（作物遗传育种专业论文）黄萎病菌胁迫下棉花抗病相关基因的差异表达研究.pdf

摘要 臻裢黄萎瘸酿i c i l l i 戳l 谢l t ) 是蠢黄萎痍蘩( 阮，积露纽雕幽矗z 裙) 孳| 起懿缝篱柬瘸 害，在世界范围内广泛流行，目前尚未得到有效控制，选育和利用抗瘸品种是一种经 济、毒效竣防浚黄菱痍恁害懿臻藏。因建必须深入了黪媾花撬焚萎痰基霆滟表达规德 及棉花黄萎病与寄主的相互作用机制，为利用纂因工程平段培商抗黄菱病品种提供有 力的理论依据。 本研究乖j 髑强致病力菌系诱导陆地棉抗黄葵病品种冀棉2 0 号、陆地棉感黄萎病 品种邯2 0 8 和海岛棉抗黄萎病晶种p i m a 9 0 5 3 成激基因的表达，通过c 瑚q a a f l p 技 术簿选与撬瘸鞠关静差彝条带，馥获 葶每抗黄蒸病相关静候选藏嚣，扶雨为挠瘸育释 提供新的基因来源。从2 5 6 对引物中筛选出3 1 对差异憔较好的引物，利用3 l 对引物 莛舞选了8 2 条菠舅条繁，二次扩增获褥5 5 条扩溪条带，觚中选耩瞧受隆了1 5 条进 行测序。将克隧序号命名为耽蟓r e s p o n s eg e n ei n d u c e db y 舱，咖f ，m 卅如 ，f 口口) 。 对1 5 条序列的初步分板鲤下：与摈菇数摄库中毂垮列进赞同源性蛇较，发璎本 研究所褥c d n a 序列与棉花数据库中的基因同源性均很低，由此推测该c d n a 序列 是在黄攘病菌诱导表达下的新序列。与基因组文库中的序列遴褥同源性分析，发现 阮晤i o 建一个3 3 7 b p 的基因片羧，有3 1 8 个碱蘩与攉断的转运鬣自其有9 9 ( 3 1 8 ，3 1 9 ) 的同源性；阮喙2 8 是一个3 2 3 b p 的基因片段，柯2 4 3 个碱基与5 0 s 核糖体蛋白l 3 具 有9 1 2 4 3 经6 6 ) 豹霜溅性；醐7 是一拿3 e 5 油熬萋鞠片段，鸯钩个碱蓦与大弱转 菌的酪氨酸蛋白激酶e t k 有9 9 ( 9 9 9 9 ) 的同源性。阮垤3 3 是一个2 9 1 b p 的基因片段， 有1 7 4 令碱基与羰南莽豹网格结合蛋自瓣m r n a 寒列蒸鸯8 4 f 1 7 纠2 0 7 ) 黪露源蠖； 其余的藏异片段与已知的抗病麓因关系尚不明确，有待于迸步研究。 关键词：棉花；黄萎瘸；抗瘸性；c d n a a f l p s t u d i e so nt h ed i f f e r e n t i a le x p n s s i o no fr e s i s t a n c e 一心l a t e dg e n e s i n d u c e db y 惭f 配f 距“，咒砌 砌pi nc o t t o n m a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g g r a d u a t e ：x u a i lz h a o l i n g s u p e r v i s o r ：p r o z h a l l gg u i y i n p r o m az h i y i n g a b s t r a c t c o 怕nv e m c i l l i 啪讪l t ，ad i s e a s eo fc o t t o nc a u s e d b y 您历c 册“m 幽向f 船，i sak i n d o fw o r l d w i d es p r e a dd i s e a s e 也a ti sd i f f i c u l tt 0b ec o n t r o l l e di nc o n o np r o d u c t i o n d e v e l o p m e n to fc o t t o nr e s i s t a i l tc u l t i v a r sc a np r o v i d ea ne d l e c t i v ea i l de c o n o m i c a lm e t h o d f o rc o n t m l l i n gv e r t i c i l l i 啪、v i l t 1 1 1 e r e f o r e ，r e s e a r c h e sf o u s e do nd e 印l yu n d e r s t 锄d i n go f e x p r e s s i o nm l e sa b o mr e s i s t a n c eg e n ea t l dt h em 0 1 e c u l a rm e c h 肌i s ma b o u ti n t e r a c t i o n s b e t w e e n阮，盯c f ，“， 如 z f 口pa 工1 dt 1 1 eh o s tw o u l dd r o v i d et h e o r e t i c a lf b u n d a t i o nf b r d e v e l o p i n gr e s i s 协n tc u l t i v a r sw i t hg e n ee n g i n e e r i n g t h eo b j e c t i v e so fm er e s e a r c hw e r ea t t e m p t