（水产养殖专业论文）两种泥鳅不同地理居群成体及胚胎发生同工酶分析.pdf

摘要 本文应用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究了泥鳅和大鳞副泥鳅成体的 肝脏、心脏、脑、性腺、肌肉、血液等6 种组织中m d h 、l d h 、p o d 、g 6 p d h 、a - a m y 、 s 0 d 、e s t ，、a l p 、c a t 、a t p 、a d h 和m e 等1 2 种同工酶的表达情况，在此基础上研究 分析了黄河流域、长江流域、珠江流域两种泥鳅六个群体前1 0 种同工酶的遗传变异情况， 并对两种泥鳅胚胎发育过程中的1 0 个不同时期m d h 、l d h 、s o d 、e s t 、a r p 、m e 等6 种同工酶表达的变化进行了初步分析。 通过对6 种组织1 2 种同工酶的组织特异性研究表明两种泥鳅1 2 种同工酶不仅存在不 同程度的组织差异，而且两种泥鳅种间及雌雄个体间也存在较大的差异。大部分同工酶在 肝脏和卵巢中表达活性较高且同工酶类型较多；两种泥鳅在l d h 、m d h 等同工酶存在较 大的差异，可作为两种泥鳅种间的生化遗传标记；两种泥鳅共发现e s t 5 、g 6 p d h 2 、a d h 三条雌性特异性条带，可作为两种泥鳅雌雄个体的生化遗传标记，也可为两种泥鳅性别决 定机制的研究提供线索。 对不同地理居群两种泥鳅的遗传变异情况进行了居群遗传多样性、居群内遗传结构、 居群问遗传关系三个水平上的分析研究。在所分析的3 0 个基因位点中，以p o 9 9 为标准， 两种泥鳅分别检测到7 9 个多态位点，其多态座位比率为o 2 3 3 3 o 3 0 0 0 ，平均杂和度的预 期值为o 0 5 8 6 5 o 0 7 6 2 9 ，在淡水鱼中处于较高水平；两种泥鳅六个群体的遗传偏离指数都 为负值，内繁育系数都大于o ，基因分化系数很低，说明两种泥鳅群体遗传结构不够合理， 可能会对以后两种泥鳅种质资源的保持产生较大影响；就居群间遗传关系看，两种泥鳅种 内遗传相似性很高，最高可达0 9 9 8 9 ，说明三大流域两种泥鳅群体从分类上应当还同属于 一个种群。两种泥鳅种问的遗传距离平均值o 2 9 3 3 ，已达到种间水平，从生化遗传方面， 证明了泥鳅和大鳞副泥鳅的分类地位。 此外本文还研究了两种泥鳅个体发育过程中受精卵、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、 肌节期、尾芽期、孵出期、眼黑色素期、鳔一室期、卵黄吸尽期等1 0 个时期，6 种同工酶 的酶谱变化情况。结果表明两种泥鳅胚胎发育的电泳图谱不仅显示出明显的发育阶段差异 性，而且与成体组织表达也有一定差异，但大多数酶随发育渐趋复杂。两种泥鳅取自同一 地区两对亲本所发育的胚胎，其e s t 同工酶的个体发育谱式具有明显差异，讨论了这种被 称之为个体发育多态性的现象，同时讨论了单胚胎电泳分析方法的创新意义。 关键词：泥鳅大鳞副泥鳅同工酶组织特异性群体遗传变异个体发育 a b s t r a c t n e 嘲) r e s s i o ns p e c 垴c 毋o ft w e l v ei s 0 琴m e s ( l d h ，m d h ，e s ls o d ，p o d ，c a l ：s 。d ，“m e g 6 p d h ，a l p 锄dm e ，a d h ) i ns i xd i 位r e ma d u l tt i s s u e ss u c h 鹊m u s c l e ，h e 矾b m i i l b l o o d 1 h e r 锄dg o n a d s o f 胁g l 州船d ，剐f 胁口l 幽f 淞 a i l d p l m 硎西舒蜊螂如6 p 惯w 掰w e r e s n i d i e db yl l s i n gt h ev e n i c a i p 0 1 y a c r y l a m i d eg c le l e c 讯l p h o r c s i s a c c o r d i n gt o 也i s ，t h eg e n e t i cd j v e r s 时0 ft h ef o f l i l e rt e ni s o 巧m e s ms i x p o p u l 砒i 0 胁nt h ey e l l o w ，c h 蛐j 西柚ga n dz h u j i 柚g 砌v c rw e r e 柚a l y z e d a n dt l l ec h a i l g e si ni s o 巧m e p a 札锄sd 谢n ge m b y o g e n e s i so f t 、v os p e c i e so f l o a c h e sw e r ea l s oi n v c s t i g a t e d w mt 1 1 es t u d yo f t i s s u es p e c i n c 姆o f 铆e l v ci s o 驷e s ，i tw 蹈s h o w e dt h a t 也et i s s u eo f 血et w os p e c i e si s p f o v j d e d i i t l 】p e 壤c ts y s t e mo fi s o 巧m e s a l lo f t h ei s q z y m e sp r e s e n td i m r e n td e g r e e so f 廿s s u es p e c i n c j u 衄ds o m ei s o z y m e sp r e s e mc e n a i nv 砌a t i o nb e t w e e nd i 岱：r e n ts p e c i e s 如dd i 岱。