嗜细胞的表达含量高3 0 倍之 多，i l - 8 m r n a 的半衰期大约是2 h ，人类的l l - 4 和地塞米松抑止l p s 刺激i l 8 的表达，除了哺乳动 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓i 言 物之外多种鱼类i l 一8 基因研究报道的报道，鲤鱼( c a r p ，c y p n u sc a r p i o ) 1 2 1 1 虹鳟( r a i n b o wt r o u t ， o n c o r h y n c h u s m y k i s s ) ”“、角鲨鱼( d o g f i s h ，t r i a k i ss c y l l i a ) 【1 3 1 , 比目鱼( f l o u n d e r p a r a l i c h t h y s d l i v a c p d u s ) 【2 4 】等。 目前有关禽类i 卜8 研究集中于鸡，b a r k e r ”“等1 9 9 3 年报道了一分子质量为6 k p 的9 e 3 c e f 4 蛋 自，在氨基酸水平上与哺乳动物i l 一8 具有5 1 的同源性，9 e 3 c e f 蛋白可能是鸡类似于哺乳动物的 i l - 8 。研究表明，鸡i l 一8 的基因组o n a 的结构含有4 个外显子和3 个内含子，外显子2 和外显子3 编 码核心蛋白。与人i l 一8 基因组d n a 比较分析表明，鸡的第二个内含子要比人的大，哺乳类的i l 一8 的第二个内含子把一个开放阅读框给隔开。鸡的i l 一85 非翻译区的启动子处有保守的n f 一1 和n 卜 船结合位点，缺乏a p 一1 和c c a t 盒，但存在潜在的a p 一1 结合位点和c c a t 盒和其它的转录结台位 点如i r f 一1 和八聚体，同时鸡i l 一8 基因的启动子处还含有g a t a 基序，这是鸡i l i l 一8 基因所特有 的。在鸡i l 一8 基因3 非翻译区有9 个不稳定a t t t a 基序，这是r n a s e 识别的结台位点，它调控着m r n a 的降解”。通过杂交将鸡i l 一8 定位于第4 号染色体上。与其他哺乳动物相比较鸡i l 一8 蛋白的c 端 稍长，这可能与动物韵亲缘进化关系有关。 i l 一8 分子的基因及基因组的克隆成功为研究其在免疫应答和临床中的应用奠定了基础，i l 一8 可以趋化嗜中性粒细胞等多种免疫细胞到病变部位，促进这些细胞活化，引起炎症反应，在动物 机体的疾病防御中起着重要的作用。w o n g im i n 等”2 0 0 2 年报道了i l - 8 在鸡艾美耳球虫d n a 疫苗中 佐剂应用，i l 一8 和p c d n a 3 一i e 疫苗同时免疫时可以显著抑止球虫的复制，十二指肠上皮淋巴细胞 经流式细胞仪分析计数表明：同时注射i 卜8 和p c d n a 3 一l e dn a 疫苗的鸡的c d 3 + 分子含量明显增 高。另# b i l 一8 还可能促进肿瘤的生长和转移，其机制主要是通过作为白分泌生长因子、血管发生 冈子和促进胶原酶的活性以及影响细胞的粘附移动促进肿瘤的发生、生长和转移。张鑫宇“” 等人对鸡马立克氏病病毒( c i t i d v ) 类白细胞介素8 ( v l l - 8 ) 基因进行了克隆和表达，并测定它的 趋化性。同时人类医学研究也表明，人类多种肿瘤细胞均可高表达i l - 8 ，i l - 8 在癌症的发生发展 中起着十分重要的作用。然而c 胁v 的v i l 一8 与病毒的致病性或与病毒的肿瘤形成上有什么关系， 其生物学功能如何，目前还不是很清楚，但我们可以推测i l 一8 可能与动物的肿瘤性疾病有关。 5 本研究的目的与意义 随着各地农业产业结构的不断调整，我国以鸭、鹅为主要品种的水禽业发展势头强劲，占 整个养殖业的比重不断增加产业化程度也不断提患据联合国粮农组织的统计数据显示，2 0 0 4 年我国鸭、鹅饲养量达3 0 6 亿只，比2 0 0 0 年的2 7 8 亿只增加了1 0 1 ，占世界鸭、鹅总饲 养量的7 5 4 ：鸭、鹅肉的产量达4 1 6 万吨，比2 0 0 0 年增加了8 3 ，占世界鸭、鹅肉总产 量的7 7 5 a 近年来鸭、鹅等水禽肉、蛋的比重不断上升，水禽肉目前已占禽肉总产量的3 2 3 ， 水禽蛋占禽蛋总产量的2 0 3 。