e dt oo b t a i nr e s i s t a n c e r e l a t e dc a n d i d a t e g e n e sf o mt i r e ec o t t o nc u l t i v a r si n d u c e db ys e v e r e v i r u l e n c es t r a i n so f 瞻r f f c 珊m 聊 d b z 妇8 ，w h i c hw o u l dp r o v i d en e wg e n er e s o u r c e sf o rc o t t o nr c s i s t a n c eb r e e d i n g t h e r e s e a r c hs e l e c t e d31f i m m2 5 6p r i m e rc o m b i n i z a t i o n s 。w h i c hf o u n do u t8 2d i f 托r e n t i a l d i s p l a y 丘a g m e n t s n l e r ew c r c5 5b a i l d sr e 锄p i i f i e d ，s e l e c t i n g15b a n d st 0c l o n ea n d s e q u e n c e t h ec l o n e sw c r er m m e d ( r e s p o n s eg e n ei n d u c e d b y 砌w c f 盯f “md 锄，f 口p ) t h ec d n ai nm es t u d ys h o w e dn od e t e c t a b l eh o m o l o g yt ot l l ek n o w nc o t t o nl l b r a r y ， s u g g e s t i n gt h a t 、v e r ep m b a b l yr e p r e s e n t 矗a g m e m so fn o v e lg e n e si n d u c e db y 瞻r 订c f f “m 幽 ，胁e n l e yw c r ec o m p a r c d t og e n o m el i b r a r i e s a 1 1 dt l l er e s u l t si n d i c a t e dt h a t 恸苫1 0w a s a3 3 7 b pg e n e 丘a g n l e n tt h a tw a s9 9 ( 318 ，3l9 ) i d e n t i c a lt op u t a t i v et r a i l s p o np r o t e i n 丹o m - 蚋和妇6 掣妣嘞_ 9 2 8w a sa3 2 3 b pg e n e 触g m e n tt h a tw a s9 1 ( 2 4 3 2 6 6 ) i d e 而c a jt o 5 0 sr i b o s o m a lp r o t e i nl 3 ；阮酗：酗7w a s9 9 i d e n t i c a lt op r o t e i nt ”o s i n ek i n a s ef r o me ，f ， a 1 1 di t 强sa3 0 5 b pg e n ef h g m e n t ；喇堙3 3w a sa2 9 l b p ，w h i c hw a s8 4 ( 1 7 4 2 0 7 ) i d e n t i c a l t op u t a t i v ec l a t h nb i n d i n gp r o t e i nf 如m4 ，口6 f d 咖扫腩口，蛔 口t h er e l a t i o n s h i po ft h e o m e r sa n dt h ei m o w nr e s i s t a t l tg e n e si su n c e n a i 氇a n di ti se x p e c t e dt or e s e a r c hi nt 1 1 e f i n u r e k e yw o r d s ：c o t t o n ；、，e n i c i l l i u mw i l t ；d i s e 明er c s i s t a i l c e ；c d n a a f l p a m o b d a c r d n t p e b e s t e d l 、a l b p c r x g a i r b m a p t e m e d a f l p o d 口6 0 o d 2 8 0 豫口 u t b e r n a d n a b i s 1 r i s 缩略词表 a m p i c 1 l i n b a s ed a i r a c r y l a m i d e d e o x y r b 0 肌c l e o s d et r i 曲o s p h a l e e t l l i d i u mb r o m i d e e x p r e s s e d 辩q u e n c e dt a g e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d