r e n ts e xt o o a sf b rm o s to f t h e i s o 珂m e s ，i n o r el ( i n d sa i l dm o r ea c t i v 谢e sc o l i l db ec 蚰t e s ti nl i v e r 强do v a 哆b e i n gp r e s e n t e dg r e a td i 佼糯n c 。 i nl d h ，m d hi s o 纠m e ，m e yc o u l db e 船i n t e r - s p e c i n cb i o c h e m i c a lg e n 娟cm a r k e ro f 佃os p e c i e sl o a c h e s f u r m e rm o r e ，仰of e m a l e - s p e c 碾cb 柚d s 皿s t 5 ，g 6 p d h 一2 ) h a db e e nf o l l f l di l lt w os p e c i e s ，c o u l db ea s s e x - s p e c m cb i o c h e m i c a lg c n e t i cm a r k e r 蛐dp r o v i d ek e y so nt l l es t l l d yo f t h es e xd e t c m i n a t i o ni nf i s h t h ei s o 珂m eg e n e t i cv a r i 砸o nw 髂i n v e s t i g a t e df o rm4 删棚叩枷胁螂锄dpd 口6 ，) 伽珊p o p u l 越i o n s0 f f h r r i v e r so nt h eb 晒i so f t i s s u e 印e c 访c i t y ，o n l r e e1 e v e l ss u c h 邵g 锄e t i cd i v e r s 时o f p 叩1 1 1 a t i o n s ，g e n e 疵 s 仃u c o fp o p u l 撕o n s ，g e n e 廿cf e l a t i o n s h i pb e t w e e np 叩1 1 1 a t i o n s 3 0l o c iw e r eo b s c r v e db o t hi n 埘： 硎函蒯叛i 砌，甜纽dp 如6 ，) 埘l 凇，a c c o r d j n gt ot h ep o l y m o f p h i cs t a n d 删p o 9 9 1 km e a np r o p o r j o no f p o l y m o r p l l i c1 0 c io ft h et w os p e c i e so fl o h e sw a s0 2 3 3 3 o 3 0 0 0 1 ka v e r a g ee x p e c t e dh 甙e r o 巧9 0 s n yw 船 o 0 5 8 6 5 0 0 7 6 2 9 nr e v e a l e dh i 曲e rg e n e t i cd i v e 商t yi n 铆os p e c i e sw h e nc o m p a 陀dw 袱o t h e r 舶s l l 、v a l e r f i s h h a w e v e t a l ( e sg e n e 廿c 栅c n l r eo fp o p u l a t i o i l si n t oa c c o u n t ，n e g a t i v eg e n c t i cd e v i a t i o ni n d e xo f h 盯d y - w e i n b e 蝎，p o s h i v ei n b r e e d i n gc o e 伍c i e n t ，v e r yl o w e rc o e 珂c i e n to fg e n ed 豫r e 以a t i o l l ，m ep r e s e n t s 觚so fm 硼纠f ，艇口础f 啦a n dp 出6 ，y a 毗螂w 鹊n o tm u c h9 0 0 d t h eu n c o m c i o n a b l eg e n e t i cs 劬c t i l r eo f t w os p e c i e sm a yb eb r i n gs o m e 嘣b c ti ng e n e t i cd i v e r s i t yp r o t e c t a sf 缸嬲g e n e 廿cr e l 硝0 i l s h i pb e t w e e n p 印山a t i o n sw a