同时我们应该看到，水禽业的飞速发展，随着水禽养殖业不断 发展，其疾病也日趋复杂。 中国农业大学硕士学位论空 第一章引言 物之外多种角类i l 一8 基囡研究报道的报道，鲤鱼( c a r p ，c y p r l n u c a r p i o ) 1 2 1 1 虹鳟( r a i n b o w 打o u t ， o n c o r h y n c h u s m y k i s s ) i 2 “、角鲨鱼( d o g f i s h ，t r i a l d ss c y t l i a ) p j 、比目鱼( f l o u n d e r p a r a l i c h t h ) y r o l i v a c u s ) 【2 q 等。 目前有关禽类 l - 8 研究集中丁鸡，b a r k e r 断1 等1 9 9 3 ：f # - 报道了一分子质量为6 k d 的9 e 3 c e f 4 蛋 白，在氨基酸水平上与哺乳动物i l _ 8 具有5 1 的同源性，9 e 3 c e f 蛋白可能是鸡类似于哺乳动物的 i l _ 8 。研究表明，鸡i l 一8 的基因纽d n a 的结构含有4 个外显子和3 个内含子，外显子2 和外硅子3 编 码核心蛋白。与人j l 一8 基因组d n a 比较分析表明，鸡的第二个内含子要比人的大，哺乳类的i l 一8 的第二个内古子把一个开放阅读框给隔开。鸡的i l 一85 非翻译区的启动子处有保守的n f 一1 和n f 一 船结合位点，缺乏a p l 和c c a t 盒，但存在潜在的a p 一1 结台付点和c c a t 盒和其它的转录结台位 点如i r fl 和八聚体，同时鸡i l 一8 基因的启动子处还含有g a t a 基序，这是鸡i l i l 一8 基因所特有 的。在鸡i l 一8 基因3 非翻译区有9 个不稳定a t t t a 基序，这是r n a s e 识别的结台位点，它调控着m r n a 的降解啪。通过杂交将鸡1 l 一8 定位于第4 号染色体上。与其他哺乳动物相比较鸡u 一8 蛋白的c 端 稍氏，这可能与动物的亲缘进化关系有关。 i l _ 8 分子的基因及基因组的克隆成功为研究其在免疫应答和临床中的应用奠定了基础，i l 一8 可以趋化嗜中性粒细胞等多种免疫细胞到病变部位，促进这些细胞活化，引起炎症反应，在动物 机体的疾病防御中起着重要的作用。w o n g im i n 等”2 0 0 2 年报道，i l 一8 在鸡艾美耳球虫d n a 疫苗中 佐剂应用。i l 一8 和p c d n a 3i e 疫苗同时免疫时可以显著抑止球虫的复制，f 二指肠上皮淋巴细胞 姊流式细胞仪分析计数表明：同时注射i l - 8 和p c d n a 3 一i e dn a 疫苗的鸡的c d 3 + 分子含量明显增 高。另# b i l 一8 还可能促进肿瘤的生长和转移，其机制主要是通过作为自分泌生长堋子、血管发生 因子和促进胶原酶的活性以及影响细胞的粘附移动促进肿瘤的发生、生长利转移。张鑫字 等人对鸡马立克氏病病毒( 伽v ) 类白细胞介素8 ( v i i - 8 ) 基因进行了克隆和表达，并测定它的 趋化性。同时人类医学研究也表明，人类多种肿瘤细胞均可高表达i l 矗8 ，i l 一8 在癌症的发生发展 中起着十分重要的作用。然而c 脚v 的v i l 一8 与病毒的致病性或与病毒的肿瘤形成上有什么关系， 茛生物学功能如何，目前还不是很清楚，但我们可以推测i l - 8 可能与动物的肿瘤性疾病有关， 5 本研究的目的与意义 随着各地农业产业结构的不断调整，我国以鸭、鹅为主要品种的水禽业发展势头强劲，占 整个养殖业的比重不断增觚产韭化程度也不断提舔据联合国粮农组织的统计数据显示，2 0 0 4 年我国鸭、鹅饲养量达3 0 6 亿只，比2 0 0 0 年的2 78 亿只增加了1 0 1 ，占世界鸭、鹅总饲 养量的7 5 4 ：鸭、鹅肉的产量达4 1 ，6 万吨，比2 0 0 0 年增加了8 骢，占世界鸭、鹅肉总产 鞋的7 7 5 a 近年来鸭、鹅等水禽肉、蛋的比重不断上升，水禽肉目前已占禽肉总产量的3 2 3 ， 水禽蛋占禽蛋总产量的2 0 3 。