l u r j s - b e 咖im e d i a p o i y m e r 船ec h a i nm t i o n 5 _ b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 一i n d 0 1 y - p d - g a l a c t o s i d e r o t a t i o nd e rm i n u t e a m m o n j u mp e r s u l f 耻e n ，n ，n ，n - t c t m m e t h y l e m y l e n e d i a i n i n e a m p l i f i e d 爵唱m e n tl e n 舒hp o i y m o r p h i s m a b s o r b a n c ea t2 6 0 n m a b s o r h 明c ea t2 8 0 n m 砌日珊凇凹“口f 把蚶d n ap o l y m e r a s e u n i t 丁一s b o r a c ea c i d e d l ab u 俄r r b o u c l e i ca c i d d e o x y r i b o s en u c l e i ca c d b i s a c r y l a m i d e t r i s h y d r o x y m e t h y j a m i n o m e t l l 黜 氨苄青霉素 碱基对 丙烯酰胺 脱氧核糖核营三磷酸 溴化乙锭 表达序列标签 乙二胺四乙酸 l u r i s - b e n a n i 培养基 聚合酶链式反应 5 - 澳一4 - 氯0 一吲哚- b - d - 、卜乳耱苷 转，分钟 过硫酸铵 四甲基乙二胺 扩增片段长度多态性 2 6 0 n m 处的吸光值 2 8 0 n m 处的吸光值 栖热水生菌d n a 聚合酶 ( 酶) 单位 t r “硼酸厄d t a 缓冲液 核糖核酸 脱氧核糖核酸 甲叉双丙烯酰胺 三羟甲基氨基甲烷 r 0 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭壅些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：灵拈怜签字日期：瑚，年月阳日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 堡盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭盔：些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 云抬伶新签名：弘 签字日期： 山6 年 i 月如日 签字日期：多一石年6 月阳日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 赞菱病越胁迫f 棉花抗病捅关基因的蔫异表达研究 l 亏l 言 撩花琵我謦静爨簧经济 筝餐，蓑生产蔽魏对蓍民经济懿发震其囊耋要煞影靖。德 是我国棉花缴产一童受枯萎瘸、黄羲瘸的制约。目前槠萎病基本上得到了有效的控制， 嚣黄蒸痰爨爨糠花生长过疆中最其蠢毁灭魏数疯害之一j 。焚姆点是分蠢广、恁害璧、 寄主范围广、传播途径多、稃活时涮久，是种极难防治的土传病窖，被称为棉花的 瘿瘦1 23 1 。1 9 9 3 年黄夔瘸爆发成灾，耀调查估测，全国黄萎瘸发病霹积达2 7 0 余万公 顷，猿失皮稀l 亿公斤巴1 9 9 5 年我国北方棉田黄簧病大发生，损失度棉7 5 0 0 万公 斤左右【2 l ；2 0 0 2 年发病面积融超过3 0 0 万公顷【3 】，2 0 0 3 年北方棉区棉花普遍减产，篡 牵圭簧漾因之一是黄萎瘸懿严重燕菘。如稳鸯效陵治稀花黄螫瘸是我鬻稿花生产土急 需勰决的问鼷之一。培育和推广抗瘸品种是种经济、安全、有效的措施，而培育抗 痣晶转慕关键是深入攥谬魏焚萎疯瓣凝翻弱孵寻找亵撬荑萎瘸款基嚣。瑟奏撬携懿改 良都依赖于不同基因的正确组合和裁达，克隆、分离和研究锫种具肖重要生物学功能 的基骝和基因群刚为泼良作物品葶申掇供物质蒸础帮璐论依据 s 】。阐明攘芘抗黄萎瘸戆 分予机制以及抗瘸栩关基因的结梅、勘能和袭达对利用抗病藻因进行转基因育种其裔 重要的指导意义，不断加强棉花抗黄蒌病机理的研究和抗黄蒺病品神的选育，开展以 棒花抗黄萎瘸为主要内容的棉花功能基因缀攀静醑究，其有黧要靛理论意义秘经济意 义。 撬痍萎戮豹获褥蹙选寅摭瘸品秘豹重要慕疆，嚣i 透过分子奎甥擎手段懑经交爨 的植物抗病潦因大概有3 9 个以上，篡中抗病原真菌的大概有2 0 多个，如拟南芥抗自 粉瘸蒸因即轷露嘲，蓊楚抗旗萎瘸基邂琵哆毫粱挽蓬逶锈病妒瓣c 跏妞s o 麟0 基因 置p ，j ，在海岛棉上已经克隆了n b s - l r r 类抗病基因。敬常规育种上，黼内外棉 花育种者一囊重视抗源的筛i 糍和创造。1 9 8 3 。1 9 8 6 年李成葆簿【6 j 对9 l l 份陆地棒资源 进行了抗黄萎瘸鉴定，筛选了撬性较好静一拯抗( 耐) 瘸品萃辛。k v s 矗n v a s i n 鏊定了1 2 6 个海岛棉品种的抗性，结果照示表现附瘸和抗痫的占8 5 ；a a b e l i 认为四倍体棉 花仅海蠢棒拣薅往较强，撬谯较强静骞p m a 祷、秘簧榛、s e a & l ( 海岛拣等秘。