sc o n m e d ，t l l eg e n e t i cs i m i l a r i l yo fi n n e r - s p e c i e s 抽b o ms p e c i c so f6 s h e sw a sv e r yh i g h ；i t r e a c h e dt 0o 9 9 8 9 ，i n d i c a t i n gt h a tm n 御讲f c 删出纰a n dp 出咖h 蚶舶m t h r e ed r 血a g ea r e 8 sb e l o i l 铲t 0 t h es a m es p e c i e s 锄t a x o l o g y _ t h em e a l ln e ig e n e 廿cd i s t a l l c eo ft w os p e c i e sw a so 2 9 3 3 s i n c er e a c h e d i n t e r - s p e c i e sl e v e lhp r o v e dl l l et a x o n o m i cp o s i 廿o no f 朋：讲喀耐肼c 口耐d ，凇龇d 只d b 6 ，”拼郴a nb i o c h e m i c a l g e n e 廿c s t h ep a t t e m so f e x p r e s s j o na 1 1 dr e g u l a 廿0 n si ns i xi s o 巧m i cs y s t e m s ( l d h ，a t p ，s o d ，e st m 匣柚dm d h ) t t w e r ea l s 0i n v e s t i g a c e di nl l l ee a l l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e s ( 诧r t i l i z e de g g s ，m i db l a s t i l la ，m i dg a s 仉1 1 a ，n e u m h a p p e a 墙i l c e0 f m y o m e r e ，_ c a i l b u d ，h a t c h i i l g ，出i r i d yp i g m e n t e de y e s ，a j rb l a d d e rw i l l lo n ec h 啪b 盯髓dc o m p l e t e 曲s o r 州0 n o fy 0 1 k ) o f 且z n 愕“f m 口l 妇f 淞 a 1 1 d p 出6 ，y 册螂t h er e s u n sd e m o m 仃a l e d m a tl l l e e l e c 仃0 p h o r e t o g r a m so f a l ls i xi s 0 巧m e sn o to n l ye ) i l i b i t c do b v i o l l sd i 丘b r e n c e s 鼬o n ge a r l y 叫t o g e n e 廿cg t a g e s b ma l s os h o w e dc e r t a i nv a r i 撕o nb e 呐e e ne m b r y o g e n e s i sa 1 1 da d u n a tm es 唧et i m et h ec o m p l e x n yo f e l e c 仃o p h o r e t 0 霉毪mp a t t e mt e r l d e dt 0i n c r e 於ew i t l lt h ed e v e l 叩m e n ti nm o s to f 也es i xi s o 驷i cs y s t e m so f m 删g 删，f c 口谢h n 龉a n d 只出6 ，弦玎淞w h a t sm o ，e s tg c n e so f 似os p e c i e si n 锄b r y 0 矗d mt 、v op a r e so f p 盯e n t st a k e n 丘o mt h es a m el o c a l i t ye 枷b nd i 行色r e mp a t 渤1 l so fe x p r e s s j o n s 柚dr e g i l l a t i o n s t h i s p h e n o m 即0 nn 锄e d0 n 蛳蚕e n 嘶cp o l y m o f p 量l i s ma sw e l l 拈t l l e 洒n o v a 廿v es i 鲥f i c 锄c eo fs i n 舀e _ e m b f y o e l e c 协d p h o r e s i sm e t h o dw a s 甜g 嘴d k e yw o r d s ： s p e c i f i c 时； m i s g u n l u sa n g u i l l c a u d a t u s ；p e w 聊嘞淞出6 唧钟淞；i s 0 巧m e ；e l e c 仃0 p h o r c s i s ；t i s s u e g e n e t i cv 州a t i o n0 f p o p u l a t i o n ； e m b r y o g e r l e s i s 【i l 前言 产生的酶变体，即次级同工酶不再认为是同工酶，因为它们没有相对应的编码基因，有的 可能是由实验条件所引起的分子变化，未必都存在于天然生物体内。