同时我们应该看到水禽业的飞速发展。随着水禽养殖业不断 蕴展，其疾病也日趋复杂。 麓展，其疾病也日趋复杂。 中国农业太学硕士学位论文 第一章弓i 言 近年来在亚洲各国的频繁爆发的禽流感，给全球经济带来巨大的损失，引起世界卫生组织 和众多专家学者的极大关注。研究表明，作为我国水禽饲养量最大的鸭，是禽流感病毒的重要 储存宿主。目前还缺乏对鸭的免疫系统的解析，其基础免疫学的研究相对滞后。 细胞因子的研究是基础免疫学的一个重要的组成部分。细胞因子在机体免疫应答过程中起着 十分重要的作用。在某些疾病时，体内细胞因子及其受体表达可发生异常，与机体免疫功能低下 或发生病理损伤有关。因此，在临床免疫学中越来越重视对细胞因子及其受体的检测。随着众多 禽类细胞因子被克隆表达“。细胞因子作为免疫调节和佐剂在家禽中的重要作用被关注，鸭的细 胞因子的研究仍存在许多空白，目前己被克隆的鸭的白细胞介素只有i l 一2 和i l _ 1 6 ，趋化因子的 研究未见报道。本研究所涉及的i l 一8 自发现以来，一直是趋化性细胞因子研究领域的重要对象， 它在动物疾病的防御、免疫应答、特别是发病早期和消除慢性炎症性疾病痛原中发挥重要的作用。 但是i l 8 作用机理较复杂。目前还不是十分清楚。至今为止只有人、猪、鼠和鸡等的i l - 8 己被克 隆的报道，绝大多数的禽类i l 一8 分子水平和蛋白表达的研究还是空白。本研究通过分子生物学方 法克隆和表达了鸭i l 一8 基因，同时阐明其基因组结：希望能为进一步研究鸟类i l 一8 的作用机理与 i 临床应用提供依据。 6 中国农业大学硕士学位论文 第二章鸭i l - 8 的e d n a 分子克隆及序列分析 1 材料 第二章鸭i l 8 的c d n a 分子克隆及序列分析 1 1 鸭 来源于北京市海淀区小营市场 1 2 克隆载体、菌株 克隆载体p o e m te a s yv e c t o r ，购e ：1 p r o m e g a 公司。全长3 0 1 5 b p ，携带有氨苄青霉素抗性基 闽( a m p ) 和l a e 基因，重组体可通过蓝白斑和氨苄抗性双重筛选鉴定。 e c o l ij m l 0 9 菌株，由本实验室保存； 13 主要试剂盒及试剂 总r n a 提取试剂盒 t r l z o l r e a g e n tf g i c o b r l ) l i f et e o h n o l o g i e st o t a lr n ai s o l a t i o nr e a g e n t 反转录试剂盒 a m vr e v e r s en s 嘶e 试剂盒购自t a k a r a 公司 构建c d n a 文库试剂盒均购自t a k a r a 公司( 宝生物工程大连有限公司) ，包括： m - m l vr t a s ec d n as y n t h e s i sk i t 试剂盒：用于合成双链e d n a c d n ap c rl i b r a r yk i t 试剂盒：用于在双链c d n a 两端加上c a 和r a 接头 玻璃奶纯化回收试剂盒购自博大泰克生物公司产品， p g e m o te a s yv e c t o rs y s t e m 购i ；1 p r o g e m a 公司 连接试剂 t ( t a k a r a 产品) 购百奥康生物技术公司 e x t a q 聚合酶，e c o ri 、k p n l 、h i n d 呲等限制性内切酶，一2 0 ( 2 保存，硒拜h i n di l l 反应 温度为3 7 c ，1 0 x hb u f f e h d n a m a r k e r1 0 0 b p 和l k b d n a l a d d e