懿 苏联育种专承利用墨蹰哥半野生棉与陆地棉赭种司4 7 2 7 杂交育成了著名的塔什干1 、 2 、3 号抗黄葵痍最嵇。无论是透过露缀方法罨找挠滚，还楚通过分予生物学手莰竟 隆抗瘸基因都已经取得了一您的进展，对于开展棉花抗黄萎瘸育种工作具有麓要的指 导意义。 植物在岛瘸原秘拘长期协同迸优过程中获得了一系列簧杂的防御机制傈护自己， 抗性寝现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理生化抗 洼”q 。在稀藐霾有豹缀织结擒抗毪方疆，缀多研究措国黄萎瘸抗淫不霜静鑫种英缢绞 结构存在着麓异1 1 01 1 】。姚焕章【幢1 在解剖棉花抗、感黼种的椴茎切片时发现抗病品种 摹整鬻积豹缨怒鼗比黪疯燕秘豹多l 倍以上，磅究认蔻缨艟数赘域翔整缝织缝麴紧 密，跚胞间隙减少，从而提高了棉株的机械抗病性能。进而阻止黄赘病菌的侵入和在 植株内部的羹延e 有磷究表明抗痍晶耱的导管腔和本震纤维黢的童经都小予燎瘸品种 ”“。诱导组织结构抗性表现为当棉花檬株遭到黄萎病菌的侵袭后，首先表现的傈护惶 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 反应是表皮的本质化和内部组织的木栓化，在一定条件下，这种反应可以限制一部分 病原菌的继续入侵，但不能够彻底限制病原菌的扩展。有时植物的内部组织导管薄壁 细胞的增生，产生的木栓层使一部分导管发生阻塞，以阻止病菌的进一步扩展，水分 则通过健康部分或新形成的术质部进行输导；导管间细胞壁上堆积类似木质素的物质 以阻止入侵的菌丝，或堆积在菌丝周围形成的木质紊将菌丝包围；在导管内果胶质迅 速封闭导管或把纹孔膜扩大形成侵填体，以阻止分生孢子在木质部扩散u 。“l 。李正 理等在棉花黄萎病叶的解剖研究中发现在某些导管中存在胶状物质或侵填体【i 。 b e c k m a n 等【l 的研究证明抗病品种胼胝质的沉积明显高于感病品种。 棉花受到黄萎病菌侵染后产生的一系列生理生化物质对于抵御病原菌侵害或降 低病原菌侵染造成的损伤起着重要的作用。植保索就是当植株受到病害侵袭后诱导产 生的具有抑菌作用的小分子化合物，它的合成抑制了由真菌产生的水解酶的分泌和合 成，结果使得抗病品种组织中的果胶酶、纤维索酶等一些酶的浓度低于感病品种组织 中这些酶的浓度【l6 l ”。d a a y f 等用大丽轮枝菌落叶型强毒菌株诱导陆地棉和海岛棉 材料时，根系的早期反应主要表现为胼胝质和纤维素在内的多糖物质的积累，从而加 固细胞壁形成物理屏障，同时在维管组织的薄壁细胞中积累萜类化合物和酚类物质， 从而对这些薄壁细胞进行超结构修饰。单宁是有效的蛋白质变性剂，具有酶抑制剂、 抗孢荆和温和的抗菌素作用。b a i l a e v i ”j 分析了对黄萎病菌具不同抗性的品种的单宁含 量，结果表明抗病品种比感病品种单宁含量高。吕会殿【2 0 1 研究表明不仅抗病品种的单 宁含量高于感病品种，且抗病品种随黄病情发展单宁含量也增加，抗病海岛棉品种受 侵染后的单宁的形成比陆地棉快且浓度也大。一些研究证明抗病性与过氧化物酶 ( p o x ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 活性有关，如抗病品种在受到病原菌侵染后过氧化物 酶、超氧化物歧化酶活性提高 2 1 2 6 1 i 朱荷琴【2 7 l 等人研究表明过氧化物酶与棉花品种 的抗病性密切相关，推测耐病品种过氧化物酶活性的提高促进了细胞壁的合成，从而 产生抗病作用；吴蔼民等脚j 报道在花铃期抗病品种的s o d 同工酶比感病品种活性强， 并且接菌棉株较不接菌棉株增加一条s o d 同工酶谱带。马峙英等【2 9 1 、仁爱霞等 3 0 1 都 发现了与黄萎病抗性相关的同工酶谱带。裴炎等【3 ”、夏正俊等 1 5 】、汪红等2 习的研究 表明酯酶与抗病性有关。棉花抗黄萎病的机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众 多，因此不断深入研究这些抗病反应产物在基因表达水平上的规律，对于进一步深入 了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗性具有重要意义。 目静利用基因表达技术研究黄萎病菌诱导下棉花抗病相关基因的表达已经取得 了一些迸展。d u b e r y 等【3 2 】报道棉花的苯丙氨酸裂解酶受大丽轮枝毒素诱导表达。 p l e l d l 锄o v a 等h 副研究发现在黄萎病菌潜伏期m r n a 聚合酶表达量高，感染之后只有 部分m 砌q a 存在，随着内部症状的出现m r n a 聚合酶活性降低。h i l l 等【3 4 】利用棉花 黄萎病菌感染后的陆地棉s i c a l a v - l 根部组织c d n a 文库，搜索得到了一些棉花抗病 反应中的新基因如1 4 - 3 - 3 蛋白及p r 蛋白。c h e n 等3 6 】从黄萎病菌诱导亚洲棉悬浮 细胞中分离出2 ( + ) - 6 - 杜松烯合成酶基因。j a m e s 等【3 7 l 报道棉苗受水杨酸诱导出的多聚 葡萄糖醛酸酶抑制蛋白( p g i p ) ，可以抑制大丽轮枝菌多聚半乳糖醛酸酶的活性。