该定义首次从来源、 功能、结构和理化性质上给同工酶作了较好的界定，也是目前被大多学者所认可的广义的 同工酶概念。但近期有些文献使用的“同工酶”定义则是狭义的，它仅指由不同基因位点 所编码的同一种酶的不同形式( b u t h ，1 9 8 4 ；王仲仁，1 9 9 8 ) 。 同工酶是基因编码的产物，它是与一定的基因位点和相应的基因密不可分的。可以从 以下几个方面加深对其理解：从基因位点角度来理解，同工酶是位点同工酶，既有单位点 的，也有多位点的；从基因的角度来理解，同工酶又包括等位同工酶( 即由单位点上的等 位基因决定的) 和非等位同工酶( 是由多位点上的非等位基因决定的) ：从功能上讲，同工 酶既作用于同一底物，催化相同的化学反应：从结构和理化性质上讲，同工酶其理化及 或生物性质又各不相同。这些特点，都是同工酶酶谱遗传学分析的基础。 同工酶的产生是由于生物进化过程中对代谢的适应。愈是关键的代谢调控酶或愈是与 外界环境密切相关的酶，同工酶也愈普遍，分子类型也愈多。不同的个体，组织器官，发 育阶段与外界环境都可能产生同工酶的差异。从分子遗传的角度来看，同工酶分子的基因 编码，调控与基因活动的差异反应了基因型与表现型的相互关系。同工酶的研究把宏观的 遗传现象联系到微观的分子水平，从基因的产物认识基因的存在及表达，将基因、酶、性 状与结构、功能，调控关系联在一起，可作为遗传生化指标。 同工酶是生物体内基因转录和翻译的直接产物，它反映了编码酶蛋白的d n a 序列信息， 酶蛋白多肽链中的氨基酸序列，是由d n a 分子上的核苷酸序列决定的。同工酶电泳技术就 是针对同种酶不同分子形式( 同工酶) 的结构、大小和所带的电荷差异，在一定的介质和 电流强度下，分离同工酶，然后运用特殊染色，显示分离的电泳图谱，最后通过对电泳显 示谱带的分析，来识别控制这些谱带表达的基因位点和等位基因，推断群体的等位基因频 率和基因型频率，并在此基础上，通过各种参数( 如多态位点比例和平均杂合度等) 对遗 传变异进行定量评估，从而达到在基因水平上研究生物遗传多样性的目的。 同工酶在生物界广泛存在，如群体间、个体间、同一个体的不同组织器官以及不同发 育阶段等均可检测到同工酶。由于同工酶变异丰富，且呈共显性遗传，能比较客观地代表 基因组的变异，因而能较客观地度量群体的遗传变异大小，加上实验条件较为简单，成本 较低，结果快速可靠等优点，该技术已成为一种经济有效的群体遗传学研究手段，是近2 0 年来检测遗传多样性研究最普遍的方法( 孙超等，2 0 0 0 ) 。 同工酶虽然是一个检测遗传多样性的有效手段，但也存在一定的局限性：一是同工酶 2 前言 检测的是基因的表达产物，检测的位点有限，因为表达产物的基因在生物体的整个基因组 只占极少部分，还有大量的遗传变异未能检测出来；二是由于密码子存在简并性，编码基 因d n a 的无义突变无法检测出来，还有可能受到哑基因( 不表达或表达很弱的等位基因) 的影响；三是易受环境条件和生物不同发育阶段的的影响，无法准确确定d n a 水平上的变 异；四是谱带分析有时较为困难，并非有所的带均在电泳图谱上显示出来，相同的带有时 不一定是相同的酶( 王仲仁等，1 9 9 8 ) 。 同工酶电泳技术的基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和组织 化学染色方法显示出同工酶的不同形式，从而鉴别基因型。由于同工酶的分子结构差异和 分子大小、形状的不同，在一定的p h 缓冲系统中带的静电荷的数量和性质有所不同，因 此电泳时在凝胶载体中具有不同的迁移率或迁移方向，使得各同工酶得以分离。电泳后经 特异性的酶组织化学染色，使特定的酶在凝胶中迁移到达的位置出现特异性酶带。同工酶 电泳技术的使用大大促进了人们对种的遗传过程的认识，并且随着生化分析技术的提高， 这种研究方法不断得以完善，研究领域继续拓展。同工酶研究技术目前已经成为综合蛋白 质电泳、组化染色和生物统计学为一体的生化遗传技术。它通过测定蛋白质和酶的遗传差 异，从而为了解基因变异提供了一种有效的手段。因此，已广泛应用于物种及杂种鉴定、 物种倍性鉴定、物种问亲缘关系比较及系统分类、基因连锁分析及基因作图、基因的重复 与演化、胚胎发育过程中的基因表达与调控、进化理论、环境生理、杂交育种以及种群遗 传结构分析等理论研究和实际应用领域。 1 9 6 6 年，h a r r i s 、h u b b y 和l e w o n t i n 分别报道了利用同工酶凝胶电泳技术对人和果 蝇遗传变异的定量研究( h a r r i s ，h u b b y 和l e w o n t i n ，1 9 6 6 ) 是遗传变异研究以至进化研究 历史上发生重要转折的一年，表明对生物的遗传多样性研究进入到酶( 蛋白) 水平。 2 鱼类同工酶研究进展 鱼类的同工酶研究始于1 9 6 0 年，k a p l a n ( k a p l a n ，1 9 6 0 ) 首先研究了鲽科鱼类的l d h 同工酶。1 9 6 5 年，m a r k e t ( “e t ，1 9 6 5 ) 同时分析了3 0 种鱼类的乳酸脱氢酶，指出不同 个体间以及同一个体的不同组织具有特定的同工酶谱。从此许多学者开始对各种鱼类同工 酶及蛋白质多态性进行了研究，并取得了较大的进展。我国在鱼类同工酶方面的研究起步 较晚，1 9 8 2 年，朱蓝菲等对几种鲤科鱼类的l d h 同工酶进行了研究，并探讨了它们间的亲 缘关系，开始了我国的鱼类同工酶研究( 朱蓝菲，1 9 8 2 ) 。而我国学者李思发等( 1 9 8 6 ) 则进行了最早鱼类群体遗传结构和种质资源分析的研究。 前言 2 1 研究对象概况 我国学者自八十年代初朱蓝菲等人首次研究鱼类同工酶以来，鱼类同工酶研究的对 象，不断扩展，范围已达到2 2 个科，3 4 个属，5 0 余种鱼类。近年来此方面的工作主要集 中在鲱形总目，鲤形总目和鲈形总目的鱼类。 鲱形总目研究的鱼类较少，主要有鲑科鲑属的山女鳟妇阳刀口占扬口f 加如( 马波 等，2 0 0 2 ) ：哲罗鱼属的哲罗鱼胁曲d 组扬鲫( 马波等，2 0 0 3 ) ：香鱼科香鱼用e c c 谢d 船船 d c e 厶f 坩( 黄福勇等，2 0 0 4 ) ；银鱼科大银鱼属大银鱼厅口 d 船j a 珊矗阳d j 雌( 张颖 等，2 0 0 5 ) ；新银鱼属的太湖新银鱼脂d 船j 8 册 a 曲叩占拈和寡齿新银鱼脂d 船j 舢j d 妇口出疗t 拈( 林信伟等，1 9 9 1 ) 等； 鲤形总目包含许多重要的经济鱼类，因此在同工酶研究方面发展最快。其中鲤形目鱼 类最受青睐，主要有胭脂鱼科大口胭脂鱼蜘姗c 腑r f n “sa s 如 f c 口s ( 吴琅虎等，2 0 0 3 ) ； 鲤科雅罗鱼亚科青鱼属的青鱼脚印妇r m 妒如np j c 日“s ( 姜建国等，1 9 9 7 ；1 9 9 8 ) ；草鱼 属的草鱼f f 鲫地r m 卵出盯，幽晒( 姜建国等，1 9 9 8 ) ；鳊亚科鲂属的鲂舱朋d 6 r a 船 b 瑚j 加如和团头鲂舱卵j 0 6 阳册a 砌弦印6 厶( 叶星等，2 0 0 1 ) ；鲤亚科鲫属的黑鲫 c 。c a r a s s i u s 、镶啜c a r a s s i u sa u r a t u s 、馘c a r a s s i u sa u r a t u s 、彭译嗵c a r a s s i u s a 啪 “占、鲤鲫纽r a 卵j 凇( 曾任廉等，1 9 9 4 ；朱蓝菲等，1 9 9 5 ：汪亚平等，1 9 9 6 ；汪小 虎等。2 0 0 2 ：赵俊等，2 0 0 4 ) ；鲤属镜鲤。凹j 力船c 泖纸红鲤铆r 如sc a 印掀黄河 鲤。删力wc a 印j d 如锄a t 印、鲤。印f 力晒唧而( 王强等，1 9 9 4 ；尹洪滨等，1 9 9 5 ； 杨太有等，1 9 9 5 ：王小虎等，2 0 0 2 ；王成辉等，2 0 0 4 ) ：鲢甄科鳙属鳙舾占f j 曲龌瞪力d 6 j 拈 ( 姜建国等，1 9 9 8 ) ；鲢属白鲢伽哪f 卉a 抽f 曲f 矗髓肋n j ( 吴力钊等，1 9 9 7 ；姜建国 等，1 9 9 8 ) 。此外还有鲇形目鲇科鲇属大口鲇熨“础腓一甜叩j s 、鲇影舢盘s d f 船 ( 邹桂伟等，1 9 9 7 ) ；熊科黄颡鱼属黄颡鱼角t e d 6 日g 九，s 向j 订d r a c d ( 俞纯芳等，2 0 0 3 ； 肖调义等，2 0 0 4 ；刘文彬等，2 0 0 4 ) ；毓属粗唇婉p j d 占酊s d 馏打d s 扭曲( 俞纯芳等， 2 0 0 3 ) 等。 鲈形总目鱼类有关同工酶方面的研究也很多，主要有合鳃目合鳃科的黄鳝胁印 日m s a 6 ( 周昂等，1 9 9 4 ) ；鲈形目鲈亚目鲈科花鲈属花鲈幽r e 以a 6 ，a z 庙p 。刀j c 船( 李明云等 2 0 0 1 ) ：鲈鱼如f p d a 厶瑚jj 劫册，c “s ( 徐成等2 0 0 1 ) ；鳜属大鳍鳜甜门面删加b r j ( 俞 纯芳等，2 0 0 3 ) 鳜鱼盯门助g 邝a 拍f s j ( 李达等2 0 0 2 ) ；军曹鱼科军曹鱼庇咖c 鲫t m c a 加d 切( 邓恩平等2 0 0 2 ) ；丽鱼科罗非鱼伢日d 曲r 伽如力d ，c 占( 吴婷婷等1 9 9 3 ) ：石 首鱼科黄鱼属大黄鱼丹日u 如s c j a p 胎咖c c a ( 王军等2 0 0 1 ；张海琪等2 0 0 3 ) ；拟石首鱼属 4 刚舌 美国红鱼j a 彻印sd c p 如 “s ( 刘世禄等2 0 0 2 ) ；鲷科黄鲷乃j 砸f 姗j 而加s 、真鲷 哪 r h f 嬲抽h 黑鲷跏r f ，册咖c 印肠坩( 王伟继等2 0 0 1 ；邓恩平等2 0 0 4 ) ；石 鲈科胡椒鲷属花尾胡椒鲷用e c 咖曲船c j 门c 5 、胡椒鲷用e c f 咖曲晒p j c t 淞( 曹 伏君等2 0 0 4 ) ；髭鲷属斜带髭鲷尬阳唧口r s 力n 鲫占( 梁君荣等2 0 0 3 ) ；缎虎鱼亚目弹涂 鱼科大弹涂鱼肋t p 嘲 船砌坩c 矗妇册括( 金春华2 0 0 4 ) 小弹涂鱼删 p 劝如拗，9 杂 色嘏虎鱼6 j u sp d e c j j 拍t 缈s ( 李政等2 0 0 4 ) ；鲳亚目鲳科鲳属鲳& r 侧据j 幽p s s j 门叩s 妇( 刘静等1 9 9 9 ) 攀鲈亚目鳢科鳢属乌鳢日咖j d c 印加j “sa f 到s ( 郝泗城等1 9 9 5 ) ； 月鳢西a 册a 日占妇 f ( 李广丽等1 9 9 9 ；朱春华等2 0 0 3 ) ；鲽形目鲽亚目鲆科牙鲆 忍，a j j 曲z 如s 甜j 抛c p u 占( 尤蜂等1 9 9 9 ；王可玲等1 9 9 6 ) ；鲽科石鲽属石鲽他曲弦即t m c a 加d 妇( 刘曼红等2 0 0 5 ) ；鲰形目纯亚目纯科东方纯属暗纹东方纯尉“卵d 6 岫( 刘 玲玲等1 9 9 8 ；徐成等2 0 0 2 ) 等。 