l u o 等1 克隆和鉴定了细胞色素p 4 5 0 单氧化酶，属于c y p 7 0 6 家族定为c y p 7 0 6 8 1 ，受 黄萎病攘胁迫f 拣花抗瘸稳关基蹰熬差异表遮疆究 大丽轮枝菌激发予诱导。l i u 等 3 9 j 用黄萎瘸黼激发予处理棉花悬浮培养细胞，研究阐 述了法昵二磷酸合成酶及傍半旗环他酶的表达摸式。髓人的研究结浆为更力辍深入的了 解黄萎病菌诱导下糯花抗瘸相关萋豳的表达规律提供了线索。 近年来，研究熬困表达的常见技术有抑制差减杂交技术( s s h ) 【4 0 】、差异最示技术 固d 艇二p e 釉秘”、d n a 芯片援术辫 、袭达事魏标签( 嚣s t ) l 积、a f l p 褥生静e d n 匙a f o p 技术似4 】及蛋白质双向电泳技术【4 5 】等。s s h 技术假阳性率低，但有可能检测不到低丰 凄袭达基嚣熬c d n a 。d n a 芯冀援寒在檀甥获遂、人类疾薅渗羝等方嚣取褥7 缓大 进展。但对予基因缀信息的依赖、澈商的成本等缺点使得该技术只程少数物种有较为 深入躲研究。d d 肼p e r 技零存在“馁强憾”离、试验结果霪复牲憨等缺点。b 3 c h e m 等将a f l p 技术应用于m r n a 表达羞异分析，发展了一种m r n a 指纹图谱技术，邵 c d n a a f l p 技术，该技术结合了r t _ p c r 和a f l p 技术，w 用于m r n a 样本闽基嗣 不鹂表达系统院较，可良分离大鲎特异表达的基霹。d e l l 蔽麓狲l 将c d n a a f l p 技笨 用于研究植物与病暇物相互作用的关系，并且试图阐明植物与病原物相互作用过程中 基嚣袭这鹣交纯憝势。积岔47 在爨究缨蘩戆染嚣斡鹰圭对发瑷，穗麓d e 3 0 羽诱嚣 植物后，在3 0 6 0 m i n 时第一次检测剿棚酾m j 基因的表达产物，熊表达水平持续上 舞，轰对藏4 个，j 、蛙鹄萋秀究发瑰，2 4 妇蠡瓣嘏足护剔基嚣淡达拳警最高，是憩可见 c d n a - a f l p 技术可以发现特定目标基因在不同时间点的表达交化趋势，熊准确的艇 殃基因片段阅表达爨的差异。在植物受侵絷诱导表达研究中，m 等【4 8 l 农研究热带 翠稻抗镭分子税理鞲尊通过c 黼a a f 己p 技术筛选郅3 4 个铝诱导的夔拜片段：d 喃o s 酬 在研究松树水分胁迪下筛选融差异袭达基因。张桂荫【5 j 利用c d n a ，a f l p 技术从海岛 穆摭薅鑫释p i m 薛0 5 3 串簿逡了与撬黄萎瘸穗关熬受锩凝纂素激酶藏异片段。吴敏惫 等利用c d n a a f l p 技术研究玉米发育过程中发现了亲本与杂交种之间的袭达差异， 毅及莲期与雄穗发努越熬表达差勇 羽。在撼藐蛩 究方錾，馕磊【5 ”程趋e d n a - a 戏p 技术分析棉花雄性不育花粉发育相关基因的表达差异，发现不育和w 育花粉 c d n a a f l p 的谱带在单核期差异大予减数分裂期，同时发现花粉发育相关基因表达 其膏时空性，并置回收了6 4 条差暑c d n a 片段。肖月华闻从棉花胚珠的c d n a a f l p 片段中选取了一个与类拟南芥l r r 抗病蛋白( l r 鼽r l ) 序别相似的片段，证明棉花 r r - r 基戮爨有缀成鼙表达特点；在院鞍蠢纤维籁殊与晃纤维突炎俸瑟珠在纾维怒 始斓的基因寝达，得到3 2 个差异片段在有纤维脓珠中特异表达。上述研究表明 国k a a f l p 技寒霹叛广泛疲覆子攘镌生长发寅过稔中或者逆境黪邃下基嚣虢分离芝 表达特性的研究。 本磺究零j 其3 棉筏黄萎瘸穗豫予懋浮渡接糖海岛糨抗病最秘p 洳韪9 0 5 3 、结迭掺摅 病品种冀棉2 0 号和陆地棉躲病品种邯2 0 8 ，以相应的不同时段的不接种黄婺病菌的 棉菌为对照，采用c 嬲a a f l p 技术筛选黄夔病菌诱导下棉花抗痛檑关基因的差异袭 达带。逶逶鞲毂特舅憔带、尧隆著遂彳亍序列分轿，为分析缔藏在黄螫病菌胁迨下抗赘 萎瘸相关基因的表达规律，阐明棉税抗黄萎瘸的分予生物学机制提供依据，为进一步 竞隆稳芯菝筵菱瘸稳关基嚣进行撼蕊基霆王凝弯耱瓣供分予依撵。 河j b 农业入学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 供试材料 2 1 1 供试棉花品种 2 材料与方法 p i m a 9 0 5 3 、冀棉2 0 号和邯2 0 8 。p i m a 9 0 5 3 是海岛棉抗黄萎病品种，冀棉2 0 号 是陆地棉抗黄萎病品种，邯2 0 8 是陆地棉感黄萎病品种。这些品种由河北农业大学棉 花遗传育种研究室提供，并且利用这些品种进行了棉花抗黄萎病遗传、棉花黄萎病菌 致病力分化等多方面的研究【5 3 。5 ”。 2 1 2 供试菌系 由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。该菌系分离自p i m a 9 0 5 3 ，经鉴定为 强致病力菌系。 2 2 试验方法 2 2 1 棉苗种植 将p i m a 9 0 5 3 、冀棉2 0 号和邯2 0 8 的种子硫酸脱绒以消除棉花种子外部带菌， 室温浸种8 h ，在2 5 下催芽1 2 h 后，选择发芽整齐一致的种子播于装有蛭石的营养 钵中，在生长室内( 昼温2 5 2 6 ，夜温2 0 2 2 ) 培养，用空气加湿器调控湿度，定 期浇h o a g l a z l d 营养液和水。 2 - 2 2 病菌培养与接种方法 ( 1 ) 病菌培养：将冷藏保存的单孢菌系转移至p d a 平面培养基中，于2 5 培养 箱中培养1 0 d ，然后将菌落打成合适大小的菌饼，将菌饼接种于c z a p e a k 培养液中， 2 5 条件下振荡( 1 1 0 “m i n ) 培养1 0 d 。 ( 2 ) 接种方法：在棉苗长至一片真叶展开时接种棉花黄萎病菌孢子悬浮液，将菌 液用纱布过滤，在显微镜下统计滤液孢子数，用无菌水配制成浓度为o 9 4 1 0 7 l 1 0 7 个孢子m l 的孢子悬浮液，现用现配。将孢子悬浮液从底部注入营养钵中，每钵接种 1 5 m l 。 接种后棉苗在温度2 5 2 6 生长室内培养。 黄萎病菌胁迫r 棉花抗病相关基因的差异表达研究 2 2 3r n a 穗取所用试剂 掰j l 索必为霄代嚣r n a p l 鞠t 褥联试赉l 焱提取栋蓰摄部憨r n a 。 2 。2 ，4r n a 提取前的准备王 乍 ( 1 ) 容器的处理：将1 m ld e p c 加入到1 0 0 0 f n l 去离子水中，用磁力棒充分搅拌混 匀，琵稍成0 ，1 d 嚣p c 求。将研钵、棒和药筵蠢l 纛瘩滔糖羚烧，离心管、枪头、漆 液瓶均用适激配好的0 1 d e p c 水充分浸泡，容器臼用封口膜封好，处理过夜后商 垂灭蘩5 0 搬镳冬雳。 ( 2 ) 试剂的配制：r n a 提取过程中所需试剂一律用灭菌的o 1 d e p c 水配制。 薮的分辑纯试裁基本上无r n 曩s 。污染，可煮接使月。r n a 梭测所髑电泳缓冲渡的酝 制使用o 1 d e p c 永。 2 ，2 。5 勰a 攫取豹攥 睾步骤 ( 1 ) 先姆灼烧的鹾钵用波氮充分预冷，称取o + l g 罔o 。1 d e p c 水洗好的棉花根， 在液氮中充分研磨；将粉末转入经道处理的1 5 m l 离心管中，然后加入8 0 0 l 提取试 剂，充分混钧，室溆放置5 m i n ( 乎放离心管，使表面积最大) ，1 2 ，0 0 0 r p m 室温下离一心 4 m i n 。 ( 2 ) 将上清波转入新的无r n a s e 离心管中，加1 6 0 山5 m n a c i ，温和混匀后，加 入4 8 0 | l 氯穆，上下簸翻德匀，室瀣下静萋数分镑，4 1 2 ，0 衡翠m 褰心1 5 m i n ，取主 清转入新的无r n a s e 离心管中。 ( 3 ) 加入与上清波等体积粒异嚣辫，漫匀后室滠静鬟l o 蜮a ，4 1 2 ，0 0 0 凇n 离心 1 5 m i n 。 ( 4 ) 倒撼液相( 淀意别将沉淀的r n a 倒出) ，加入1 m l7 5 乙醇清洗，小心倒出7 5 乙醇，放予麓净工作台短暂干燥，翻入适煮静o 1 d e p e 承溶解，一7 0 保存备用。 2 2 。6 总r n a 粒璩黢糖电泳检测 r n a 电泳所用呶泳槽、胶扳、胶槽、撼子均用o 1 d e p c 水浸泡过夜，备用。 配制1 1 琼脂糖凝胶，当胶冷却至6 5 ，擞入适量e b ，潼匀后灌胶。待胶凝固震， 取1 p l r n a ，加入2 肛l 用o 1 d e p c 水配制的溴酚蓝，点样。电压1 0 0 v ，电泳约2 0 m i n 。 毫泳螽在紫韩嚣下躐察。 2 。2 7d n a s e 处理去除基因组d n a 污染 反应体系如下： 塑! 壅些盔堂堡主堂垡! 望些! 鲨奎 r n ai nr n a s e - f r e eh 2 04 p g r 0 1r n a s e f r c ed n a s e1 0 r e a c t i o nb u f l h1 址l r q 1r n a s e f r e ed n a s e 4 1 n u c l e 觞e 。f r e eh 2 0 1 0 l 温和混匀上述试剂，在3 7 下温育3 0 m i n ，加入1 斗 r q ld n 酷es t o ps o i 砸o n 终 止反应，最后在6 5 下l o m i n 使d n a s e 失活。 2 3 双链c d n a 的合成 c d n a 合成药品均购自大连宝生物k a r 丑) 生物工程有限公司，各种所用一次性 塑料制品在使用前均高压灭菌处理。 2 3 1c d n a 第一链的合成 在o 5 m l 离心管中加入： r n a o l i g o ( d t ) 1 8 ( 5 0 n g p 1 ) 6 5 ，变性1 0 m i n ， 迅速放在冰上，然后再加入： r n a s ei i l h i b i t o 趔0 u p 1 ) a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 5 u ，“1 ) 5 a m vb u 航r 2 5 m md n t p s r n a s e - f c eh 2 0 4 2 下保温1 h 2 3 1 2c d n a 第二链的合成 在o 5 m l 离心管中加入下列试剂： 第一链反应产物 d n ap o l m e r a s ei 1 0 d n a p o l v m e r a s eib u f f h t 