国外学者研究鱼类同工酶的时间较早，其研究对象范围较广。如：软骨鱼纲板鳃亚纲 鲨形总目鲭鲨科鲭鲨属鲭鲨( k i j i m a a ，1 9 8 6 ) ；硬骨鱼纲内鼻孔亚纲肺鱼总目美洲肺鱼 目美洲肺鱼科南美肺鱼工印胁s 姚 p 矾舭，( b a s a g l i a ，2 0 0 0 ) ；非洲肺鱼科非洲肺鱼 m 幻p 据九盯d ”h p c 胞朋( b a s a 甜i a ，2 0 0 2 ) ；辐鳍亚纲硬鳞总目鲟形目鲟科俄国鲟4 c 枣陀胱r 删 妇瑚m 出口m 幽噼u 丑n i n ，2 0 0 2 ) ；鲱形总目鲱形目鲱科鲱属大西洋鲱a 印p 口 口旭，塘郴 ( k o m f e l dil ，1 9 8 2 ) ：鲑形目鲑亚目鲑科大麻哈鱼属大鳞大麻哈鱼o h c o 哟用如螂9 0 r 6 驸c 蛔 ( u u e l e t a l ，1 9 8 9 ) ；鲑属鲑勋砌ds 口肠r ( s t a i l l ，1 9 8 1 ；c r o s s ，1 9 8 3 ；v e r p o o r ，1 9 9 4 ) ； 鳟鱼砌砌。护“触l ( a 1 l e n d o 正f w ，1 9 8 0 ) ；山鳟s 口z 聊d 朋讹现p ，f ( a l l e n d o 正f w ，1 9 8 0 ) ； 红点鲑属溪红点鲑踟 堆，f 聍淞加n f 打懈船( s t o n e k i i l gm ，1 9 8 1 a ；u a o r i n e n ，1 9 8 4 ) ；鲤形总 目鲤科雅罗鱼亚科鱼类( s a k a i ，1 9 8 5 ) 闪鲼属鱼类( b u t h d g ，1 9 7 9 ) ；鲤鱼。矿加螂c r p f o ( e n g e l ，1 9 7 3 ) ；鲫属银鲫o ，幽s f 淞口“阳船6 p 肋( y 锄g ，l i n ，2 0 0 1 ) ；另外还有鲶鱼 c f 胛缸珂曰船州缸( n a l 【o m ，2 0 0 2 ) 等。鳊亚科乌鲂属乌鲂西佣口6 阳，婀s p i n o z a ，2 0 0 2 ) ； 鲇形目鲇科鲇属鱼类( n a k o m u ，2 0 0 2 ) ；甲鲇科鱼类( z a 阻d z k i ，2 0 0 0 ) ；银汉鱼总目 鲻形日鲻科鲻砌珂咖，淞硪印胁n 螂( d a w l e y ，1 9 9 9 ) ；底鲻f p 耙m c f f f 螂( d a w l e y ，1 9 9 9 ： g m d y j m ，1 9 9 0 ) ；美帆鲻p d 8 c f 妇j 1 d ，埘d s 口( b a l s a n o j s ，1 9 7 2 ) ；鲑鲈总目鳕形目鳕亚 目鳕科鳕g 础捃小口c 阳c 印而口z 淞( l u s h i e ，1 9 7 0 ；m o r k ，1 9 9 9 ) ：大西洋鳕国挑聊。砌堋 ( m o r k ，1 9 8 5 ) ；黑鳕挑m d 砌船( l u s h i e ，1 9 7 0 ) ；黑斑鳕 如肠订d g 阳m m 瑚口曙 睇”螂 ( g r a d y ，1 9 9 9 ) ；鲈形总目鲻形目鲻科台湾鲻胁曙f ，此如p 胁c 印砌f 螂( l e e s c ，1 9 9 5 ) ； 鲈形目鲈亚目箱科花鲈三n f e d 肠6 螂，印d n f c 淞( y o k o g a w a k ，1 9 9 7 ) ；鲈科尖嘴鲈口舰 前言 阳f c 胛咖r ( s h a l ( 1 e e ，1 9 8 5 ) ；美国大咀鲈鱼 旃c r 印阳r 淞s 口砌d 娩s ( e s p i n o z a ，2 0 0 2 ) ；觞科竹 荚鱼属m 咖耵础，圆修属d p 唧蛔一姗，凹肩鳝属& 砌细鳝属& 胁n ，f p s 鱼类( k j j i m a ，1 9 9 8 ) ； 石首鱼科鱼类( m e n e z e s l 9 8 8 ，1 9 9 0 ) ，白姑鱼属白姑鱼一留l 阳m 淞甜伊胛细n 盯( l e d r ，1 9 9 8 ) ； 丽鱼科鱼类k o m f e l d ( 1 9 7 9 ) ；笛鲷科澳大利亚笛鲷上硎册埘m 口肠6 口r 缸“( e l l i o t t ，1 9 9 6 ) ； 鲷科真鲷姆s d m 淞m 咖r ( i g u c h i ，1 9 9 0 ：s u g 锄a ，1 9 8 8 ) ；黑鲷彳叩行，矗d p 昭，淞 s c 厅如妒f f ( s u g 锄a ，1 9 8 9 ；t 姐i g i l c l l i ，1 9 8 3 ) ；雀鲷& 昭耙s 细c f d 砌淞( s b a k l e e ，1 9 8 4 ；f a u v e l o t ， 2 0 0 2 ) ，地中海囊重牙鲷d 枷加砌曙螂( p 1 a n e s s ，2 0 0 2 ) ：蝴蝶鱼科和雀鲷科7 种鱼类 ( f a u v e l o t ，2 0 0 2 ) ；嘏虎鱼亚目暇虎鱼科嘏虎鱼亚科普氏服虎鱼r f 聆d g d 6 f 淞 砌f ”p 淞( s 1 1 i m i z u ，1 9 9 3 ) ；鲭亚目鲭科黄鳍金枪鱼h 咖加sa m a c a 心s ( w b r d r q ，1 9 9 7 ) 鲇形目鲇亚目鼬科无各平鲇6 珊即sf ，据硎括( y o k o ga _ w a k ，1 9 8 9 ) ；蝶形目蝶科鱼类 ( k 印l a l l l ，1 9 6 0 ) ；木叶蝶p 拓“m 竹耙向，矗声m “n 岱( m a t s u o k a ，1 9 8 9 ) 等。 可以看出，国外学者对于海水鱼类的研究比较深入，涉及的范围也较广，是国内学者 所不能比拟的。相比之下，国外学者对淡水鱼类的研究较少，主要是一些鲤科鱼类，充分 利用我国丰富的淡水渔业资源，运用同工酶手段研究鱼类生理生化，遗传变异，系统发育， 对于填补国际淡水鱼研究领域空白具有重要意义。 2 2 研究方法概况 同工酶研究方法主要有：聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e 凝胶电泳) ，水平淀粉凝胶电泳， 等电聚焦电泳和双向电泳等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳简单快捷，且分辨率较高，是同工酶研究的首选方法。早期研究 曾采取圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳，如周昂等研究的不同性别黄鳝及尹洪滨等研究的荷包红 鲤和德国镜鲤，即是应用此方法( 周昂等，1 9 9 4 ；尹洪滨等，1 9 9 5 ) 。但由于分辨率的问题， 近年来已基本被不连续垂直板电泳所取代。不连续聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳是采取的最 广泛的同工酶研究方法，据笔者粗略统计目前鱼类同工酶研究大约百分之八十以上采取此 方法分析。聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳是p a g e 凝胶电泳的改进形式，近年来也有应用，如 朱篮菲等应用此方法分另4 研究了鲫鱼和银鲫同工酶；邹桂伟等；曹伏君等；邓思平等；李 雅娟等也是应用的梯度凝胶电泳方法( 朱篮菲等，1 9 9 5 ，1 9 9 8 ；邹桂伟等，1 9 9 7 ；曹伏君 等，2 0 0 4 ：邓思平等，2 0 0 4 ) 。 水平淀粉凝胶电泳因其无毒高效，且能够切割，利于平行比对，应用也较多。如王可 玲等研究的真鲷、黑鲷、牙鲆、鲈鱼和小黄鱼等；吴力钊等研究的白鲢；马波等研究的翘 嘴红鱼白、山女鳟、哲罗鱼；王伟继等研究的真鲷野生群体；徐成等研究的暗纹东方纯： 前言 刘世禄等研究的美国红鱼；刘曼红等研究的石鲽等( 王可玲等，1 9 9 6 ；吴力钊等，1 9 9 7 ； 马波等2 0 0 0 ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ：王伟继等，2 0 0 0 ；徐成等，2 0 0 1 ；刘世禄等，2 0 0 2 ：刘曼红等， 2 0 0 2 ) 。但因其分辨率不及聚丙烯酰胺凝胶电泳，对活性较弱或组成复杂的同工酶( 如e s t 等) ，还需要聚丙烯酰胺凝胶电泳作补充( 王可玲等，1 9 9 6 ) 。 等电聚焦电泳和双向电泳因为步骤繁琐，造价昂贵，且电泳过程容易引起酶活性丧失， 应用较少。国内鱼类同工酶研究尚未见应用。 不同的电泳方法，由于其电泳支持物的种类、浓度、缓冲系统、电泳条件( 电压、电 流、时间等) 不同，可产生不同的电泳图谱，可能会得到不同的生化遗传分析结果。使用 何种电泳方法，标准只有一个，即尽可能地揭示同工酶的表达，清晰地反映同工酶的遗传 变异，使生化遗传分析能全面、正确地记录出编码同工酶的基因座位数，酶的多态性，等 位基因数等。 2 3 研究方向概况 2 3 1 同工酶表达的组织特异性分析 从理论上讲，同一生物的每一种组织的每一个细胞，对于某一种酶或蛋白质来讲，具 有相同的遗传表达潜能，但是这种潜能并不一定在生物的整个生命过程中、在所有的组织 和细胞中都能实现。即由于基因表达的时间和空间上的调控，使得生物基因产物的表达存 在着发育过程中的变化和细胞组织间的差异，同工酶在同一个体内组织间表型的差异是基 因表达空间调控的表现。同工酶表达的组织间差异可以分为三种类型：同工酶表达有无 的差异：即某种酶在有的组织中有表达，而有的组织中则不表达。同工酶表达强弱的差 异：即有些同工酶在生物体的不同组织中都有表达，但是酶的活性强弱有很大差异。同 工酶表达形式的差异。姜建国等( 姜建国等，1 9 9 7 ) 对青鱼不同组织同工酶的表达模式进行 了研究，结果显示，青鱼不同组织中。a n ( 淀粉酶) e s t ，i d h ( 异柠檬酸脱氢酶) ，l d h ，肋h ( 苹 果酸脱氢酶) ，m e ( 苹果酸酶) ，p o x ( 过氧化物酶) ，s 0 d ( 超氧化物歧化酶) ，g 6 p d h ( 葡萄糖 一6 一磷酸脱氢酶) 存在不同程度的组织特异性，g o t ( 谷草转氨酶) 无明显的组织差异。这与 特定组织的重要代谢途径有关，同工酶在专一的进化控制系统中承担重要作用。