4d n al i g 髂e ( 3 5 0 u m l ) 1 0 t 4d n al i g a s eb u f r e r r n a s eh ( 6 0 u 1 ) 5 h y l ) r i dr n ad e 星骘n e r a t i o nb u f r e r 2 5 m md n t p s 6 2 g 2 5 u i 1 u l 2 u l 5 u l 2 u l 7 u l 2 0 u l 5 u l 6 l l l 2l l l 6 u l 1 u l 1 2 u l 1 u l 黄萎病菌胁迫f 棉拢抗病相必基因的靛异表达研究 r n 叠s e - f b eh 2 0 1 6 下保温2 h 2 3 3c d n a 纯化 7 u l ( 1 ) 将终止反应产物中加入等量的瀚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 濑匀； ( 2 ) l o ，0 0 0 零m 离一心3 0 m i n ，取上滂； ( 3 ) 用氯仿：异戊簿( 2 4 ：1 ) 秀抽擒一次，l o ，0 0 0 f p m 离心3 0 m i n ，瑕上清； ( 4 ) 用2 倍预冷的无水乙醇沉淀1 h ，1 0 ，o o o r p m 离心1 0 m i n ，弃上清； ( 5 ) 蔫无承乙醇渖洗2 次，箴子；嬲入l o 矗0 拜l 琵溶解。 2 。4c 转n a - a f l p a f l p 体累中的鸵d 鞑和越烈购自n e w e n 誊a n d b i o l a b s 公司，k d l n a l i g a s e 购 皂p r o m e 9 8 公司，所用的弓l 物、接燕由上海生工生物工程寄限公司合成，7 砸d n a p o l y m e r a s e 和d n t p s 购自大避宝生物( t a k a r a ) 生物工程有限公司。 ( i ) 酶切、连接体系 c d n a ( 5 髓痨3 o 拉l n e bb u 船r 2 4 o l l l b s a o 。4 m z 活d 3 o u 胁g i3 o u 1 0 m m 斛p1 8 扯l t 4d n a l i g a s e ( 3 u 1 1 )0 5 扯l & d n al i g a s eb 穗f 蠢 4 0 釜l 缸e ia d a p t e r ( 5 0 p m o i ，“1 ) 1 0 p l 鼢。越醛撵 5 辨o l 船l l 国塾l 谶后用d d h 2 0 补足至4 0 “l 3 7 下酶切、连接过夜，然愿将产物笼子6 5 变性l o m 洫，以馊连接熬期限制性内切 酶失去活性，荐用o 1 t e ( p 8 o ) 将滚接产物稀释2 0 倍进行预扩增。 ( 2 ) 鬏扩增褡繁 取5 h l 连接稀释后的嬲峪样晶，加入1 5 “l 如下混合液： l o x p c rb u 接禽m 矿+ ) 2 o 耻l 2 5 m md n t p s 1 6 u 1 c 辩lp r l 致e r ( m o o ，5 吲壮l 0 6 薛l 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 e c d r jp r i m 匝e o o ，5 0 n 曲 o 6 p l 7 的d n ap o l y m e r a s e ( 5 u “1 ) o 1 肛l d d h 2 01 0 1 肛l 混合后，向每管中加入1 5 u l 矿物油，按如下程序进行p c r 扩增： 9 5 2 m i n 9 5 3 0 s ，5 6 3 0 s ，7 2 1 m i n3 0 个循环 7 2 1 0 m i n ，1 0 保温 预扩增结束后取5 m 产物用o 8 的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果。另取5 “l 预 扩增产物加入9 5 “lo 1 疆 ( p h 8 o ) 稀释2 0 倍进行选择性扩增。其余产物于一2 0 下保 存备用。 ( 3 ) 选择性扩增体系 取5 山稀释的预扩增产物，加入l5 “l 如下反应液： l o p c rb u 敛“含m r + ) 2 o 一 2 5 m m ( i n t p s1 8 u l 勋gd n ap o l y m e r 私e ( 5 l p 1 ) o 15 p l 妇p ip r i m e r ( 5 0 n g 1 ) 0 8 “1 配d r ip r i m e r ( 5 0 n g p 1 ) o 8 肛l d d h 2 09 4 5 p l 混合后，向每管中加入1 5 u l 矿物油。按如下程序进行p c r 扩增： 9 5 2 m i n 9 5 5 0 s ， 6 5 ( 每循环降低0 7 ) 4 0 s ， 7 2 1 m i n 1 3 个循环 9 5 5 0 s ，5 6 4 0 s ， 7 2 1 m i n 3 1 个循环 7 2 l o m i n ，l o 保温 扩增后的样品与1 0 p ll o a d i n gb u 艉r 混合，9 5 变性1 0 m i n ，立即转移至冰浴冷却 用于电泳。 ( 4 ) 聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳 玻璃板的准备： 用洗涤灵将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净。待玻璃板干燥后，用餐巾纸 蘸9 5 酒精擦净“凹板”和“平板”。待玻璃板干燥后，在“凹板”上涂2 r e p e ls i l a n e ， 在“平板”上涂0 5 b i n d i n gs i l a l l e 。为防止两块玻璃板互相污染，待两块板彻底干 燥后再进行组装和灌胶。 凝胶的配制： 取5 0 m l 的6 p a 、2 5 0 肛l 的l o 过硫酸铵和5 0 u ln m e d 三种溶液轻轻混合。 灌胶： 苎茎堕堕堕垫! 塑垄垫塑塑茎董里墼茎墨室垄塑壅 把胶沿凹板上沿缓缓灌入，并不断拍打液面，以使胶均匀而不产生气泡。灌完胶 后将梳子平面倒插入两块板之间，胶至少聚合2 h ，待胶凝聚后拔掉梳子。 电泳： a 电极缓冲液：上槽使用l t b e 缓冲液，下槽使用含有n a a c 的l t b e 缓冲液。 上槽的缓冲液液面应没过样品点样孔。 b 预电泳：8 0 w 恒功率电泳3 0 m i n 。 c 用滴管吹洗点样孔，除去碎胶，然后正向插入梳子，让齿尖刚接触胶面。 d 每孔加入约8 o “1 变性的样品( 加样要迅速，以防加样过久样品发生扩散) 。 e 上样完毕后，8 0 w 恒功率电泳2 h 左右，至第一条l o a d i n gb u 腩r 泳带到胶板的另 一前沿为止。 f 电泳结束后，小心卸下胶板，并轻轻将两板分开，胶将贴于涂有b i n d i n gs i l a n e 的 平板匕。 ( 5 ) 电泳胶染色程序 脱色：在大小合适的塑料盒中倒入新配制的1 0 的乙醇溶液，放入胶板，然后将塑料 盒置于摇床上，轻摇至指示剂带纹消失为止( 约2 0 一3 0 m i n ) 。 冲洗：用蒸馏水冲洗胶板2 次，每次5 m i n 。 染色：将冲洗后的胶板放入硝酸银染色液，轻摇1 2 m i n 。 水洗：用蒸馏水冲洗染色后的胶板，不超过5 s 。 显影：将水洗后的胶板迅速转移至显影液中，轻摇至胶显出清晰的带为止。 定影：用1 0 的碳酸钠溶液终止反应，约5 m i n 。 用蒸馏水冲洗2 次，每次2 m i n 。 胶板于室温下自然干燥，即可用于结果统计。 2 5 差异片段的回收及二次p c r 扩增 二次扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成，勋qd n a p o l y m e r a s e 和d n t p s 购自大连宝生物生物工程有限公司。 通过三次重复比较试验，对可重复出现的差异片段进行回收和二次p c r 扩增。 ( 1 ) 差异片段回收 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶板，从聚丙烯酰胺胶面上用消过毒的手术刀片小心 切下分离出来的差异条带，分别装入灭过菌的0 5 m l 离心管中，编号记录。每管中加 入5 0 p 1d d h 2 0 ，1 0 0 煮沸l o m i n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，吸取上清2 斗l 作为模板进行 二次p c r 扩增。 ( 2 ) 二次p c r 扩增 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 采用与模板相同的引物组合进行二次p c r 扩增。 在o 2 m l 离心管中加入以下试剂： 回收产物 朋j p ip r i m e r ( 5 0 n 1 ) 屁d r jp r i 眦r ( 5 0 n u 1 ) 2 5 m md n t p s 聊d n ap o l y m e r a s e ( 5 u i ) 1 0 x p c rb u 肫“含m 9 2 + ) d d h 2 0 按下列程序进行扩增： 9 4 5 m i n ： 2 0 u l 1 o l l l 1 o u l 1 6 u 1 o 2 u l 2 0 u 1 1 2 2 u l 9 4 3 0 s r5 5 2 m i n ， 7 2 3 0 s 3 0 个循环； 7 2 1 0 m i n ，1 0 保温 取4 p l 二次p c r 产物在0 8 琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外灯下观察。 2 6 二次p c r 产物的纯化 在1 5 m l 离心管中加入二次p c r 产物，然后加入l 1 0 体积的3 m n a a c ，再加入 两倍体积冷的无水乙醇，上下颠倒均匀，一2 0 静黉3 0 m i n 以上；1 2 ，o o o r p m 离心 1 0 m i n ，弃上清；用7 0 乙醇洗1 2 次，1 2 ，o o o r p m 离心l o r n j n ；弃上清，沉淀重新溶 于2 0 p id d h 2 0 中。一2 0 保存备用。 2 7 差异片段的克隆 利用北京天为时代的p g m tp c r 产物克隆试剂盒克隆差异片段。 ( 1 ) 纯化后的p c r 扩增产物与p g m t v e c t o r 连接 反应体系如下： 二次p c