通过对草 鱼和鳙鱼不同组织同工酶表达的研究得到了类似的结果。网纹石斑鱼l 阴同工酶心肌的酶 带与背肌、肝的相反；脑、晶状体、性腺的l d h 带相似，但染色和细带位置有差异；肠、 脾、肾的l d h 带少，脑的l d h 带最多( 洪满贤等，1 9 9 6 ) 。暗纹东方纯的e s t ，m d h ，s o d 和 p o d 同工酶在各组织器官中表现出较大的一致性，有利于物种的鉴定；- a m y 和s d h ( 山梨 醇脱氢酶) 只在个别组织中有活性，可能与特定组织器官的形态发生与机能分化有关( 刘玲 7 前言 玲等，1 9 9 8 ) 。大口鲇和鲇鱼的e s t 和m d h 同工酶在4 种组织及血清中均能特异性的表达， 存在明显的组织和物种特异性( 李懋等，1 9 9 8 ) 。王可玲等( 1 9 9 6 ) 对山东、福建沿海的真 鲷、黑鲷、牙鲆、鲈鱼和小黄鱼5 种鱼的肌肉、眼睛、肝脏、心脏、鳍、鳃和肾脏7 种组 织的2 2 种同工酶进行了初步分析。结果表明，同工酶的活性在不同组织中差异很大，但 不同鱼类在同一组织中酶的活性则是类似的，即同工酶表达的种类特异性小而组织的特异 性大。王艺磊等( 2 0 0 0 ) 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳对厦门海区真鲷的1 0 种组织或器官进 行了1 0 种同工酶的电泳研究，并对各种酶的同工酶位点表达及酶谱表型进行了初步分析， 结果表明：l d h 、m d h 、i d h 、g d h 、a d h 、e s t 和p o x 存在不同程度的组织或器官特异性，王 金秋等( 2 0 0 1 ) 采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳，对松江鲈鱼的7 种组织进行了6 种同 工酶的电泳研究，并对各种酶的同工酶位点及酶谱表型进行了分析。结果表明，松江鲈鱼 的同工酶系统具有明显的组织特异性；与四大家鱼相比，松江鲈鱼同工酶谱表现为总体特 征简单化，这可能和松江鲈鱼濒危的现状有关；李明云等( 2 0 0 3 ) 对花鲈八种组织十种同 工酶研究表明，1 0 种同工酶在各个组织中的表达频率以肝脏最高，基因座位表达程度以肝 脏和肌肉两组织最全面。 2 3 2 细胞分化和个体发育研究中的应用 发育是指在一个稳定的遗传信息库中基因经过选择性地表达，由单细胞受精卵形成一 个复杂成体的过程，这种过程的主要特征是组织分化，由此产生多类细胞，每一类细胞又 有其特殊的功能和代谢性，从而使成年机体具有既分工又统一的整体功能。特异的基因表 达产生了成体组织特异的同工酶，且这类同工酶都是由单细胞阶段的一个前体酶产生的， 因此，在机体发育过程中显然会发生一系列复杂的同工酶变化。同工酶具有空间和时间特 异性，不同发育时期的同工酶具有显著的差异性。个体发育早期的同工酶检测能为鱼类的 发育生物学、幼体发育变态过程中的营养生理学和水产养殖技术提供一定的理论参考。在 个体发育过程中，酶谱变化也反映了细胞组成和生理代谢的变化，因此，同工酶的研究有 利于解释发育过程中某些阶段特有的代谢过程。同时，同工酶应用于发育上不仅因其最后 的组织分布是代谢分化的一项主要特征，而且还能在发育早期分辨易消逝的同工酶谱，从 而利于解释发育过程的这些阶段特有的代谢问题。f r a n k e l 和h a r t ( 1 9 8 1 ) 对鲤科鱼类研 究发现，鱼类胚胎发育早期是l 阴一b 4 占优势，肌肉细胞开始分化时，l 叫一a 4 也开始合成， 而肝细胞形态发生变化时，l d h - c 亚基开始合成，因而推测出肝细胞形态和功能分化可能 是鱼类l d h c 基因激活所必需的刺激因素。从这个研究可以看出，同工酶的谱带变化即亚 基的出现消失与动物胚胎发育过程有着很多的相关，很可能是内在基因调控机制起着关键 前言 的作用。青鱼胚胎发育过程中表达的时序，l d h b 基因在整个发育过程中都处于活动状态： 胚胎发育早期的l d h 同工酶谱与成熟卵的l d h a 。b 。、a 。b 和a ，三种同工酶在胚胎发育至出膜 前期后才出现( 张轩杰等，1 9 8 9 ) 。 吴力钊等将草鱼早期发育过程中同工酶分为三种类型( 1 ) 在未受精卵及早期发育过程 中一直存在，并常有较广泛的组织分布，l d h 一髓、l d h a b 3 ；( 2 ) 未受精卵及早期发育过程 中均不存在，一般仅分布于少数几种组织中，如a d h ( 醇脱氢酶) 、i d h ( 异柠檬酸脱氢酶) l d h b t ；( 3 ) 未受精卵及胚胎发育早期不存在，直到发育过程中某一特定时期才开始出现， 如l d h 九、c t 。团头鲂胚胎发育中同工酶也有类似情况，不同之处是团头鲂的g d h ( 葡萄糖 脱氢酶) 同工酶在整个胚胎发育过程中都有活性，但在其成体组织中无特异性分布( 吴力钊 等，1 9 8 7 ) 。滇池高背鲫体内a l p ( 碱性磷酸酶) 的出现与肝组织的分化以及功能的建立之间 表现出高度的同步性，表明此酶带的出现与新个体生命活力的加强，尤其与因摄食活动开 始后消化系统的肝、肠和胃等结构与功能的分化有关，是胚胎细胞核中相应基因开始表达 的结果。云南滇池高背鲫鱼胚胎发育从血液循环期起尤其到肝形成期，e s t ( 酯酶) 同工酶 增加了新酶